早早孕期人子宫蜕膜蛋白质的变化
作者:王建华 朱正美 崔肇春 夏泉
单位:王建华 山西医科大学汾阳医学院生物化学教研室 汾阳 032200;朱正美 崔肇春 夏泉 大连医科大学生物化学教研室)
关键词:子宫内膜;蛋白质类;妊娠
山西医科大学学报990106 摘要 为进一步阐明着床的分子机制,为生育的控制和不孕症的治疗提供新的实验基础,利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及银染法对正常人增殖期(PP)、分泌期(SP)、以及尽可能接近于着床期(早早孕期)包括二级绒毛期(SVP)和三级绒毛期(TVP)的子宫内膜蛋白质进行了研究,结果发现:子宫内膜水溶性蛋白质于增殖期含量最高,增殖期后降低,存在显著性差异(P<0.05),而十二烷基硫酸钠(SDS)溶解蛋白在各个功能时期无显著性差异(P>0.05);早早孕期人子宫蜕膜蛋白质有阶段特异性变化,有45.7千道尔顿(kD)阶段特异性蛋白出现。其确切的功能以及在胚泡着床过程中的作用均待进一步阐明。
, 百拇医药
中图号 R318.02 Q73
Changes of human endometrium proteins in very early pregnancy
Wang Jianhua, Zhu Zhengmei, Cui Zhaochun, et al
(Dept. of Biochemistry,Fenyang Medical College, Shanxi Medical University,Fenyang 032200)
Abstract To elucidate the molecular mechanism of implantation,and provide the experimental bases for birth control and treatment of infertility,biochemical methods including SDS-PAGE and silver staining were employed to study the proteins of human endometria in proliferative phase (PP),secretory phase (PP),pregnancy less than 5 weeks (secondary villus phase,SVP),and pregnancy 5~6 weeks (tertiary villus phase,TVP).Results showed that the water soluble proteins decreased from PP to other three phases,there was statistical significance between SP and other three phases (P<0.05)but as for SDS soluble proteins there was no significance(P>0.05);the SDS-PAGE patterns of human endometrium proteins displayed a 45.7 kD stage-specific protein which only appeared in very early pregnancy.The nature and function of this stage-specific protein deserve further investigation.
, 百拇医药
Key words endometrium; proteins; pregnancy
哺乳动物的受精卵,从输卵管运行至子宫,并向母体传递进入子宫的信息,使胚泡的发育与子宫为它着床作准备达到同步化,从而使胚泡顺利地完成着床过程。胚泡发出的信息究竟是什么,母体子宫的主要准备是什么,这是许多研究者所关心的问题。近年来发现胚泡本身及子宫内膜合成的蛋白质和小分子肽类在着床过程中起重要的作用[1]。对于着床期子宫内膜蛋白质的报道较多,但大部分实验以兔和鼠为研究对象,如Anderson等[2]利用兔为研究对象发现着床期兔子宫内膜蛋白质发生阶段特异性变化。但对于人早早孕期子宫蜕膜蛋白质的变化,还未见报道。本文以正常人子宫内膜为材料,对子宫内膜水溶性蛋白和SDS溶解蛋白进行了电泳谱的分析以及含量的比较,以期观察早早孕期人子宫蜕膜蛋白质的变化规律,进一步阐明着床的分子机理,并希望为研究抗着床免疫避孕以及不孕症的治疗提供实验基础。
, 百拇医药 1 材料
1.1 主要试剂 Acryl、Gly、SDS、TEMED、β-巯基乙醇(美国Sigma公司);Bis(瑞士Fluka公司);SDS(上海生化所中华生化公司);PMSF(中科院上海生化研究所东风生化技术公司;硝酸银(北京化工厂)。
1.2 主要仪器 V16-垂直板电泳槽(上海市科学器材公司);高速冷冻离心机(日本Hitachi公司)。
2 方法
2.1 标本来源 取医院计划生育门诊人流术后新鲜的子宫蜕膜(按末次月经起停经6 周之内的早早孕子宫蜕膜),同时取其绒毛。正常子宫内膜取自育龄妇女良性子宫肌瘤手术切除标本。
2.2 标本鉴定 将绒毛、正常子宫内膜标本用生理盐水洗净后,放入Bouin固定液中固定,12~24 h后制成蜡块,做石蜡切片。HE染色光镜下观察绒毛以确定是否为二级绒毛或三级绒毛;观察子宫内膜确定为增殖期或分泌期。
, 百拇医药
2.3 内膜蛋白的提取 取子宫内膜标本,滤纸吸干水份,称重。冰浴中加适量磷酸盐缓冲液(含1 mmol PMSF)(pH=7.2),充分匀浆,500 r/min离心5 min,弃沉淀。上清4℃、10 000 r/min离心30 min,得到的上清为子宫内膜水溶性蛋白,沉淀加适量磷酸盐缓冲液(含十二烷基硫酸钠),10 000 r/min离心10 min,弃沉淀,上清即为内膜SDS溶解蛋白。
2.4 Hartree法测定提取液(水溶性蛋白及SDS溶解蛋白)中蛋白质的浓度。将各种不同功能时期水溶性蛋白和SDS溶解蛋白进行统计学处理(用方差分析和q检验法进行)。
2.5 电泳[3] 将子宫内膜水溶性蛋白以及SDS溶解蛋白进行SDS-PAGE分析。电泳约5 h。
2.6 银染色法染色[4]。
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3 结果
3.1 人子宫内膜蛋白质含量的比较 比较不同功能时期人子宫内膜提取液中蛋白质的含量,发现子宫内膜水溶性蛋白于增殖期含量最高,与分泌期、二级绒毛期、三级绒毛期相比P<0.05;但二级绒毛期与三级绒毛期相比无显著性差异(P>0.05)子宫内膜SDS溶解蛋白其含量在四个不同功能时期的差异无显著性意义(P>0.05,见表1、2)。
表1 各种不同功能时期子宫内膜水溶性蛋白质含量的比较 子宫内膜
编组
n
水溶性蛋白质
(mg/g湿重)
对比组
, 百拇医药
P
(q检验)±s
增殖期
A
3
32.39±3.05
A—B
<0.01
分泌期
B
3
19.79±0.44
, 百拇医药
A—C
<0.05
二级绒毛期
C
3
24.77±6.51
A—D
<0.01
B—C
>0.05
三级绒毛期
D
4
, 百拇医药
17.15±3.23
B—D
>0.05
C—D
>0.05
方差分析F=9.794 P<0.01表2 各种不同功能时期子宫内膜SDS溶解蛋白质含量的比较 子宫内膜
n
SDS溶解蛋白质
(mg/g湿重)
F(方差分析)
P±s
, http://www.100md.com
增殖期
3
4.83±0.45
分泌期
3
5.04±0.08
2.484
>0.05
二级绒毛期
3
6.63±1.92
三级绒毛期
4
, http://www.100md.com
4.24±1.23
3.2 SDS-PAGE电泳谱的比较 SDS-PAGE电泳谱结果见图1、2。与增殖期、分泌期样品相比,早早孕期样品中SDS溶解部分有阶段特异性蛋白出现,分子量为45.7kD;水溶性部分未见特异性条带出现。
图1 人子宫内膜水溶性蛋白质SDS-PAGE图
谱(银染法,每种样品蛋白质上样量为20μg)
图2 人子宫内膜SDS溶解蛋白质SDS-PAGE
图谱(银染法,每种样品蛋白质上样量为20μg)
, 百拇医药
4 讨论
胚泡着床是建立妊娠的第一步,近年来,人们对影响胚泡着床的相关因素作了大量的研究,尤其母体和胚胎之间的适应性反应,在胚泡和子宫内膜之间许多已知和未知的物质信息传递是着床的关键,其中蛋白质、肽及酶类在着床过程中起着很重要的作用,迄今,胚泡着床的生化机制尚不十分清楚[5]。本文利用SDS-PAGE的高分辨率以及银染法的高灵敏度对人子宫内膜蛋白质进行了研究。从表1、2可以看出,由增殖期到分泌期、早早孕期,子宫内膜水溶性部分蛋白质含量减少。SDS溶解蛋白则无显著性变化。由于水溶性部分主要代表子宫内膜的胞浆蛋白,因此,实验所得的结果与Bell等[6]的结果相一致。这种变化与雌、孕激素的调节有关。在增殖期,子宫内膜在雌激素的作用下,蛋白质合成增加,致使细胞内蛋白质含量增加;在分泌期及早早孕期,由于雌、孕激素的作用,使细胞内蛋白质的合成、分泌均增加,最终导致子宫内膜细胞内蛋白质含量减少。对于着床期子宫内膜蛋白质的报道较多,但大部分实验均以兔和鼠为研究对象,而对早孕人子宫内膜的研究多集中于子宫腔液的分泌蛋白,对子宫内膜上皮细胞膜蛋白(尤早早孕期)的研究尚未见报道。到目前为止,从动物及人子宫中已发现40多种分泌性“妊娠相关蛋白”,如在早孕人子宫液中发现的孕激素相关/依赖性子宫内膜蛋白,其分子量为47~48kD,等电点为4.9,为早孕人子宫内膜腺体产生并分泌到宫腔及血液中的蛋白质,但由于研究者各自所采用的分离手段及检测方法的不同,各结果间的比较及归类尚难统一。对这些蛋白的研究目前还主要停留在分离、纯化及鉴定上,对其功能的研究还十分有限。比较人、兔[2]子宫内膜蛋白质电泳谱,我们发现人、兔子宫内膜有类似的情况,即妊娠期出现了阶段特异性蛋白质,在我们的实验中,发现该蛋白质分子量为45.7kD(与兔阶段特异性蛋白质的分子量不同),为妊娠期所特有的蛋白质。由于增殖期和分泌期均不存在胚泡,该蛋白的出现与胚泡着床直接相关,推测它在着床过程中起十分重要的作用,有可能该蛋白质在着床期胚泡与子宫内膜相互识别、粘附等过程中起重要的作用,也可能在早早孕期对胚胎有保护作用。该蛋白质的合成可能是由于胚泡游离在子宫时产生一种作为信息的特殊物质,当它被子宫内膜的特异受体接受后,使其相应的基因开放或解除了转录和翻译等过程中的抑制作用,从而合成了该妊娠特异性蛋白质。这些解释以及该蛋白的确切功能均待进一步探索。
, 百拇医药
参考文献
1 郭尧君,曹泳清,文镜.妊娠和假孕兔子宫内膜等电聚焦分析.生殖与避孕,1985,5(3):17~21
2 Anderson TL,Olson GE,Hoffman LH.Stage-specific alterations in the apical membrane glycoproteins of endometrial epithelial cells related to implantation in rabbits.Biol Reprod, 1986, 34: 701~720
3 Laemmli UK.Cleavage of structural proteins during assembly of the bacteriophage T4.Nature, 1970, 227: 680~683
, 百拇医药
4 凌俊.介绍一种快速灵敏的银染方法.生物化学与生物物理进展,1990,17(5):407
5 黄荷风,毛愉燕,石一复,等.胚泡着床及相关因素.国外医学计划生育分册,1996,15(2): 90~94
6 Bell SC,Hales MW,Patel S,et al.Protein synthesis and secretion by the human endometrium and decidua during early pregnancy.Br J Obstet Gynaecol,1985,92:793~803
[1998-07-10收稿], 百拇医药
单位:王建华 山西医科大学汾阳医学院生物化学教研室 汾阳 032200;朱正美 崔肇春 夏泉 大连医科大学生物化学教研室)
关键词:子宫内膜;蛋白质类;妊娠
山西医科大学学报990106 摘要 为进一步阐明着床的分子机制,为生育的控制和不孕症的治疗提供新的实验基础,利用十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)及银染法对正常人增殖期(PP)、分泌期(SP)、以及尽可能接近于着床期(早早孕期)包括二级绒毛期(SVP)和三级绒毛期(TVP)的子宫内膜蛋白质进行了研究,结果发现:子宫内膜水溶性蛋白质于增殖期含量最高,增殖期后降低,存在显著性差异(P<0.05),而十二烷基硫酸钠(SDS)溶解蛋白在各个功能时期无显著性差异(P>0.05);早早孕期人子宫蜕膜蛋白质有阶段特异性变化,有45.7千道尔顿(kD)阶段特异性蛋白出现。其确切的功能以及在胚泡着床过程中的作用均待进一步阐明。
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中图号 R318.02 Q73
Changes of human endometrium proteins in very early pregnancy
Wang Jianhua, Zhu Zhengmei, Cui Zhaochun, et al
(Dept. of Biochemistry,Fenyang Medical College, Shanxi Medical University,Fenyang 032200)
Abstract To elucidate the molecular mechanism of implantation,and provide the experimental bases for birth control and treatment of infertility,biochemical methods including SDS-PAGE and silver staining were employed to study the proteins of human endometria in proliferative phase (PP),secretory phase (PP),pregnancy less than 5 weeks (secondary villus phase,SVP),and pregnancy 5~6 weeks (tertiary villus phase,TVP).Results showed that the water soluble proteins decreased from PP to other three phases,there was statistical significance between SP and other three phases (P<0.05)but as for SDS soluble proteins there was no significance(P>0.05);the SDS-PAGE patterns of human endometrium proteins displayed a 45.7 kD stage-specific protein which only appeared in very early pregnancy.The nature and function of this stage-specific protein deserve further investigation.
, 百拇医药
Key words endometrium; proteins; pregnancy
哺乳动物的受精卵,从输卵管运行至子宫,并向母体传递进入子宫的信息,使胚泡的发育与子宫为它着床作准备达到同步化,从而使胚泡顺利地完成着床过程。胚泡发出的信息究竟是什么,母体子宫的主要准备是什么,这是许多研究者所关心的问题。近年来发现胚泡本身及子宫内膜合成的蛋白质和小分子肽类在着床过程中起重要的作用[1]。对于着床期子宫内膜蛋白质的报道较多,但大部分实验以兔和鼠为研究对象,如Anderson等[2]利用兔为研究对象发现着床期兔子宫内膜蛋白质发生阶段特异性变化。但对于人早早孕期子宫蜕膜蛋白质的变化,还未见报道。本文以正常人子宫内膜为材料,对子宫内膜水溶性蛋白和SDS溶解蛋白进行了电泳谱的分析以及含量的比较,以期观察早早孕期人子宫蜕膜蛋白质的变化规律,进一步阐明着床的分子机理,并希望为研究抗着床免疫避孕以及不孕症的治疗提供实验基础。
, 百拇医药 1 材料
1.1 主要试剂 Acryl、Gly、SDS、TEMED、β-巯基乙醇(美国Sigma公司);Bis(瑞士Fluka公司);SDS(上海生化所中华生化公司);PMSF(中科院上海生化研究所东风生化技术公司;硝酸银(北京化工厂)。
1.2 主要仪器 V16-垂直板电泳槽(上海市科学器材公司);高速冷冻离心机(日本Hitachi公司)。
2 方法
2.1 标本来源 取医院计划生育门诊人流术后新鲜的子宫蜕膜(按末次月经起停经6 周之内的早早孕子宫蜕膜),同时取其绒毛。正常子宫内膜取自育龄妇女良性子宫肌瘤手术切除标本。
2.2 标本鉴定 将绒毛、正常子宫内膜标本用生理盐水洗净后,放入Bouin固定液中固定,12~24 h后制成蜡块,做石蜡切片。HE染色光镜下观察绒毛以确定是否为二级绒毛或三级绒毛;观察子宫内膜确定为增殖期或分泌期。
, 百拇医药
2.3 内膜蛋白的提取 取子宫内膜标本,滤纸吸干水份,称重。冰浴中加适量磷酸盐缓冲液(含1 mmol PMSF)(pH=7.2),充分匀浆,500 r/min离心5 min,弃沉淀。上清4℃、10 000 r/min离心30 min,得到的上清为子宫内膜水溶性蛋白,沉淀加适量磷酸盐缓冲液(含十二烷基硫酸钠),10 000 r/min离心10 min,弃沉淀,上清即为内膜SDS溶解蛋白。
2.4 Hartree法测定提取液(水溶性蛋白及SDS溶解蛋白)中蛋白质的浓度。将各种不同功能时期水溶性蛋白和SDS溶解蛋白进行统计学处理(用方差分析和q检验法进行)。
2.5 电泳[3] 将子宫内膜水溶性蛋白以及SDS溶解蛋白进行SDS-PAGE分析。电泳约5 h。
2.6 银染色法染色[4]。
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3 结果
3.1 人子宫内膜蛋白质含量的比较 比较不同功能时期人子宫内膜提取液中蛋白质的含量,发现子宫内膜水溶性蛋白于增殖期含量最高,与分泌期、二级绒毛期、三级绒毛期相比P<0.05;但二级绒毛期与三级绒毛期相比无显著性差异(P>0.05)子宫内膜SDS溶解蛋白其含量在四个不同功能时期的差异无显著性意义(P>0.05,见表1、2)。
表1 各种不同功能时期子宫内膜水溶性蛋白质含量的比较 子宫内膜
编组
n
水溶性蛋白质
(mg/g湿重)
对比组
, 百拇医药
P
(q检验)±s
增殖期
A
3
32.39±3.05
A—B
<0.01
分泌期
B
3
19.79±0.44
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A—C
<0.05
二级绒毛期
C
3
24.77±6.51
A—D
<0.01
B—C
>0.05
三级绒毛期
D
4
, 百拇医药
17.15±3.23
B—D
>0.05
C—D
>0.05
方差分析F=9.794 P<0.01表2 各种不同功能时期子宫内膜SDS溶解蛋白质含量的比较 子宫内膜
n
SDS溶解蛋白质
(mg/g湿重)
F(方差分析)
P±s
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增殖期
3
4.83±0.45
分泌期
3
5.04±0.08
2.484
>0.05
二级绒毛期
3
6.63±1.92
三级绒毛期
4
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4.24±1.23
3.2 SDS-PAGE电泳谱的比较 SDS-PAGE电泳谱结果见图1、2。与增殖期、分泌期样品相比,早早孕期样品中SDS溶解部分有阶段特异性蛋白出现,分子量为45.7kD;水溶性部分未见特异性条带出现。
图1 人子宫内膜水溶性蛋白质SDS-PAGE图
谱(银染法,每种样品蛋白质上样量为20μg)
图2 人子宫内膜SDS溶解蛋白质SDS-PAGE
图谱(银染法,每种样品蛋白质上样量为20μg)
, 百拇医药
4 讨论
胚泡着床是建立妊娠的第一步,近年来,人们对影响胚泡着床的相关因素作了大量的研究,尤其母体和胚胎之间的适应性反应,在胚泡和子宫内膜之间许多已知和未知的物质信息传递是着床的关键,其中蛋白质、肽及酶类在着床过程中起着很重要的作用,迄今,胚泡着床的生化机制尚不十分清楚[5]。本文利用SDS-PAGE的高分辨率以及银染法的高灵敏度对人子宫内膜蛋白质进行了研究。从表1、2可以看出,由增殖期到分泌期、早早孕期,子宫内膜水溶性部分蛋白质含量减少。SDS溶解蛋白则无显著性变化。由于水溶性部分主要代表子宫内膜的胞浆蛋白,因此,实验所得的结果与Bell等[6]的结果相一致。这种变化与雌、孕激素的调节有关。在增殖期,子宫内膜在雌激素的作用下,蛋白质合成增加,致使细胞内蛋白质含量增加;在分泌期及早早孕期,由于雌、孕激素的作用,使细胞内蛋白质的合成、分泌均增加,最终导致子宫内膜细胞内蛋白质含量减少。对于着床期子宫内膜蛋白质的报道较多,但大部分实验均以兔和鼠为研究对象,而对早孕人子宫内膜的研究多集中于子宫腔液的分泌蛋白,对子宫内膜上皮细胞膜蛋白(尤早早孕期)的研究尚未见报道。到目前为止,从动物及人子宫中已发现40多种分泌性“妊娠相关蛋白”,如在早孕人子宫液中发现的孕激素相关/依赖性子宫内膜蛋白,其分子量为47~48kD,等电点为4.9,为早孕人子宫内膜腺体产生并分泌到宫腔及血液中的蛋白质,但由于研究者各自所采用的分离手段及检测方法的不同,各结果间的比较及归类尚难统一。对这些蛋白的研究目前还主要停留在分离、纯化及鉴定上,对其功能的研究还十分有限。比较人、兔[2]子宫内膜蛋白质电泳谱,我们发现人、兔子宫内膜有类似的情况,即妊娠期出现了阶段特异性蛋白质,在我们的实验中,发现该蛋白质分子量为45.7kD(与兔阶段特异性蛋白质的分子量不同),为妊娠期所特有的蛋白质。由于增殖期和分泌期均不存在胚泡,该蛋白的出现与胚泡着床直接相关,推测它在着床过程中起十分重要的作用,有可能该蛋白质在着床期胚泡与子宫内膜相互识别、粘附等过程中起重要的作用,也可能在早早孕期对胚胎有保护作用。该蛋白质的合成可能是由于胚泡游离在子宫时产生一种作为信息的特殊物质,当它被子宫内膜的特异受体接受后,使其相应的基因开放或解除了转录和翻译等过程中的抑制作用,从而合成了该妊娠特异性蛋白质。这些解释以及该蛋白的确切功能均待进一步探索。
, 百拇医药
参考文献
1 郭尧君,曹泳清,文镜.妊娠和假孕兔子宫内膜等电聚焦分析.生殖与避孕,1985,5(3):17~21
2 Anderson TL,Olson GE,Hoffman LH.Stage-specific alterations in the apical membrane glycoproteins of endometrial epithelial cells related to implantation in rabbits.Biol Reprod, 1986, 34: 701~720
3 Laemmli UK.Cleavage of structural proteins during assembly of the bacteriophage T4.Nature, 1970, 227: 680~683
, 百拇医药
4 凌俊.介绍一种快速灵敏的银染方法.生物化学与生物物理进展,1990,17(5):407
5 黄荷风,毛愉燕,石一复,等.胚泡着床及相关因素.国外医学计划生育分册,1996,15(2): 90~94
6 Bell SC,Hales MW,Patel S,et al.Protein synthesis and secretion by the human endometrium and decidua during early pregnancy.Br J Obstet Gynaecol,1985,92:793~803
[1998-07-10收稿], 百拇医药