第三节单克隆丙种球蛋白病的检测方法
http://www.100md.com
《免疫学和免疫学检验》
单克隆丙种球蛋白病的实验室诊断主要依靠血液学和免疫学手段。其中免疫学检测尤为重要。一般，免疫球蛋白的多数分析测定技术都可用于丙种球蛋白病的检测。当临床上考虑为多发性骨髓瘤、巨球蛋白血症或其它浆细胞恶变疾病时，首先应该做血清蛋白区带电泳，如果发现有异常球蛋白区带，继而进行免疫球蛋白测定与免疫电泳，作进一步定量分析和免疫球蛋白分类鉴定。注意作追踪观察，以助病情、疗效的了解和预后的推断。良性或继发患者往往是在体检或其他检查中，进行血清蛋白区带电泳而发现的。当疑为冷球蛋白血症或轻链病时，均应进行冷球蛋白测定或本周蛋白测定加以证实。
一、血清蛋白区带电泳
蛋白质区带电泳是血清蛋白的经典分析方法，血清（或尿液）标本中不同性质的蛋白质可明显分开形成不同的区带，通过正常的电流图谱进行比较分析，很容易发现患者电泳图谱不一狭窄而浓缩的集中带，即M区带（图26-1），这是由于M蛋白的化学结构高度均一，因而其电泳迁移率十分一致。如果将这些区带电泳图谱扫描，还可计算出异常蛋白的含量和百分比。这种M区带较多见于γ或β区，偶亦可见于α区。M区带的电泳位置可大致反应出免疫球蛋白的类型，IgG型多位于α区至γ慢区，IgA型多位于γ1与β区，IgM型多位于β2或γ区，IgD型多位于β或γ区。但是区带电泳不能完全确定免疫球蛋白的类型，最终确定还需用特异性抗体进行鉴定。
在某些情况下还可以出现假的狭区带，易与M蛋白混淆，应注意区别。例如溶血标本中血红蛋白形成的β位区带，陈旧血清中聚合IgG形成的近原位窄区带，以及由类风湿因子形成的位于γ区中间的细区带都易于M区带相混淆，遇到这些可疑情况时，应进一步做免疫电泳等分析加以区别。
非分泌型骨髓瘤患者血清蛋白区带电泳中不能检出单克隆丙种球蛋白的M区带，往往呈现低丙种球蛋白血症的特征，临床上却存在浆细胞骨髓瘤的表现。为明确诊断需对患者骨髓中恶性浆细胞进行表面免疫荧光染色分析，或提取其恶性浆细胞，经溶解后再行免疫球蛋白分析。轻链病有时血清中也检测不出M蛋白，这就需要进行尿中本周蛋白的检测。多克隆丙种球蛋白病是临床上更为常见的一类疾病，其病因与单克隆丙种球蛋白病明显不同，是受一些抗原刺激引起多株细胞过度免疫应答的结果。因此，血清蛋白电泳图谱是在γ区域呈现着色深浓、宽阔而不匀的区带，易与M蛋白相区别。多克隆丙种球蛋白病中免疫球蛋白的升高谱型大多无特异性，一般以IgG升高为多，可伴IgA或IgM升高，也可IgA或IgM单独升高。低丙种球蛋白血症则表现为γ区的缺失。结缔组织中多克隆丙种球蛋白增高有随疾病严重程度而升高的趋势，而肝病中的增高程度也可用来估计肝损伤的程度。
二、免疫球蛋白定量测定
免疫球蛋白定量测定较常用的方法有单向扩散法与免疫浊度法，前者较为简便，后者更为准确迅速。恶性单克隆丙种球蛋白病常呈现某一类丙种球蛋白的显著增高，大多在30mg/ml以上；而正常的免疫球蛋白，包括与M蛋白同类的丙种球蛋白的含量则显著降低。在良性丙种球蛋白病的血清标本中，M蛋白的升高幅度一般不象恶性丙种球蛋白病那么高，多在20mg/ml以下；M蛋白以外的免疫球蛋白含量一般仍在正常范围之内。如在单向扩散试验中出现双圈状沉淀环，则标本中可能存在某种免疫球蛋白片段的M蛋白。多克隆丙种球蛋白病患者的血清中常有多种类型的免疫球蛋白水平同时升高，每类上升的幅度不太大，但总的丙种球蛋白水平增主比较明显。
免疫球蛋白的定量检测，有时会由于不同实验室所用抗血清特异性的差异，而造成M蛋白定量结果的不同，特别在使用某一株M蛋白制备的抗血清检测其他患者的M蛋白时。如能配合作用区带电泳光密度扫描，常可纠正这种误差。
进行免疫球蛋白的定量检测，不仅有助于丙种球蛋白病的诊断，并对丙种球蛋白病的良、恶性鉴别具有一定的帮助。如做动态观察，对丙种球蛋白病的病情和疗效的判断有一定的价值。M蛋白含量的多少常可反映病情的轻重，尤其对同一患者，M蛋白含量明显增高常提示病情恶化；经有效治疗后，M蛋白含量逐渐下降，而正常免疫球蛋白的含量则由降低趋向正常。
三、免疫球蛋白的分类鉴定
疑为丙种球蛋白病的患者，经血清蛋白区带电泳和免疫球蛋白测定，已基本证实是否有免疫球蛋白的异常增高和其含量的多少，但是增高的M蛋白究竟是哪一类免疫球蛋白，仍需进一步分类鉴定，常应用各种类型的特异性抗血清，做不同形式的电泳或免疫扩散。
（一）免疫电泳
免疫电泳是将区带电泳和免疫扩散结合起来的一种免疫学分析法。血清标本先经区带电泳将各种蛋白成分分离开，继而用各种特异性抗血清进行免疫扩散，根据M蛋白在免疫电泳中所形成的特殊沉淀弧，观察其电泳迁移位置与抗原特异性，可将M蛋白的免疫球蛋白类型和其轻链型加以鉴定。一般多用抗IgG、IgM、IgA、κ和λ轻链等5种抗血清进行实验，用抗正常人血清作为对照。M蛋白与相应抗体发生反应所出现的沉淀弧较为特殊，较普通沉淀弧宽，凸出呈弓形，不难辨认。如有下列情况，可作出判断或提示。
1．如果待测血清标本与某型免疫球蛋白重链及轻链抗血清产生相同迁移度的特殊沉淀弧，提示存在单克隆丙种球蛋白（M蛋白），此现象多见于IgG、IgA或IgM型多发性骨髓瘤或原发性巨蛋白血症等（图26-2）。
图26-2 IgAλ型骨髓瘤的免疫电泳图谱
孔中为血清标本，槽中为抗血清，箭头所指为骨髓瘤蛋白 a：抗正常人血清；b：抗IgG血清；c：抗IgA血清； d：抗IgM血清；e：抗κ血清；f：抗λ血清
2．在同一抗轻链血清的反应中，同时出现二条毗邻的特殊沉淀弧（图26-3），则可能是除M蛋白以外还存在游离轻链，偶尔也可见两种M蛋白，此时应进一步测定尿中的本周蛋白。
3．患者血清中仅与其中一种抗轻链抗血清产生一种特殊的沉淀弧，而其他5种抗重链抗血清均不产生此种特殊的沉淀弧，这种情况可能是①伴有肾功能不全的轻链病，游离轻链较少从尿中排出而滞留于血液中；②存在轻链的四分子多聚体，分子量大（90kD），不易从尿中排出，而留存于血液中；③尚未发现的新重链的免疫球蛋白。
图26-3 IgGκ型骨髓瘤伴κ型
本周蛋白尿的免疫电泳图谱
上孔为尿液，下孔中为血清标本，槽中
为抗血清，箭头所指为骨髓瘤蛋白 b：
抗IgG血清；c：抗IgA血清；d：抗IgM 血清；e：抗κ血清；f：抗λ血清
图26-4 IgG重链病的免疫电泳图谱
上孔中为尿液，下孔中为血清，槽中为抗血清，
箭头所指为骨髓瘤蛋白 a：抗正常人血清；b：抗IgG血清；c：抗 IgA血清；d：抗IgM血清；e：抗κ血清；f：抗λ血清
4．若患者血清只与IgG、IgA或IgM中的一种抗重链血清产生一特殊沉淀弧，但在两型抗轻链血清中无相应位置的沉淀弧出现，血清标本经2-巯基乙醇还原处理后，仍无改变，提示可能是重链病（图26-4），需进一步测定其分子量。
5．非分泌型丙种球蛋白病血清中某一类型的免疫球蛋白含量一般不会太高，沉淀弧带偏近抗体槽，以致影响分析。必要时需对血清标本进行不同稀释后再作试验，以资比较。有时某些M蛋白（如IgA或IgM）的四级结构会阻碍轻链抗原决定簇与其相应抗血清结合，因而误诊为重链病。这时需在血清标本中加入2-巯基乙醇（10μl/ml血清）作还原处理后再作试验，才能获得正确结果。作游离轻链分析时，由于轻链分子量小，扩散很快，要每隔10min观察一次结果，并注意标本浓度不宜过高，否则难以获得满意结果。
如果免疫电泳仍不能完全进行M蛋白的分类鉴定，可应用免疫选择电泳与免疫固定电泳作为补充，以便进一步鉴定。
（二）免疫选择电泳
将含抗κ或λ血清的琼脂制成薄层琼脂板，打孔后加入待测血清或其他标本进行火箭电泳，与标本相应的免疫球蛋白形成火箭样沉淀峰。然后于孔的两侧各挖一槽，加入某型免疫球蛋白的抗血清或另一型轻链抗血清，温育扩散后，按沉淀弧形成的情况，进行分析鉴定。图26-5为α重链病和IgA骨髓瘤的结果。
图26-5 免疫选择电泳图谱示例 孔中为血清标本，
槽中为抗IgA重链抗血清KL表示琼脂中含抗κ及抗λ抗血清 A：正常人；B：α重链病；C：IgA骨髓瘤
图26-6 免疫固定电泳图谱示例 （IgA-λ型M蛋白）
κ、λ、G、A、M分别代表覆盖含抗κ，抗λ，抗IgG，
抗IgA和抗IgM的抗血清；箭头所指为加样处
（三）免疫固定电泳
该方法类似免疫电泳，将待测血清或其他标本在琼脂平板上作区带电泳，分离后于其上覆盖含抗κ或λ轻链或各类重链的抗血清滤纸，当抗体与某区带中的单克隆免疫球蛋白结合后，便形成复合物而沉淀下来，再通过漂洗与染色，呈现浓而狭窄的着色区带，即可判断单克隆丙种球蛋白的轻链和重链型别（图26-6）。
四、其他检测方法
（一）本周蛋白的检测
本周蛋白即尿中游离的免疫球蛋白轻链，其检测对轻链病的诊断是必不可少的项目，并对多发性骨髓瘤、原发性巨球蛋白病、重链病等疾病的诊断、鉴别和预后判断均有一定帮助。
本周蛋白在pH5.0的条件下，加热至50℃～60℃时出现沉淀，继续加热至90℃后又重新溶解。根据这种理化性质，又将其称为凝溶蛋白，故可根据这一特点，用化学方法进行检测。这种加热沉淀法简便易行，但敏感度较低，也不能确定轻链的型别。
也可用抗κ和λ型轻链抗血清进行免疫电泳分析。为提高检出率，尿标本宜先用聚乙二醇通过透膜浓缩。游离轻链往往与其中一型的抗血清起反应，在β-γ区附近形成一条致密的弓形沉淀弧。有时轻链还含有其他蛋白，要注意识别。如多克隆免疫球蛋白常同时与κ和λ两型抗轻链血清形成沉淀弧，而单克隆免疫球蛋白（M蛋白）虽只与其中一型抗轻链血清反应，但也与某一型重链抗血清产生一位置相同的沉淀弧，通过观察分析可作出正确判断。
轻链病患者尿中可测得本周蛋白，但由于其分子量较小，易迅速自肾排出，故血中反而呈阴性，检测时应该注意。
（二）冷球蛋白的检测
冷球蛋白是血清中的一种特殊蛋白质，在4℃时自发沉淀，加温至37℃时又可溶解，故常利用这种可逆性冷沉淀的特性对其进行测定。取患者外周血，分离出血清置4℃冰箱中，一般在24～72h出现沉淀，若1周仍不出现沉淀者方可判断为阴性。如形成沉淀，再置37℃温育使其复溶，也可将冷沉淀物离心洗涤后做定性与定量分析。
进行冷球蛋白研究和检测时，必须注意以下事项：①部分单克隆冷球蛋白可在低于10℃时发生沉淀，故标本采集时必须将注射器和容器预温，离心及整个操作过程中也都要注意保温；②部分冷球蛋白在冷的条件下可迅速沉淀，但有一些则需数天，因此，这些血清需在4℃下放置1周；③大部分正常人血清也含有多克隆冷球蛋白，但通常在是80μg/ml以下；④冷纤维蛋白原、C反应蛋白-蛋白复合物和肝素沉淀蛋白等也具有冷沉淀特性，实验时应加以区别。
（孔宪涛）, 百拇医药 参见：
首页 >
药学版 >
生命科学 >
基因 >
克隆