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第二节 在研究和诊断自身免疫性疾病中的应用
http://www.100md.com 《免疫细胞化学》

第二节 在研究和诊断自身免疫性疾病中的应用

在自身免疫性疾病的诊断中,目前常常用免疫细胞化学技术检查相应的自身抗体作为重要诊断依据之一,并以此探讨自身免疫性疾病发生的免疫机理。

用免疫荧光法可以检查的自身抗体日益增多,具有器官特异性的自身抗体如甲状腺球蛋白抗体和甲状腺微粒体抗体,甲状腺第二胶质抗体,肾上腺抗体,胃壁细胞抗体,皮肤表皮间粘合质(Intercellular Cement of epidermis)抗体和基底细胞层抗体,唾液腺导管细胞抗体,胰岛细胞抗体,肾小球基底膜抗体,结肠粘膜上皮多糖物质抗体,精子抗体,卵巢抗体,胃G细胞抗体等。

用免疫荧光法可以检查出的非器官特异性自身抗体,有抗核抗体,平滑肌抗体,线粒体抗体、横纹肌抗体、神经髓鞘(外周)抗体、抗网状纤维抗体等。

还有报告用免疫荧光法检查血细胞自身抗体如抗白细胞(淋巴细胞)、红细胞,血小板抗体等。

一、抗核抗体(Antinuclear antibodies, ANA)的检测

Friou等(1957)首先用免疫荧光法检查出存在于SLE病人血清中的NAN,Alexander和Duthie(1958)证实了Friou等的结果。Friou等(1958)检查了28例SLE病人血清中有27例ANA阳性。一例阴性属临床长期不活动性病人。以后大量报告都指出用免疫荧光间接法检查ANA对于临床诊断SLE有重要价值,其阳性率在80%~100%之间,阳性对于SLE病有确诊价值,但阴性不能完全排除SLE,因为少数活动性SLE其ANA可能维持阴性,Fessel氏认为可能是一种亚型。正常人0%~4%,类风湿关节 炎、皮肌炎、硬皮病、sjogeren’s综合征,混合性结缔组织病、慢性活动性肝炎等多种疾病也呈不同程度的ANA阳性率,ANA可能是一种自身免疫反应的一个重要指标。ANA在各种疾病中的百分率见表15-1。

表15-1 抗核抗体在各种疾病中的百分率

 

上皮区

上皮基底膜

表皮核

寻常天疱疮

+

-

-

类天疱疮

-

+

-

疱疮性皮炎

-

-

-

多形性大疱性皮炎

-

-

-

红斑性天疱疮

+

-

+

(Clinical Immunology P146, 1971)

十五、唾液腺外分泌导管上皮自身抗体的检测

在诊断Sjogren’s综合征时检测唾液腺外分泌导管上皮细胞抗体具有重要意义,阳性率达65%,用人或猴唾液腺组织(O型)不固定的冰冻切片,间接免疫荧光细胞化学法检测,可见导管上皮细胞浆呈黄绿色荧光。

十六、抗横纹肌自身抗体的检测

抗横纹肌自身抗体出现在50%以上的肌无力症和胸腺瘤病人,正常人未发现。属IgG类抗体,用间接免疫荧光法检测此抗体,准确简便。

1.抗原切片取人或大白鼠骨骼肌,沿肌纤维平行方向作冰冻切片,不固定。

2.间接法免疫荧光染色方法染色的方法步骤与其他自身抗体间接法相同,但在荧光抗体染色之后,要延长PBS洗涤时间,3次PBS洗涤,每次30min。封裱切片。

3.荧光显微镜检查可见横纹肌A-带呈阳性荧光,无例外的都是胸腺肿瘤病人。单纯肌无力病人主要与I带和H带呈现阳性荧光有关。某些肌无力病人血清只含与“白纤维反应抗体,另一些只含有与”红纤维反应的抗体,呈斑点状荧光。横纹肌抗体和胸腺髓细胞、心肌呈一定程度的交叉反应。当血清稀释至1:60时,可获得更清晰的横纹荧光图像。

十七、肾上腺自身抗体的检测

抗肾上腺自身抗体是对肾上腺皮质细胞浆成分的一种器官特异性抗体。主要见于慢性肾上腺皮质功能减退症(阿狄森氏病)病人。用间接免疫荧光法检测,阳性率约50%,其他自身免疫病阳性率2%~5%。

1.抗原切片抗原用新鲜肾上腺尸检或手术切除标本,常用皮质醇增多症(柯兴氏病)病人手术切除的肾上腺。或取猴肾上腺组织,作冰冻切片。不需固定。

2.间接免疫荧光检查方法

3.荧光显微镜检查可见特异性荧光在皮髓质连接区最清晰,定位于皮质网状带细胞胞浆,髓质细胞不与抗体反应。

十八、类风湿因子(Rheumatoid factor)的检测

类风湿因子是一种抗轻度变性的IgG的自身抗体,可与人或动物的热聚合IgG或抗原结合的IgG(即免疫复合物中的IgG)反应,而不与正常IgG反应。类风湿因子为IgM类抗体。主要见于类风湿性关节 炎产现人血清和组织中。

1.直接法

(1)用病人关节 滑膜或淋巴结,冰冻切片,冷丙酮固定10min。

(2)标记变性IgG或球蛋白:取人血清提取的γ球蛋白(20~25mg/ml),按常规法标记FITC,去游离荧光素后,将标记溶液置63水浴加热10min,使γ球蛋白热变性。加入40%2.17mol/L硫酸钠使热聚合体沉淀,置冰箱4h(4℃),然后在低温下离心30min(10000rpm)。取沉淀以预冷至4℃的蒸馏水溶解至原体积半量。用蒸馏水透析24h(4~6),再用pH7.6生理盐水透析24h。高速离心(12000rpm)30min除去不溶性聚合物,取上清分装,-20保存备用。

(3)直接免疫荧光染色:切片分别用以下染色试剂处理

①加标记变性γ球蛋白溶解。

②加标记抗IgM或γ球蛋白荧光抗体。

③加未标记变性γ球蛋白,作用切片后,洗涤,再加标记变性γ球蛋白。

①,②在适当稀释的试剂染色后呈特异性荧光,大多数活动性类风湿性关节 炎,可见阳性荧光的浆细胞堆集。③阴性或荧光显著减弱。

2.间接法用以检出病人血清中的类风湿因子。

抗原:用溶血素致敏的绵羊血细胞涂片。丙酮固定10min。

常规间接法染色。病人血清中有类风湿因子,与绵羊红细胞上的溶血素(变性IgG)结合,再加入γ球蛋白荧光抗体,与类风湿因子结合。因而红细胞呈现亮明的荧光,即证明类风湿因子阳性。

十九、抗中性白细胞胞浆自身抗体(Anti-eutrophil cytoplasmic autoantibody ANCA)

Davies 等(1982)首次报告在坏死性肾小球肾炎患者血清中发现ANCA。Hall等(1984)在4例系统性血管炎中也发现ANCA,其中3例表现为坏死性肾小球肾炎。Vander woude等(1985)报告血清中ANCA的滴度与诊断活动性Wegener氏肉芽肿的病情有密切关系,随着病情缓解,ANCA的滴度逐渐降低,所以认为是诊断Wegener氏肉芽肿很敏感的指标。随后一些研究表明检查ANCA对诊断结节 性多动脉炎和特发性新月体肾炎均有较高的敏感性。1989年和1990年分别召开了第一和第二届国际ANCA专题研讨会,引起了国际上的广泛重视。

ANCA抗原存在于中性白细胞的胞浆颗粒中, 分子量为29kD,已证实是一种丝氨酸蛋白酶,与存在于中性白细胞嗜天青色颗粒中的丝氨酸蛋白酶-蛋白酶3(PR3)十分相似。所以,胞浆型ANCA(C-ANCA)能与PR3发生特异性反应。另一型称核周型ANCA(P-ANCA)的主要抗原成分是髓过氧化物酶(MPO),在坏死性肾小球肾炎和系统性血管炎患者,约90%的P-ANCA能与MPO发生特异性反应。由于有时P-ANCA同时伴有细胞核荧光,为排除假阳性, 必须证明是MPO-ANCA。ANCA可以为IgG、IgM、或IgA类抗体,在不同疾病时三者的出现机率不同。

间接免疫荧光检查ANCA:用肝素抗凝血分离中性白细胞,以0.01mol/L Ph7.4 PBS洗细胞3次,制涂片,吹干。无水酒精固定5min。加待测血清,37℃孵育40min,PBS冲洗。加1:10稀释的抗人IgG-FITC荧光抗体,37℃孵育30min,PBS洗3次,每次3min,磷酸缓冲淮甘油封片。荧光显微镜观察。

ANCA的荧光可表现为C-ANCA和P-ANCA二种类型:C-ANCA荧光在胞浆中,分叶核之间有强的弥散性荧光、核无荧光。P-ANCA的荧光集中核周围,形成环状或不规则块状。

ANCA的致病机理:ANCA能使中性白细胞活化,发生呼吸爆炸,释放胞浆中的多种水解酶,氧自由基等活性物质而导致组织损伤。由于PR3和MPO都带正电荷,它们能与肾小球基底膜结合,PR3-ANCA和MPO-ANCA与之发生免疫反应导致肾小球基底膜损伤,另外,沉积在基底膜上的PR3和MPO还能通过介导细胞免疫,参予肾组织损伤。

二十、增殖细胞核抗原抗体(Proliferative cell nuclear antigen antibody, PCNA)

培养细胞经促细胞分裂剂刺激,核内DNA开始合成G0期,到最大增殖期(S期),细胞核特异的出现DNA的复制,利用这一特点,制成抗原DNA聚合酶S的辅助蛋白。取培养细胞或人末稍血淋巴细胞经PHA,ConA刺激后涂片,间接免疫荧光检测。结果可PHA刺激后48hDNA合成开始的S期出现很强的斑点型荧光,(G)期细胞无反应。

在SLE病人血清中出现有特异性诊断价值,出现率为3%~5%。

二十一、抗类风湿关节 炎相关核抗原的抗体(Antirheu-matoid arthritis associated nuclear antigen antibody, RANA)

又称SSC抗体,RAP,可有免疫荧光间接法检测,用人二倍体B细胞(Wil-2)或Raji细胞为抗原片,细胞滴片吹干,37℃干燥固定,因丙酮,乙醇等可使RANA失活。荧光阳性呈核内斑点型。对诊断类内湿关节 炎和伴有口眼干燥综合征的病人有参考意义。近年发现其他结缔组织病和正常人出率也很高,其特异性尚待进行深入研究。

二十二、抗精子抗体(Anti-sperm antibody, ASA)

在正常情况下由血睾屏障将精子抗原与免疫系统隔离,当此屏障发生破坏,精子抗原通过副睾间隙组织的淋巴管或毛细血管而进入免疫系统,就会引起自身免疫反应,产生自身抗体。抗精子抗体也可在一些女性体内产生。男性不孕症患者血中可检出很高阳性率的ASA。女性不孕症也可因ASA引起精子运动障碍,导致不孕。

抗精子抗体的作用是:①ASA可使精子运动障碍不能通过子宫颈管;②精子顶体酶活性被ASA抑制,使精子不易穿透包绕卵细胞的卵丘,放射冠和透明带;③抑制了精子与卵细胞膜的融合;④导致胚胎死亡和流产。⑤ASA的作用可使精子发生凝集,制动和结合三类。凝集抗体有精子头对头,尾对尾及混合型三种。

荧光抗体法和固相酶染色法常用于检测抗精子抗体。

固相酶免疫细胞化学方法:液化新鲜精液离心弃上清,沉积的精子用PBS洗3次,加0.5ml小牛血清混匀,校正精子浓度为5×107ml,涂于载玻片上,室温自然干燥,甲醇固定10min,PBS洗2次,吹干,加被检血清,37℃湿盒,30min,PBS洗3次,每次3min,加酶标记抗人IgG抗体,免疫荧光法则加抗人荧光抗体,37C湿盒30min,PBS洗3次,每次3min(或荧光显微镜检查),用DAB-H2O2显色(同前述免疫酶细胞化学方法)。常规脱水、透明树胶封固。油镜观察结果。阳性反应精子呈棕黄色,阴性兰色(用伊文思蓝复染)。阳性可见在精子顶体、中体,后核帽、中片、尾及尾尖等。

二十三、其他自身抗体的检测

目前已发挥许多自身抗体,如抗胆小管抗体,见于原发性胆汁性肝硬化病人,阳性率达75%。用大白鼠肝的胆小管作抗原,间接免疫荧光染色阳性荧光定位于胆小管上皮细胞,呈均匀荧光。抗生殖细胞的自身抗体除精子外还有卵巢细胞抗体,常见不孕症患者。

心肌抗体常见于心脏手术后综合症和心脏移植的受体。

结肠粘膜抗体可见于溃疡性结肠炎患者的血清中,还有抗网织纤维抗体等。

近年对垂体细胞自身抗体研究发现,在多内分泌自身免疫疾病中存在抗促乳素细胞抗体,生长激素细胞抗体,ACTH细胞抗体等。

在神经系统中抗神经髓鞘成分的自身抗体,常见于神经脱鞘性疾病。

在一些眼科疾病中存在的自身抗体如抗晶体成分抗体, 抗眼肌抗体等。

用大白鼠组织作抗原检查自身抗体,在心肌间质,肝枯否氏细胞,平滑肌和横纹肌模,胃及肾、肝的间质,肾小管近曲管刷状缘等出现阳性荧光,这是所谓异嗜性抗体(Heterophile anti-body),它和自身抗体易发生混淆,必须注意区分。

免疫细胞化学技术在自身免疫性疾病诊断中以免疫荧光技术应用最广泛,但应用免疫酶技术和免疫金-银技术也可以取得良好结果,作用用葡萄菌A蛋白的辣根过氧化物酶标记物代替荧光抗体作自身抗体检测,所得到的结果可用光学显微镜检查,适于在没有荧光显微镜的实验室应用。

校对:2000/05/29    杨丽华

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