第三节 分子生物学实验诊断技术
一、核酸杂交技术
检验方法建立的基本要素是特异性和灵敏度，在复杂的物体中，使无法感觉的特定物质进入人类的观察范围。核酸杂交检测技术就是利用核酸碱基严格配对的特异性，核酸标记物的灵敏度而建立的检测核酸结构与功能的方法。该法建立以来已有二十年，目前研究实验室用得多，临床实验室用得较少，除成本高外，关键是操作复杂，重复性差，仅能半定量。成本高可随经济发展而缓和，但其它缺点尚需努力克服。
杂交实验的探针应具有特异性，对应不同的杂交方法靶基因(被检基因)应有一定的纯度与丰度。杂交反应的开始是碰撞，探针浓度高则速率增加，一般32P标记探记探针5-100ng/ml，非放射性探针25-1000ng/ml，原位杂交无论放射还是非放射物标记，一般都需0.1-5.0μg/ml。当探针过量时，杂交速率取决于探针长度，如一个100ng/ml20个核苷酸的合成寡核苷酸探针与1-100pg 1kb长的靶基因杂交，10分钟能达到最大杂交率。而相同条件下2kb的克隆探针需160小时。主要原因是这里所指浓度是重量浓度而非摩尔浓度。长探针因标记量大，小的摩尔浓度已足以达到需要的检测灵敏度。为了促进长探针(>250个核苷酸)的杂交速率，加入杂交促进剂是非常必要的。最常用的是硫酸葡聚糖，使用浓度为5%-10%，浓度过高会增加杂交液粘度。聚乙二醇也作为促进剂，价廉且粘度低，但检测本底太高。另外杂交的温度、盐浓度、甲酰胺浓度可调节杂交分子形成的稳定性。理论选用DNA：DNA杂交温度T＝Tm-25℃，此时杂交分子最易形成。但具体实验中影响Tm值的因素很多，一般杂交温度低，形成的杂交分子较稳定。RNA：DNA杂交分子的Tm大10-15℃，RNA：RNA杂交分子的Tm大20-25℃，使得杂交温度提高，此时需调节甲酰胺浓度来调节杂交温度。好的实验条件最终应在实践中摸索建立。
(一)斑点杂交
将少量核酸样品点样在硝酸纤维素滤膜上，80℃烘烤后可牢固地固定在膜上，再用探针进行杂交。尼龙膜，特别是聚偏氟乙烯膜(PVDF)与DNA结合力更高，坚韧、易操作。点样可手工，也可用真空点样品。检测可用放射性探针自显影或非放射性探针显色。可用于DNA或RNA分析。下面以非放射性探针分析DNA为例，结果是显色。
取硝酸纤维素膜和滤纸在2xSSC(NaCl 300mmol/L，柠檬酸钠30mmol/L)，pH7.0浸15分钟，平铺滤纸在点样抽滤器上，再铺上硝酸纤维滤膜，真空抽气使点样器减压，膜显出凹面。点样50μl(5-10μgDNA，可直接点血清样品)于凹面，撤去真空，把膜晾干。取滤纸浸0.5mol/L NaOH，1.0mol/L NaCl，把膜平铺于滤纸上20分钟，变性。取滤纸二张分别浸在0.5mol/L Tris-Hcl pH7.5和1.0mol/L Tris-HCl，0.6mol/L NaCl pH7.5，分别依次把膜平铺于滤纸上，各中和15分钟，中和后膜的pH为7.2-7.5。于80℃，30-45分钟烘干。(RNA分析点样缓冲液系统不同，无需变性，中和，余大致相同)用塑料封口机把膜和2.5ml预杂交缓冲液封入塑料袋中，42℃，水浴30分钟。
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图18-6 <前述分离、纯化的DNA样品5-10μg/100μl TE，加限制性内切酶3Unit/1μgDNA和内切酶相应缓冲液，在相应温度保温1-3小时(不同的酶所用的缓冲液和温度不同)，乙醇沉淀，15-20μl TE溶解DNA断片。前述电泳条件，与DNA分子量标准品(Marker，Ladder)一起，3-4V/cm电泳(30V12-15小时)。在紫外光下观察Marker充分分离，结束电泳。将胶放入0.5mol/L NaCl，0.5mol/L NaOH液体中30分钟，使DNA变性。同时将膜用蒸馏水浸润，在0.5mol/L NaCl，0.5mol/L NaOH液体的方盘皿上，放上滤纸两头浸在液体中，依次放上凝胶、膜、滤纸、一尺厚的吸水纸，压力1kg的重物。转移(印迹，blot)过夜。翌日，把膜放在0.5mol/L Tris-HCl，pH7.0-7.5，1mol/L NaCl液中，中和膜上碱性变性液15-30分钟。戴上手套，用手指压在膜上来回充分洗膜。室温干燥一小时。用塑料封口机，把膜和预杂交缓冲液封在塑料口袋中，注意驱除袋内汽泡。热水浴过夜。探针变性后，加入袋中再封口。热水浴过夜。 洗膜： 2xSSPE，0.5%SDS，总体积200ml，室温30分钟。 0.4%xSSPE，0.5%SDS，总体积200ml，60℃，30分钟。 将膜包入塑料袋，在暗室贴在X光底片上。-70℃，自显影1-2天。 冲片显影，观察结果(背景不清晰可重新洗膜再显影)。 <(三)Northern blot
<用于RNA分析，电泳条件与转膜方法与Southern blot不同外，RNA不必变性与中和，电泳时加电醛防止RNA发夹结构形成。其它步骤相同。
<为了防止RNase水解需分析的mRNA，尽可能将器皿在160-180℃干热灭菌8小时以上，也可加0.1%焦碳酸二乙酯(DEPC)泡2小时，灭菌水淋洗干净，100℃干烤15分钟。不能干热灭菌的试剂等，也可加1%DEPC处理12小时(但不能用于Tris)后，100℃。加热15分钟(或高压灭菌15分钟)以抑制、分解RNase。1.0g琼脂糖，灭菌水80ml加热溶解。加x50TAE2ml，EB25μl，灭菌水至1000ml。样品缓冲液，x50TAE20μl，50%去离子甲酰胺500μl，甲醛180μl，混匀。约10-30μg/10μl纯化的RNA样品，加二倍(20μl)样品缓冲液(可点样一个凝胶孔lane)。60℃水浴15min，马上置冰浴。加1/10电泳指示剂。点样电泳，75-80V电泳4-5小时(指示剂泳动7～8cm)，结束电泳。电泳期间正负极缓冲液要不断交换(可用蠕动泵)，以免pH改变。电泳结束，将凝胶放在紫外光下可观察到人rRNA大亚基28S(5.1kb)，小亚基18S(2.0kb)，记下大小亚基移动距离(或拍照)，可作为被测mRNA分子量分析的参照物。凝胶在50mmol/L NaOH中变性30分钟(低浓度碱，此步可省)。膜在10xSSPE中浸20分钟。用10xSSPE转移过夜(同Southern blot)。80℃1-2小时干燥。用探针杂交后，显影或显色。
<(四)原位杂交(insitu hybridization)
<在保持细胞形状条件下，进行细胞内杂交，显影或显色。用于DNA或RNA分析。
<细胞用离心涂片机涂片或组织切片置于载玻片上。4%多聚甲醛(PFA)/PBS固定(固定时间因标本而异10-20分钟，也可用含2%甲醛，0.05%戊二醛，2.5mmol/L CaCl2的0.1mol/L磷酸缓冲液pH7.3，500W微波炉中照射10-20秒，固定)。马上用PBS洗标本三次，2.5μg/ml蛋白酶K，37℃，5-20分钟(因标本和固定条件而定)处理。磷酸盐类缓冲液(PBS NaCl 137mmol/l，KCl 2.7mmol/L，Na2HPO48.1mmol/L，KH2PO41.5mmol/L)洗涤。4%PFA/PBS后固定，PBS洗一次，0.2%甘氨酸/PBS洗二次，每次15分钟。预杂交：42℃，1小时。预杂交缓冲液：10%硫酸葡聚糖，10%Denhardt液，0.5%吐温-20，250μg/ml鲑鱼精子DNA，500μg/ml酵母tRNA。杂交：42℃，4小时。用2x杂交缓冲液(4xSSC，0.2mol/L磷酸钠pH6.5，2xDenhardt)溶解已标记探针，使其终浓度为0.1-1.0μg/ml。DNA检测时把探针覆盖在标本上，置100℃5分钟(变性)取出，杂交。mRNA检测则先把探针置95℃水浴3分钟，立即置冰水浴，再覆盖标本上进行杂交。覆盖标本用液量100-200μl洗涤：2xSSC，50℃过夜。0.2xSSC，室温1小时。载玻片浸在缓冲液中。显色(试剂、方法参照斑点杂交的封闭-显色部分)20分钟-2小时，显微镜下观察结果。
<二、核酸扩增技术
<通过大肠埃希菌繁殖而增殖重组质粒，也是扩增核酸的手段。但在试管中有效扩增DNA的方法，是在90年代才开展起来的多聚酶链反应(polymerase chain reaction，PCR)新技术。由于PCR灵敏度高、特异性好、操作方便，在我国发展很快。目前，PCR技术结合分子生物学实验技术(如逆转录反应杂交技术等)开发了许多PCR新技术(reverse transcriptase PCR；PCR-single strand conformation polymorphism，PCR-SSCP；巢式PCR(二次PCR)；热启动PCR等)。RT-PCR用于RNA分析；PCR-SSCP分辨率高，可用于点突变分析；二次PCR特异性好，灵敏度高；热启动PCR可提高特异性。
<图18-7 PCR技术原理
< <将反应物和Marker点样于凝胶一起电泳，紫外光下观察结果，拍照保存结果。反应物也可用于印迹(杂交)实验、多态分析、探针制备等。
<注意事项：①DNA样品纯度高，Taq酶(和Klenow酶)有逆转录酶活性，DNA和RNA不能混在一起。②设计的引物分子内(特别3′端)和引物，1，2分子间不形成双链。选择性好，不增幅目的DNA以外区域的DNA。引物的G+C含量为40%-60%。③dNTP浓度过高易使Taq酶合成错误，一般在200μmol/L，有人建议40-50μmol/L。④KCl>75mmol/L对酶有抑制作用。Mg2+浓度过高，NDA不易变性，>10mmol/L可抑制酶活性40%-50%。⑤多聚酶：Taq多聚酶从嗜热菌分离得到(1989年，在此以前1985年利用Klenow酶因不耐热每经过一次热变性要补加一次酶)，现在经基因克隆的重组体产物Taq酶最适pH8.3～8.8(室温8.3-8.4)，反应温度75-80℃，95℃以上失活明显。无3′→5′校读活性，对SDS敏感(<0.01%活性也受到抑制，加吐温-20可抵制SDS抑制)。该酶有逆转录酶活性。⑥退火温度一般设定为Tm-5℃，但实际上与引物一级结构序列有关，设计不当可造成非特异性退火，而造成非特异扩增，此时应调整温度和相应的时间。⑦循环次数受到的影响因素较多，增加次数可提高灵敏度，但易出现非特异扩增。⑧PCR灵敏高，被检样品极易被污染，样品纯化，扩增，检测区域应分开。房间应经常用紫外光照射。扩增物应定点丢弃，处理。
<三、核酸限制性片段长度多态性(RFLP)分析
<核酸纯化→内切酶作用→电泳分离→Southern blot→探针-杂交→显影，显色
< <图18-8 点突变Eco R1 RFL
<四、核酸一级结构(核苷酸序列sequence)分析
<核酸一级结构分析是基因分析最直接的第一手资料。目前DNA、RNA以及蛋白质的一级结构分析中，DNA的碱基序列分析方法多样、简单、快速。下面就M13噬菌体-双脱氧核苷酸(ddNTP)的DNA测序法介绍如下。
< <图18-9 核酸碱基序列分析
<0.2-0.3mm厚度聚丙烯酰胺-尿素凝胶，高压(1600V)电泳，可分辨一个核苷酸的差异。电泳后干燥凝胶，自显影，自下往上读图，得到5′→3′的合成链碱基序列，其互补链是待测DNA的3′→5′碱基序列。
<99-12-30 18:48 刘小琴 校对
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