AT1R基因和ACE基因多态性与高血压病的相关性分析
作者：余惠珍 白玉茹 陈慧 伍严安 胡锡衷
单位：余惠珍：福建省立医院二内科第15区 白玉茹，陈慧，胡锡衷：福建省心血管病研究所；伍严安：福建省省立医院检验科 福州 350001
关键词：血管紧张素Ⅱ1型受体基因；血管紧张素转化酶基因；多态性；高血压病。
高血压杂志990413
摘要 目的:本研究旨在探讨中国人血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)基因和血管紧张素转化酶(ACE)基因与高血压病(EH)的相关情况，以及两种基因在发病中的相互关系。
方法:以137例EH患者(其中Ⅱ,Ⅲ期89例)和63例健康人为对象，用PCR/DdeI酶解检测位于AT1R基因3'-UTR的A1166C突变，并用PCR检测ACE基因内含子16的插入/缺失(I/D)多态性标记。
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结果：(1)EH组的AT1R基因的AC基因型和C等位基因频率明显高于对照组(AC基因型 0.23 vs 0.09,P<0.05;C等位基因 0.13 vs 0.05,P<0.05),尤其EH(Ⅱ,Ⅲ)组显著高于对照组(P<0.01)；(2)EH组的ACE基因的DD基因型及D等位基因频率与对照组比较无明显差别P>0.05)，但EH(Ⅱ,Ⅲ)组的DD基因型及D等位基因频率却显著高于对照组(P<0.01)；(3)AT1R基因和ACE基因的多态性对EH的影响作用可能独立于年龄、BMI、血压、血脂以及血浆PRA和AngⅡ水平;(4)EH及EH(Ⅱ,Ⅲ)患者的AT1R基因型和ACE型基因组成联合基因型的频率分布与对照组比较无统计学差异(P>0.05);提示这两基因多态性对EH的发生发展可能无协同效应。
结论：(1)AT1R基因A1166C多态性是EH发病的独立危险因素，可能参与EH发生及其靶器官损害的过程；(2)ACE基因I/D多态性与EH发生无关，而与EH并发症呈明显相关，可能参与EH靶器官损害过程。
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要点：本文同时检测ACE基因第16内含子的I/D多态性和AT1R基因3’非翻译区A1166C多态性；结果高血压患者DD和D等位频率高，A1166C中AC型的C等位频率高，但考查两种联合频率和高血压之间的关系都未达到有统计学的意义的协同作用水平。
中图分类号：R544.1;Q753 文献标识码：A
文章编号：1006-2866(1999)04-0319-04
Association Between Polymorphisms of the Angiotensin Ⅱ Type 1 Receptor Gene, Angiotensin Converting Enzyme Gene in Human Essential Hypertension
YU Huizhen1，BAI Yuru2,CHEN Hui2,et al
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(1. The Second Department of Internal Medicine ,Fujian Provincial Hospital; 2. Fujian Cardiovascular Disease Institute , Fuzhou, 350001.)
ABSTRACT Objective:To investigate the relationship of polymorphism of angiotensin Ⅱ type 1 receptor(AT1R) gene and angiotensin converting enzyme(ACE) gene in human essential hypertension (EH) in Chinese.
Methods:137 EH(89 cases in stageⅡ，Ⅲ and 63 normal controls were examined for the A1166C variation at the 3'-untranslated region(3'-UTR) of AT1R gene by DdeI restriction endonuclease digestion and PCR methods. The insertion/deletion polymorphism at the intron 16 of ACE gene was monitored by restriction enzyme digestion and PCR.
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Results：(1) The frequencies of AC genotype and C alleles of AT1R A1166C polymorphism showed significant difference between hypertentives and controls(AC genotype is 0.23 vs 0.09, P<0.05;allele C is 0.13 vs 0.05, P<0.05)；(2)The frequencies of DD genotype and D alleles in EH stage Ⅱ，Ⅲ group were noticeably greater than in controls (P<0.01);(3) The analysis of individual combined genotypes of AT1R gene and ACE gene showed no difference in frequency distribution on patients with EH and EH(ⅡⅢ)compared with controls (P>0.05).
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Conclusion：(1)The A1166C polymorphism of AT1R gene may be involved in the occurrence and development of EH, and is an independent risk factor for EH in Chinese;(2)The DD genotype of ACE gene is associated with EH with target organ damages;(3)The influence of AT1R gene and ACE gene on EH may be weakly influence on the circulating renin angiotensin system(RAS),and were independent of age,BMI, blood pressure and metalolic parameters;(4) There is no synergistic effects between the polymorphism of AT1R gene and ACE gene.
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key words: Angiotensin Ⅱ type 1 receptor gene; Angiotensin converting enzyme gene; polymorphism; essential hypertension.
肾素-血管紧张素系统(RAS)是体内调节血压和水电质平衡的主要系统。该系统通过一系列酶促反应，最终发挥生理效应的物质为血管紧张素Ⅱ(AngⅡ),AngⅡ生理功能主要是通过血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R )来完成的。近年来国外有学者研究表明AT1R 基因第1166位点上硷基突变，即A1166C多态性与白种人高血压病有相关[1]。目前有关血管紧张素Ⅱ转化酶(ACE)基因多态性与高血压病关系的结论颇不一致[2]。晚近多基因变异产生相互作用的研究，成为人们探讨多因素疾病的关心问题。本研究旨在探讨中国人群中AT1R基因和ACE基因的多态性与高血压病的相关情况，并分析这两基因间的相互作用。
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MATERIALS AND METHODS
1 对象：137例原发性高血压(EH)患者来自福建省立医院心内科就诊的病人，按WHO诊断标准，Ⅰ期48例、Ⅱ期53例、Ⅲ期36例，男性87例、女50例，平均年龄57.48±10.62岁，其中74例有高血压家族史[EH+FH(+)]，高血压家族史定义为父母有一方或者同胞兄弟姐妹中至少有一位患高血压病。63例正常对照(controls)，来自福建地区体检的随机无关个体，男性41例，女性22例，平均年龄56.93±12.87岁。收缩压(SBP)<140mmHg,舒张压(DBP)<90mmHg，家族中一级亲属没有EH病史，排除糖尿病及其它心血管系统疾病。
2 基因检测:
2.1 AT1R-A1166C变异检测: 取4 ml 静脉血常规分离白细胞和酚氯抽提DNA。A1166C变异位于3'非编码区(3'-UTR)，该变异导致限制性内切酶DdeI位点出现，可应用PCR扩增局部片段后并用DdeI水解。PCR反应引物序列:
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上游引物5'ATA ATG TAA GCT CAT CCACC-3'
下游引物5'GAG ATT GCA TTT CTG TCA GT-3'
PCR反应条件，初期93℃5分钟变性后进行33个循环，每个循环中93℃ 40 s、57℃ 40 s、72℃ 1 min，最后72℃延伸10 min。反应产物经纯化后于37℃恒温水浴箱中用DdeI酶切3～4小时，以2.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下鉴定基因型：若两个等位基因上均含有内切酶识别位点，酶切后产生210 bp和140 bp，则定义为CC型；酶切后产生350 bp、210 bp和140 bp三条带、则定义为AC型；若不含酶切位点，只有一种350 bp片段则定义为AA型。(见Fig 1)
图1 AT1R基因A1166C分子变异的基因型
, http://www.100md.com Fig 1 Genotype of angiotensin Ⅱ type 1 receptor gene A1166C variation
1:DNA marker (50 bp～1000 bp); 2: CC genotype; 3～4: AC genotype; 5～7:AA genotype.
2.2 ACE-插入/缺失(I/D)多态性检测：ACE基因第16内含子上的Alu片段呈I/D多态性,详细方法检测见[3],基因分型见Fig 2。
图2 ACE基因 I/D 多态性的基因型
Fig 2 Genotype of angiotensin Ⅰ converting enzyme gene I/D polymorphism
1,7:ID genotype; 2, 4, 6:DD genotype; 3,5:II genotype; 8:DNA marker (50 bp～1000 bp)
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3 临床表型分析:
3.1 血压、BMI(体重/身高2)
3.2 糖脂代谢：空腹10小时以上取静脉血测定:空腹血糖、总胆固醇 甘油三脂以及高密度脂蛋白等。
3.3 血浆肾素(RA)和血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)的水平测定：取4 ml静脉血，注入含有ACE酶抑制剂的抗凝管，分离血浆，置-70℃冰箱，应用放免法测定血浆RA浓度和AngⅡ活性水平。
4 统计方法：用SPSS统计软件处理数据：各临床参数于三组间及两种基因的不同基因型间比较采用ANOVA分析方法，计量数据结果用均数±标准差表示，基因型及等位基因频率分布采用卡方检验和Fisher精确概率法，相关因素参与发病的独立性，应用logistic逐步回归分析。显著性水平P=0.05。
, 百拇医药 RESULTS
1 EH组与对照组临床及生化特征比较见表1
表 1 EH组与对照组临床及生化特征比较
Tab 1 The general clinical and biochemical characteristics in EH group and controls
Controls
EH
n
63
137
Sex(M/F)
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41/22
87/50
Age(yrs)
56.93±12.87
57.48±10.62
BMI(kg/m2)
23.47±3.27
24.15±3.1
TC(mmol/L)
4.81±0.82
5.10±1.02
, http://www.100md.com TG(mmol/L)
1.11±0.59
1.45±0.95*
HDL(mmol/L)
1.29±0.34
1.22±0.32
Glu(mmol/L)
4.8±0.63
5.13±0.78*
SBP(mmHg)
120±15.68
, 百拇医药
161±14.83
DBP(mmHg)
77±8.93
98±7.24
RA(ng.ml-1/h)
1.17±0.79
1.26±0.84
AngⅡ(pg/ml)
133.12±52.41
138.32±68.45
*:P<0.05 vs control
, 百拇医药
由表1可见EH组的TG，Glu显著高于对照组(P<0.05)，其余生化检查无明显差异。
2 AT1R基因A1166C多态性在对照组与EH各组中的比较情况: 由于对照组无CC基因型，EH+FH(+)组和EH+FH(-)组各一例，计算时归入AC型组。AT1R基因多态性在EH各组与对照组间比较，见表2。
表2 EH各组与对照组的AT1R基因型及等位基因频率分布比较
Tab 2 The comparison of the frequency distribution of AT1R gene among different EH group and controls Groups
Genetype
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Allele
AA
AC
A
C
Control(n=63)
57(0.91)
6(0.09)
120(0.95)
6(0.05)
EH(n=137)
106(0.77)
, 百拇医药
31(0.23)*
241(0.87)
33(0.13)*
EH+FH(+)(n=74)
56(0.76)
18(0.24)*
129(0.87)
19(0.13)*
EH+FH(-)(n=63)
50(0.79)
, 百拇医药 13(0.21)
112(0.89)
14(0.11)
EH(ⅡⅢ)(n=89)
65(0.73)
24(0.27)**
152(0.85)
26(0.15)**
EH(Ⅰ)(n=48)
41(0.85)
7(0.15)
, 百拇医药
89(0.93)
7(0.07)
*:P<0.05,**:P<0.01 vs controls
EH组、EH+FH(+)组的AC基因型及C等位基因频率显著高于对照组(P<0.05)，EH(ⅡⅢ)组的AC基因及C等位基因频率极显著高于对照组(P<0.01)，EH+FH(-)组和EH(Ⅰ)组的AC基因型及C等位基因频率与对照组间的差别无统计学意义。
3 EH各组与对照组的ACE基因型及等位基因频率的分布比较，见表3。
EH组、EH+FH(+)组的DD基因型及D等位基因频率与对照组比较无显著性差别(P>0.05)；EH(Ⅱ,Ⅲ)组的DD基因型及D等位基因频率均显著高于对照组(genotype P<0.05,allele P<0.01)。
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表3 EH各组与对照组的ACE基因型及等位基因分布比较
Tab 3 The comparison of the frequency distribution of ACE gene among different EH group and controls Groups(n)
Genotype
Allele
II
ID
DD
I
D
Controls(n=63)
, 百拇医药
24(0.38)
25(0.40)
14(0.22)
73(0.58)
53(0.42)
EH(n=137)
43(0.31)
50(0.37)
44(0.32)
136(0.50)
138(0.50)
EH+FH(+)(n=74)
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22(0.30)
27(0.36)
25(0.34)
71(0.48)
77(0.52)
EH(Ⅱ、Ⅲ)(n=89)
19(0.21)
38(0.43)
32(0.36)*
76(0.43)
102(0.57)**
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*:P<0.05,**: P<0.01,vs controls
4 风险因素独立性分析: EH组与对照组进行临床表型单变量比较发现：在一般临床参数中仅有SBP，DBP，TG，Glu参数有明显差异，其余参数比较无显著性差异；EH组和对照组的AT1R基因多态性比较，AC基因型频率有明显差异。以这些有显著差异变量以及AT1R基因型为自变量，EH为分类变量，进行logistic逐步回归，经逐步选择分析，TG(P=0.023)，Glu(P=0.0013)、AT1R基因的AC基因型(P=0.033)为独立变异因素。
5 AT1R基因和ACE基因的多态性间与EH组和EH(Ⅱ,Ⅲ)组的相互关系: 从以上结果可知，AT1R基因、ACE基因的多态性与EH、EH(Ⅱ,Ⅲ)有相关性，尤其与EH(Ⅱ,Ⅲ期)患者关系密切，为观察这两个基因在参与EH及其并发症时的相互关系，以每个个体的AT1R的基因型(AA型或AC型)与ACE基因的基因型构成个体联合基因型，观察各病例组与对照组间的联合基因型频率分布；结果显示：与AA型组合的ACE基因型频率在各病例组与对照组间比较无显著差异(P<0.05)。与AC型组合的ACE基因型频率中，EH组、EH(Ⅱ,Ⅲ)组的AC+DD频率虽高于对照组，但尚未达到统计学差异(P>0.05)，见表4。
, 百拇医药
表4 病例组和对照组的AT1R基因型和ACE基因型分布
Tab 4 Distribution of ACE genotype in cases and controls according to AT1R genotype AT1R
groups(n)
ACE genotype
DD
ID
II
AA
EH(n=106)
, 百拇医药
33(0.31)
38(0.36)
35(0.33)
EH(Ⅱ，Ⅲ)(n=65)
25(0.38)
26(0.42)
14(0.22)
Control(n=57)
13(0.23)
22(0.39)
22(0.39)
AC
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EH(n=31)
11(0.35)
12(0.39)
8(0.26)
EH(Ⅱ，Ⅲ)(n=24)
7(0.29)
12(0.50)
5(0.21)
Control(n=6)
1(0.17)
3(0.50)
2(0.33)
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6 EH患者AT1R-A1166C变异和ACE-I/D多态性与临床表型的关系：在对照组和EH组内的AT1R基因型间或ACE基因型间的年龄、性别、BMI、SBP、DBP、血糖血脂以及PRA、AngⅡ活性水平比较，差别均无统计学意义。
DISCUSSION
原发性高血压为多基因遗传疾病，RAS在EH发生中的意义已为人们成共识，因此RAS中各组分的基因变异均可能成为EH的候选基因。本文着重分析与AngⅡ产生和发挥作用密切相关的两个组分,即AT1R和ACE基因多态性与高血压及其并发症的相关性，并探讨其可能的发病机制。
1 本研究结果发现,EH患者的AC基因型及C等位基因频率都明显高于对照组,提示AT1R基因多态性与EH发生有关,logistic回归也证实是高血压发生的独立危险因素,与Bonnardeaux[1],Wang[4]结论相符，认为AT1R基因是EH的候选基因。AT1R基因多态性与高血压伴家族史患者有关，而与无家族史者无关，这可能与高血压家族史的遗传易感性有关。由于高血压患者常伴发心、脑、肾等靶器官损害，因而有必要对高血压患者进行分期探讨。本研究将EH组分为Ⅰ期和ⅡⅢ期两组，发现EH(Ⅱ，Ⅲ)组的AC基因型(0.24)及C等位基因(0.13)显著高于对照组(0.09，0.05)，Ⅰ期EH患者与对照组间比较无明显差别。日本学者Takami[5]认为AT1R基因A1166C多态性可能参与高血压患者左室肥厚形成，Benetos[6]认为该多态性与高血压患者的动脉硬化形成有密切相关。这些都提示了AT1R基因的C等位基因与EH并发症关系密切。目前国内尚未见到有关AT1R基因与中国人高血压并发症关系报导，究竟与哪种、两种或两种以上的靶器官损害更具有遗传易感?值得进一步的研究探讨。
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2 ACE基因多态性与EH及其并发症的关系: 有研究表明血浆和组织ACE水平与ACE的D等位基因明显相关[7]，ACE是生成AngⅡ的重要转化酶，理论上推测ACE基因I/D多态性与EH发病有密切关系，但近年来的研究结论颇不一致。其相互冲突最主要的是对照组中的ACE等位基因频率的差异。本研究中，对照组中D和I等位基因频率为0.42和0.58不同于morise[8]报道的0.68和0.32，而与白种人0.4和0.6相近[9]。目前认为ACE基因多态性和EH发病的关系上有种族地区的差异：如D等位基因与黑人密切相关，与白种人和黄种人无关；与美洲非裔有关，与亚洲人和澳洲人相关不明显。
尽管ACE基因多态性与高血压病发生的关系尚不能肯定，但近年来研究表明，ACE基因多态性与高血压合并症，如左室肥厚[10]，缺血性脑病[3]等有相关性。本文将EH患者分期后，发现Ⅱ、Ⅲ期EH患者的DD基因型及D等位基因频率(0.40和0.57)显著高于对照组(0.22和0.42)，提示ACE基因I/D多态性虽与高血压病发生无关，但可能是高血压并发症的独立危险因素，参与EH发展过程。
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3 AT1R和ACE基因多态性间的相互关系:1995年Aroon[11]等研究认为AT1R 基因和ACE基因多态性间对EH患者血压水平有协同效应。目前国内尚未见到有关基因间相互作用的报道。本研究显示，EH和EH(Ⅱ,Ⅲ)组中的AC+DD频率(分别0.35，0.29)高于对照组(0.17)，但没有达到统计学差异；提示AT1R和ACE基因多态性间与EH、EH(Ⅱ，Ⅲ)无明显相互关系，可能对EH及其靶器官损害不产生协同效应。这可能与中国人群中的AT1R基因的CC基因型很少，C等位基因频率(10%),明显低于白种人(31%),可能与A1166C低突变率有关。疾病在种族间存在明显差异。
综上所述, AT1R基因A1166C变异可能参与EH发生, AT1R和ACE基因I/D多态性可能参与EH靶器官损害的形成过程.然而,有关这两个基因参与发病的具体机制目前尚不清楚。本实验中各临床参数比较结果，发现年龄、BMI、血压、生化指标以及血浆RA和AngⅡ在AT1R基因型间或ACE基因型间比较均无明显差别，提示AT1R和ACE基因多态性对EH及其并发症的影响作用可能并非通过血压和糖脂代谢以及循环RAS等途径来完成的，与以往报道相一致[12，13]。 AT1R基因A1166C变异位于3’端非编码区内，理论上不影响AT1R蛋白质编码过程。但如果与邻近有功能变异的染色体位置呈连锁不平衡，可能影响AT1R基因的mRNA表达稳定性，引起AT1R数目、分布密度以及AT1R对AngⅡ亲和力等改变，增强AngⅡ反应性进而促使EH发生发展。 因而，有必要检测局部组织RAS中的ACE、RA、AT2水平，深入研究AT1R基因的中间表型(intermediat phenotype)，进一步寻找与AT1R-A1166C多态性有连锁不平衡的变异位点。近年来的研究表明，不同AT1R基因型或ACE基因型患者对ACEI在降压、减轻动脉硬化等疗效上存在显著差异：AC型者比AA型者效果好[14]，DD型者比ID或II型者效果好[15]。结合本研究结果，笔者认为对EH患者进行AT1R和ACE基因型检测，对降压药物选择具有一定的参考价值，从而使治疗个体化、有效化，也可能为进一步开发和研制新一代疗效更好、个体针对性更强的ACEI类制剂提供一定理论依据。
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福建省卫生厅科研资助项目(96011)
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4 Wang WYS,Zee RYL,Morris BJ. Association of angiotensin Ⅱ type 1 recepter gene polymorphism with essential hypertension[J] Clin Genet 1997;51:31-34
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收稿日期：1998-09-20, 百拇医药
单位：余惠珍：福建省立医院二内科第15区 白玉茹，陈慧，胡锡衷：福建省心血管病研究所；伍严安：福建省省立医院检验科 福州 350001
关键词：血管紧张素Ⅱ1型受体基因；血管紧张素转化酶基因；多态性；高血压病。
高血压杂志990413
摘要 目的:本研究旨在探讨中国人血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R)基因和血管紧张素转化酶(ACE)基因与高血压病(EH)的相关情况，以及两种基因在发病中的相互关系。
方法:以137例EH患者(其中Ⅱ,Ⅲ期89例)和63例健康人为对象，用PCR/DdeI酶解检测位于AT1R基因3'-UTR的A1166C突变，并用PCR检测ACE基因内含子16的插入/缺失(I/D)多态性标记。
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结果：(1)EH组的AT1R基因的AC基因型和C等位基因频率明显高于对照组(AC基因型 0.23 vs 0.09,P<0.05;C等位基因 0.13 vs 0.05,P<0.05),尤其EH(Ⅱ,Ⅲ)组显著高于对照组(P<0.01)；(2)EH组的ACE基因的DD基因型及D等位基因频率与对照组比较无明显差别P>0.05)，但EH(Ⅱ,Ⅲ)组的DD基因型及D等位基因频率却显著高于对照组(P<0.01)；(3)AT1R基因和ACE基因的多态性对EH的影响作用可能独立于年龄、BMI、血压、血脂以及血浆PRA和AngⅡ水平;(4)EH及EH(Ⅱ,Ⅲ)患者的AT1R基因型和ACE型基因组成联合基因型的频率分布与对照组比较无统计学差异(P>0.05);提示这两基因多态性对EH的发生发展可能无协同效应。
结论：(1)AT1R基因A1166C多态性是EH发病的独立危险因素，可能参与EH发生及其靶器官损害的过程；(2)ACE基因I/D多态性与EH发生无关，而与EH并发症呈明显相关，可能参与EH靶器官损害过程。
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要点：本文同时检测ACE基因第16内含子的I/D多态性和AT1R基因3’非翻译区A1166C多态性；结果高血压患者DD和D等位频率高，A1166C中AC型的C等位频率高，但考查两种联合频率和高血压之间的关系都未达到有统计学的意义的协同作用水平。
中图分类号：R544.1;Q753 文献标识码：A
文章编号：1006-2866(1999)04-0319-04
Association Between Polymorphisms of the Angiotensin Ⅱ Type 1 Receptor Gene, Angiotensin Converting Enzyme Gene in Human Essential Hypertension
YU Huizhen1，BAI Yuru2,CHEN Hui2,et al
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(1. The Second Department of Internal Medicine ,Fujian Provincial Hospital; 2. Fujian Cardiovascular Disease Institute , Fuzhou, 350001.)
ABSTRACT Objective:To investigate the relationship of polymorphism of angiotensin Ⅱ type 1 receptor(AT1R) gene and angiotensin converting enzyme(ACE) gene in human essential hypertension (EH) in Chinese.
Methods:137 EH(89 cases in stageⅡ，Ⅲ and 63 normal controls were examined for the A1166C variation at the 3'-untranslated region(3'-UTR) of AT1R gene by DdeI restriction endonuclease digestion and PCR methods. The insertion/deletion polymorphism at the intron 16 of ACE gene was monitored by restriction enzyme digestion and PCR.
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Results：(1) The frequencies of AC genotype and C alleles of AT1R A1166C polymorphism showed significant difference between hypertentives and controls(AC genotype is 0.23 vs 0.09, P<0.05;allele C is 0.13 vs 0.05, P<0.05)；(2)The frequencies of DD genotype and D alleles in EH stage Ⅱ，Ⅲ group were noticeably greater than in controls (P<0.01);(3) The analysis of individual combined genotypes of AT1R gene and ACE gene showed no difference in frequency distribution on patients with EH and EH(ⅡⅢ)compared with controls (P>0.05).
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Conclusion：(1)The A1166C polymorphism of AT1R gene may be involved in the occurrence and development of EH, and is an independent risk factor for EH in Chinese;(2)The DD genotype of ACE gene is associated with EH with target organ damages;(3)The influence of AT1R gene and ACE gene on EH may be weakly influence on the circulating renin angiotensin system(RAS),and were independent of age,BMI, blood pressure and metalolic parameters;(4) There is no synergistic effects between the polymorphism of AT1R gene and ACE gene.
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key words: Angiotensin Ⅱ type 1 receptor gene; Angiotensin converting enzyme gene; polymorphism; essential hypertension.
肾素-血管紧张素系统(RAS)是体内调节血压和水电质平衡的主要系统。该系统通过一系列酶促反应，最终发挥生理效应的物质为血管紧张素Ⅱ(AngⅡ),AngⅡ生理功能主要是通过血管紧张素Ⅱ1型受体(AT1R )来完成的。近年来国外有学者研究表明AT1R 基因第1166位点上硷基突变，即A1166C多态性与白种人高血压病有相关[1]。目前有关血管紧张素Ⅱ转化酶(ACE)基因多态性与高血压病关系的结论颇不一致[2]。晚近多基因变异产生相互作用的研究，成为人们探讨多因素疾病的关心问题。本研究旨在探讨中国人群中AT1R基因和ACE基因的多态性与高血压病的相关情况，并分析这两基因间的相互作用。
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MATERIALS AND METHODS
1 对象：137例原发性高血压(EH)患者来自福建省立医院心内科就诊的病人，按WHO诊断标准，Ⅰ期48例、Ⅱ期53例、Ⅲ期36例，男性87例、女50例，平均年龄57.48±10.62岁，其中74例有高血压家族史[EH+FH(+)]，高血压家族史定义为父母有一方或者同胞兄弟姐妹中至少有一位患高血压病。63例正常对照(controls)，来自福建地区体检的随机无关个体，男性41例，女性22例，平均年龄56.93±12.87岁。收缩压(SBP)<140mmHg,舒张压(DBP)<90mmHg，家族中一级亲属没有EH病史，排除糖尿病及其它心血管系统疾病。
2 基因检测:
2.1 AT1R-A1166C变异检测: 取4 ml 静脉血常规分离白细胞和酚氯抽提DNA。A1166C变异位于3'非编码区(3'-UTR)，该变异导致限制性内切酶DdeI位点出现，可应用PCR扩增局部片段后并用DdeI水解。PCR反应引物序列:
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上游引物5'ATA ATG TAA GCT CAT CCACC-3'
下游引物5'GAG ATT GCA TTT CTG TCA GT-3'
PCR反应条件，初期93℃5分钟变性后进行33个循环，每个循环中93℃ 40 s、57℃ 40 s、72℃ 1 min，最后72℃延伸10 min。反应产物经纯化后于37℃恒温水浴箱中用DdeI酶切3～4小时，以2.5%琼脂糖凝胶电泳，溴化乙锭染色，紫外灯下鉴定基因型：若两个等位基因上均含有内切酶识别位点，酶切后产生210 bp和140 bp，则定义为CC型；酶切后产生350 bp、210 bp和140 bp三条带、则定义为AC型；若不含酶切位点，只有一种350 bp片段则定义为AA型。(见Fig 1)
图1 AT1R基因A1166C分子变异的基因型
, http://www.100md.com Fig 1 Genotype of angiotensin Ⅱ type 1 receptor gene A1166C variation
1:DNA marker (50 bp～1000 bp); 2: CC genotype; 3～4: AC genotype; 5～7:AA genotype.
2.2 ACE-插入/缺失(I/D)多态性检测：ACE基因第16内含子上的Alu片段呈I/D多态性,详细方法检测见[3],基因分型见Fig 2。
图2 ACE基因 I/D 多态性的基因型
Fig 2 Genotype of angiotensin Ⅰ converting enzyme gene I/D polymorphism
1,7:ID genotype; 2, 4, 6:DD genotype; 3,5:II genotype; 8:DNA marker (50 bp～1000 bp)
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3 临床表型分析:
3.1 血压、BMI(体重/身高2)
3.2 糖脂代谢：空腹10小时以上取静脉血测定:空腹血糖、总胆固醇 甘油三脂以及高密度脂蛋白等。
3.3 血浆肾素(RA)和血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)的水平测定：取4 ml静脉血，注入含有ACE酶抑制剂的抗凝管，分离血浆，置-70℃冰箱，应用放免法测定血浆RA浓度和AngⅡ活性水平。
4 统计方法：用SPSS统计软件处理数据：各临床参数于三组间及两种基因的不同基因型间比较采用ANOVA分析方法，计量数据结果用均数±标准差表示，基因型及等位基因频率分布采用卡方检验和Fisher精确概率法，相关因素参与发病的独立性，应用logistic逐步回归分析。显著性水平P=0.05。
, 百拇医药 RESULTS
1 EH组与对照组临床及生化特征比较见表1
表 1 EH组与对照组临床及生化特征比较
Tab 1 The general clinical and biochemical characteristics in EH group and controls
Controls
EH
n
63
137
Sex(M/F)
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41/22
87/50
Age(yrs)
56.93±12.87
57.48±10.62
BMI(kg/m2)
23.47±3.27
24.15±3.1
TC(mmol/L)
4.81±0.82
5.10±1.02
, http://www.100md.com TG(mmol/L)
1.11±0.59
1.45±0.95*
HDL(mmol/L)
1.29±0.34
1.22±0.32
Glu(mmol/L)
4.8±0.63
5.13±0.78*
SBP(mmHg)
120±15.68
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161±14.83
DBP(mmHg)
77±8.93
98±7.24
RA(ng.ml-1/h)
1.17±0.79
1.26±0.84
AngⅡ(pg/ml)
133.12±52.41
138.32±68.45
*:P<0.05 vs control
, 百拇医药
由表1可见EH组的TG，Glu显著高于对照组(P<0.05)，其余生化检查无明显差异。
2 AT1R基因A1166C多态性在对照组与EH各组中的比较情况: 由于对照组无CC基因型，EH+FH(+)组和EH+FH(-)组各一例，计算时归入AC型组。AT1R基因多态性在EH各组与对照组间比较，见表2。
表2 EH各组与对照组的AT1R基因型及等位基因频率分布比较
Tab 2 The comparison of the frequency distribution of AT1R gene among different EH group and controls Groups
Genetype
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Allele
AA
AC
A
C
Control(n=63)
57(0.91)
6(0.09)
120(0.95)
6(0.05)
EH(n=137)
106(0.77)
, 百拇医药
31(0.23)*
241(0.87)
33(0.13)*
EH+FH(+)(n=74)
56(0.76)
18(0.24)*
129(0.87)
19(0.13)*
EH+FH(-)(n=63)
50(0.79)
, 百拇医药 13(0.21)
112(0.89)
14(0.11)
EH(ⅡⅢ)(n=89)
65(0.73)
24(0.27)**
152(0.85)
26(0.15)**
EH(Ⅰ)(n=48)
41(0.85)
7(0.15)
, 百拇医药
89(0.93)
7(0.07)
*:P<0.05,**:P<0.01 vs controls
EH组、EH+FH(+)组的AC基因型及C等位基因频率显著高于对照组(P<0.05)，EH(ⅡⅢ)组的AC基因及C等位基因频率极显著高于对照组(P<0.01)，EH+FH(-)组和EH(Ⅰ)组的AC基因型及C等位基因频率与对照组间的差别无统计学意义。
3 EH各组与对照组的ACE基因型及等位基因频率的分布比较，见表3。
EH组、EH+FH(+)组的DD基因型及D等位基因频率与对照组比较无显著性差别(P>0.05)；EH(Ⅱ,Ⅲ)组的DD基因型及D等位基因频率均显著高于对照组(genotype P<0.05,allele P<0.01)。
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表3 EH各组与对照组的ACE基因型及等位基因分布比较
Tab 3 The comparison of the frequency distribution of ACE gene among different EH group and controls Groups(n)
Genotype
Allele
II
ID
DD
I
D
Controls(n=63)
, 百拇医药
24(0.38)
25(0.40)
14(0.22)
73(0.58)
53(0.42)
EH(n=137)
43(0.31)
50(0.37)
44(0.32)
136(0.50)
138(0.50)
EH+FH(+)(n=74)
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22(0.30)
27(0.36)
25(0.34)
71(0.48)
77(0.52)
EH(Ⅱ、Ⅲ)(n=89)
19(0.21)
38(0.43)
32(0.36)*
76(0.43)
102(0.57)**
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*:P<0.05,**: P<0.01,vs controls
4 风险因素独立性分析: EH组与对照组进行临床表型单变量比较发现：在一般临床参数中仅有SBP，DBP，TG，Glu参数有明显差异，其余参数比较无显著性差异；EH组和对照组的AT1R基因多态性比较，AC基因型频率有明显差异。以这些有显著差异变量以及AT1R基因型为自变量，EH为分类变量，进行logistic逐步回归，经逐步选择分析，TG(P=0.023)，Glu(P=0.0013)、AT1R基因的AC基因型(P=0.033)为独立变异因素。
5 AT1R基因和ACE基因的多态性间与EH组和EH(Ⅱ,Ⅲ)组的相互关系: 从以上结果可知，AT1R基因、ACE基因的多态性与EH、EH(Ⅱ,Ⅲ)有相关性，尤其与EH(Ⅱ,Ⅲ期)患者关系密切，为观察这两个基因在参与EH及其并发症时的相互关系，以每个个体的AT1R的基因型(AA型或AC型)与ACE基因的基因型构成个体联合基因型，观察各病例组与对照组间的联合基因型频率分布；结果显示：与AA型组合的ACE基因型频率在各病例组与对照组间比较无显著差异(P<0.05)。与AC型组合的ACE基因型频率中，EH组、EH(Ⅱ,Ⅲ)组的AC+DD频率虽高于对照组，但尚未达到统计学差异(P>0.05)，见表4。
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表4 病例组和对照组的AT1R基因型和ACE基因型分布
Tab 4 Distribution of ACE genotype in cases and controls according to AT1R genotype AT1R
groups(n)
ACE genotype
DD
ID
II
AA
EH(n=106)
, 百拇医药
33(0.31)
38(0.36)
35(0.33)
EH(Ⅱ，Ⅲ)(n=65)
25(0.38)
26(0.42)
14(0.22)
Control(n=57)
13(0.23)
22(0.39)
22(0.39)
AC
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EH(n=31)
11(0.35)
12(0.39)
8(0.26)
EH(Ⅱ，Ⅲ)(n=24)
7(0.29)
12(0.50)
5(0.21)
Control(n=6)
1(0.17)
3(0.50)
2(0.33)
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6 EH患者AT1R-A1166C变异和ACE-I/D多态性与临床表型的关系：在对照组和EH组内的AT1R基因型间或ACE基因型间的年龄、性别、BMI、SBP、DBP、血糖血脂以及PRA、AngⅡ活性水平比较，差别均无统计学意义。
DISCUSSION
原发性高血压为多基因遗传疾病，RAS在EH发生中的意义已为人们成共识，因此RAS中各组分的基因变异均可能成为EH的候选基因。本文着重分析与AngⅡ产生和发挥作用密切相关的两个组分,即AT1R和ACE基因多态性与高血压及其并发症的相关性，并探讨其可能的发病机制。
1 本研究结果发现,EH患者的AC基因型及C等位基因频率都明显高于对照组,提示AT1R基因多态性与EH发生有关,logistic回归也证实是高血压发生的独立危险因素,与Bonnardeaux[1],Wang[4]结论相符，认为AT1R基因是EH的候选基因。AT1R基因多态性与高血压伴家族史患者有关，而与无家族史者无关，这可能与高血压家族史的遗传易感性有关。由于高血压患者常伴发心、脑、肾等靶器官损害，因而有必要对高血压患者进行分期探讨。本研究将EH组分为Ⅰ期和ⅡⅢ期两组，发现EH(Ⅱ，Ⅲ)组的AC基因型(0.24)及C等位基因(0.13)显著高于对照组(0.09，0.05)，Ⅰ期EH患者与对照组间比较无明显差别。日本学者Takami[5]认为AT1R基因A1166C多态性可能参与高血压患者左室肥厚形成，Benetos[6]认为该多态性与高血压患者的动脉硬化形成有密切相关。这些都提示了AT1R基因的C等位基因与EH并发症关系密切。目前国内尚未见到有关AT1R基因与中国人高血压并发症关系报导，究竟与哪种、两种或两种以上的靶器官损害更具有遗传易感?值得进一步的研究探讨。
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2 ACE基因多态性与EH及其并发症的关系: 有研究表明血浆和组织ACE水平与ACE的D等位基因明显相关[7]，ACE是生成AngⅡ的重要转化酶，理论上推测ACE基因I/D多态性与EH发病有密切关系，但近年来的研究结论颇不一致。其相互冲突最主要的是对照组中的ACE等位基因频率的差异。本研究中，对照组中D和I等位基因频率为0.42和0.58不同于morise[8]报道的0.68和0.32，而与白种人0.4和0.6相近[9]。目前认为ACE基因多态性和EH发病的关系上有种族地区的差异：如D等位基因与黑人密切相关，与白种人和黄种人无关；与美洲非裔有关，与亚洲人和澳洲人相关不明显。
尽管ACE基因多态性与高血压病发生的关系尚不能肯定，但近年来研究表明，ACE基因多态性与高血压合并症，如左室肥厚[10]，缺血性脑病[3]等有相关性。本文将EH患者分期后，发现Ⅱ、Ⅲ期EH患者的DD基因型及D等位基因频率(0.40和0.57)显著高于对照组(0.22和0.42)，提示ACE基因I/D多态性虽与高血压病发生无关，但可能是高血压并发症的独立危险因素，参与EH发展过程。
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3 AT1R和ACE基因多态性间的相互关系:1995年Aroon[11]等研究认为AT1R 基因和ACE基因多态性间对EH患者血压水平有协同效应。目前国内尚未见到有关基因间相互作用的报道。本研究显示，EH和EH(Ⅱ,Ⅲ)组中的AC+DD频率(分别0.35，0.29)高于对照组(0.17)，但没有达到统计学差异；提示AT1R和ACE基因多态性间与EH、EH(Ⅱ，Ⅲ)无明显相互关系，可能对EH及其靶器官损害不产生协同效应。这可能与中国人群中的AT1R基因的CC基因型很少，C等位基因频率(10%),明显低于白种人(31%),可能与A1166C低突变率有关。疾病在种族间存在明显差异。
综上所述, AT1R基因A1166C变异可能参与EH发生, AT1R和ACE基因I/D多态性可能参与EH靶器官损害的形成过程.然而,有关这两个基因参与发病的具体机制目前尚不清楚。本实验中各临床参数比较结果，发现年龄、BMI、血压、生化指标以及血浆RA和AngⅡ在AT1R基因型间或ACE基因型间比较均无明显差别，提示AT1R和ACE基因多态性对EH及其并发症的影响作用可能并非通过血压和糖脂代谢以及循环RAS等途径来完成的，与以往报道相一致[12，13]。 AT1R基因A1166C变异位于3’端非编码区内，理论上不影响AT1R蛋白质编码过程。但如果与邻近有功能变异的染色体位置呈连锁不平衡，可能影响AT1R基因的mRNA表达稳定性，引起AT1R数目、分布密度以及AT1R对AngⅡ亲和力等改变，增强AngⅡ反应性进而促使EH发生发展。 因而，有必要检测局部组织RAS中的ACE、RA、AT2水平，深入研究AT1R基因的中间表型(intermediat phenotype)，进一步寻找与AT1R-A1166C多态性有连锁不平衡的变异位点。近年来的研究表明，不同AT1R基因型或ACE基因型患者对ACEI在降压、减轻动脉硬化等疗效上存在显著差异：AC型者比AA型者效果好[14]，DD型者比ID或II型者效果好[15]。结合本研究结果，笔者认为对EH患者进行AT1R和ACE基因型检测，对降压药物选择具有一定的参考价值，从而使治疗个体化、有效化，也可能为进一步开发和研制新一代疗效更好、个体针对性更强的ACEI类制剂提供一定理论依据。
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福建省卫生厅科研资助项目(96011)
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收稿日期：1998-09-20, 百拇医药