台盼蓝肝脏原位灌流在研究肝微循环变化中的应用
作者：刘立新 韩德五 许瑞龄
单位：刘立新(030001 山西省太原市，山西医科大学第一医院)；韩德五(病理生理教研室)‘许瑞龄(病理生理教研室)
关键词：肝脏原位灌流；微循环；硫代乙酰胺
中国微循环000111
【摘要】 目的 探讨台盼蓝肝脏原位灌流在研究肝微循环变化中的应用。方法 采用台盼蓝肝脏原位灌流的方法观察硫代乙酰胺(thioacetamide,TAA)所致大鼠肝脏损伤时的微循环状态。结果 内毒素血症的严重程度、反映缺血性肝损伤程度的LDH活性、以及表示肝微循环灌注状况的台盼蓝在肝内的分布时间与肝的病理形态学改变，在TAA损伤作用的不同时间，其变化趋势都是一致的。结论 1.内毒素血症在肝微循环障碍发生发展中具有重要作用，而肝微循环障碍又可诱发肝细胞的损伤。2.台盼蓝肝脏原位灌流能很好评价肝的微循环状况与肝小叶的坏死区域，是研究肝脏微循环障碍较为理想的方法。
, 百拇医药
Application of Trypan Blue in the Perfused Liver to Investigate the Microcirculatory Changes
Liu Lixin, Han Dewu, Xu Ruiling.
(Shanxi Medical University, Taiyuan 030001)
【Abstract】 Objective To study application of trypan_blue in the perfused liver to investigate the microcirculatory changes. Methods We investigate the microcirculatory changes with thioacetamide. Result The plasma endotoxin levels, LDH activity, trypan blue distribution time and the morphological changes of liver tissue were significantly enhanced in the rats of thioacetamide-induced liver injury. Conclusion The endotoxemia played an important role in hepatic microcirculatory disturbance and the latter could cause liver cell damage. This method could evaluate changes of hepatic microcirulation and the necrotic regions of the liver lobule. It is a good method in studying hepatic microcirculatory disturbance.
, 百拇医药
【Key words】 Perfused liver Microcirculation Thioacetamide
急、慢性肝病时肝脏均有不同程度的血液循环障碍，包括微循环及血流动力学改变。由于肝脏是富含血液供应的实质性器官，普通活体微循环显微镜的透射光不易穿透，难以观察其微循环状态，故以往对肝微循环障碍的研究大多采用组织形态学的观察方法。我们采用的台盼蓝肝脏原位灌流的方法观察TAA所致大鼠肝损伤时的微循环状态，评价此法是否能充分反映肝微循环的变化，借以探索研究肝微循环障碍的方法。
材料与方法
1 动物分组及模型复制
选用体重230～260g雄性Wistar大鼠32只，由本校实验动物中心提供。随机分为5组。正常对照组(N)6只。皮下注射10ml/kg生理盐水；急性肝损伤组，皮下注射TAA600 mg/kg，按TAA皮下注射时间分6h组(6只)、12h组(6只)、 24h组(7只)、 36h组(7只)。在轻度乙醚麻醉下，无菌无热原取腹主动脉血做血浆内毒素含量和血清乳酸脱氢酶活性测定。 另取相同体重Wistar雄性大鼠36只，随机分为5组：给药方法同前，N组9只，6h组6只，12h组6只，24h组7只，36h组8只。分别行台盼蓝肝脏原位灌流。
, 百拇医药
2 生化指标测定
2.1 血浆内毒素(endotoxin,ET)含量测定：采用改良过氯酸法。试剂盒由上海医学化验所提供。
2.2 血清乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性测定：药盒由中外合资上海长征医学科学有限公司提供。
3 台盼蓝肝脏原位灌流
按文献[1,2]略作改良进行。主要步骤如下：各组大鼠经50mg/kg的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，开腹行门静脉插管，用通有95% O2和5%CO2混合气体的krebs-Henseleit重碳酸盐缓冲液(pH7.40，37℃)进行灌流，流速为4ml/g liver/min,此为生理流速。同时剪断下腔静脉，使灌流液经门静脉入肝后，通过肝内的循环再从下腔静脉出肝，这样，则形成一个肝脏的独立循环状态。灌流速度采用的是肝脏生理状态下的血液循环流速，且灌流液中从始至终通有O2，使肝脏尽可能接近生理状态，但已不受大循环状态的影响。
, 百拇医药
待灌流的缓冲液将肝内的血液冲净后，换以0.2mM的台盼蓝溶液以同样流速灌流，记录肝脏全部均匀蓝染时间。该指标即可反映肝脏微循环的变化，如果肝有微循环障碍，则该部位的蓝染难度加大(由于台盼蓝溶液灌流不畅)，肝脏的蓝染时间延长(肉眼观察灌流时的肝脏蓝染变化，计时器记录蓝染时间)。
为了观察肝脏的病理改变，再用krebs-Henseleit液灌流冲洗后，用1%多聚甲醛灌流固定肝组织，石蜡包埋，切片，伊红复染，光镜下观察，胞浆被染为红色，坏死的肝细胞核被染为蓝色。
4 统计学处理
采用SPSS+/PC4.0 通用软件进行，数据以均数±标准差(±s)表示，采用方差分析，q检验。
结 果
1 血浆内毒素含量变化
, 百拇医药
注射TAA后，血浆内毒素含量逐渐升高，与正常对照组相比，24h、36h组均有显著差异(P<0.05)，见表1)。
2 血清LDH活性变化
注射TAA后，血清LDH活性明显升高，组间相比，具有显著差异(P<0.05或P<0.01，表1)。
表1 血浆内毒素(ET)及血清乳酸脱氢酶(LDH)的动态变化(±s)
Guoup
N
6h
12h
24h
36h
, 百拇医药
n
6
6
6
7
7
ET(Eu/ml)
0.156±0.010
0.216±0.056
0.195±0.033
0.249±0.036n
0.265±0.024n
, http://www.100md.com
LDH(U/L)
77±62
350±169n
501±215a
1894±1272abc
4193±2171abcd
注： a: P<0.05 vs N; b: P<0.05 vs 6h; c: P<0.05 vs 12h; d: P<0.05 vs 24h
表2 台盼蓝灌流时间的动态变化(±s)
Guoup
, http://www.100md.com
N
6h
12h
24h
36h
n
9
6
6
7
8
Time(s)
195.7±45.7
, 百拇医药 564.8±181.4a
809.7±126.2ab
1082.4±333.8ab
1370.1±410.5abc
注： a, b, c同表1。
3 肝脏台盼蓝灌流时间的变化
随着注射TAA时间的延长，灌流时间明显延长(P<0.01)，见表2。提示肝组织发生了微循环障碍。
4 肝组织病理学改变(台盼蓝灌流之肝脏)
注射TAA后6h肝细胞肿胀变性，肝窦变窄，汇管区有炎细胞浸润。12h 可见肝细胞的点状坏死，坏死区有炎细胞浸润(图1，见插页4)。24h可见肝细胞的大片状坏死，肝窦结构被破坏(图2，见插页4)。36h肝细胞坏死进一步加重，且中央静脉周围与周边区连成一片，肝窦被挤压(图3，见插页4)。正常对照组肝组织形态学(图4，见插页4)。
, 百拇医药
图1 12h组肝细胞点状坏死×400
图2 24h组肝细胞大片状坏死，肝窦结构被破坏×200
图3 36h组中央静脉周围与周边区的坏死灶连成一片×100
图4 正常对照组台盼蓝灌流之肝脏×200
讨 论
我们以往的实验及本实验均已表明TAA除了具有直接的肝毒性作用外，还可导致肠源性内毒素血症的形成[3]。内毒素一方面可直接致肝微循环障碍，是内毒素所致肝损害的突出特点，表现为肝脏出血性坏死，病理上可见肝窦内纤维蛋白血栓形成和红细胞聚集[4]；另一方面内毒素又可刺激枯否细胞、内皮细胞等产生细胞因子，细胞因子又可引起内皮细胞、贮脂细胞的收缩而致肝微循环障碍，造成组织的损伤[5]。此外，TAA的直接肝毒性作用所致的肝损伤，使肿胀变性的肝细胞挤压肝窦又可加重肝微循环障碍。位于肝窦内的枯否细胞可通过改变其体积而起括约肌样作用，协助调节肝内微循环。TAA可使枯否细胞功能受损也可致肝脏发生微循环障碍。肝微循环障碍又会引起组织器官的缺血、缺氧，进一步加重肝损伤[4]。
, http://www.100md.com
本实验结果显示，内毒素血症的严重程度、反映缺血性肝损伤程度的LDH活性以及表示肝微循环灌注状况的台盼蓝在肝内的分布时间与肝的病理形态学改变，在TAA损伤作用的不同时间，其变化趋势都是一致的。从而提示，内毒素血症在肝微循环障碍发生发展中具有重要作用，而肝微循环障碍又可诱发肝细胞的损伤。
同时我们的实验结果也表明了台盼蓝肝脏原位灌流能很好评价肝的微循环状况与肝小叶的坏死区域，是研究肝脏微循环障碍较为理想的方法。
参考文献
1，Belinsky SA, Popp JA, kauffman FC, et al. Trypan blue uptake as a new method to investigate hepatotoxicity in periportal and pericentral regions of the liver lobule: studies with allyl alcohol in the perfused liver. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 1984,230:755
, 百拇医药
2，Jones SM, Thurman RG. L-arginine minimizes reperfusion injury in a low-flow, reflow model of liver perfusion. Hepatology. 1996,24:163
3，韩德五肝功能衰竭发病机制的研究—肠源性内毒素血症假说中华肝脏病杂志1995，3(3)：46
4，艺山雄老ェンドトキシンと肝障害代谢1989，26(5)：441
5，Rockey D. The cellular pathogenesis of portal hypertension: stellate cell contractility, endothelin, and nitric oxide. Hepatologe. 1997,25:2
, 百拇医药
(收稿1998-09-03修回1998-12-09)
中国微循环 2000年第1期第4卷 实验研究
台盼蓝肝脏原位灌流在研究肝微循环变化中的应用
作者：刘立新 韩德五 许瑞龄
单位：刘立新(030001 山西省太原市，山西医科大学第一医院)；韩德五(病理生理教研室)；许瑞龄(病理生理教研室)
关键词：肝脏原位灌流；微循环；硫代乙酰胺
中国微循环000111
【摘要】 目的 探讨台盼蓝肝脏原位灌流在研究肝微循环变化中的应用。方法 采用台盼蓝肝脏原位灌流的方法观察硫代乙酰胺(thioacetamide,TAA)所致大鼠肝脏损伤时的微循环状态。结果 内毒素血症的严重程度、反映缺血性肝损伤程度的LDH活性、以及表示肝微循环灌注状况的台盼蓝在肝内的分布时间与肝的病理形态学改变，在TAA损伤作用的不同时间，其变化趋势都是一致的。结论 1.内毒素血症在肝微循环障碍发生发展中具有重要作用，而肝微循环障碍又可诱发肝细胞的损伤。2.台盼蓝肝脏原位灌流能很好评价肝的微循环状况与肝小叶的坏死区域，是研究肝脏微循环障碍较为理想的方法。
, 百拇医药
Application of Trypan Blue in the Perfused Liver to Investigate the Microcirculatory Changes
Liu Lixin, Han Dewu, Xu Ruiling.
(Shanxi Medical University, Taiyuan 030001)
【Abstract】 Objective To study application of trypan_blue in the perfused liver to investigate the microcirculatory changes. Methods We investigate the microcirculatory changes with thioacetamide. Result The plasma endotoxin levels, LDH activity, trypan blue distribution time and the morphological changes of liver tissue were significantly enhanced in the rats of thioacetamide-induced liver injury. Conclusion The endotoxemia played an important role in hepatic microcirculatory disturbance and the latter could cause liver cell damage. This method could evaluate changes of hepatic microcirulation and the necrotic regions of the liver lobule. It is a good method in studying hepatic microcirculatory disturbance.
, 百拇医药
【Key words】 Perfused liver Microcirculation Thioacetamide
急、慢性肝病时肝脏均有不同程度的血液循环障碍，包括微循环及血流动力学改变。由于肝脏是富含血液供应的实质性器官，普通活体微循环显微镜的透射光不易穿透，难以观察其微循环状态，故以往对肝微循环障碍的研究大多采用组织形态学的观察方法。我们采用的台盼蓝肝脏原位灌流的方法观察TAA所致大鼠肝损伤时的微循环状态，评价此法是否能充分反映肝微循环的变化，借以探索研究肝微循环障碍的方法。
材料与方法
1 动物分组及模型复制
选用体重230～260g雄性Wistar大鼠32只，由本校实验动物中心提供。随机分为5组。正常对照组(N)6只。皮下注射10ml/kg生理盐水；急性肝损伤组，皮下注射TAA600 mg/kg，按TAA皮下注射时间分6h组(6只)、12h组(6只)、 24h组(7只)、 36h组(7只)。在轻度乙醚麻醉下，无菌无热原取腹主动脉血做血浆内毒素含量和血清乳酸脱氢酶活性测定。 另取相同体重Wistar雄性大鼠36只，随机分为5组：给药方法同前，N组9只，6h组6只，12h组6只，24h组7只，36h组8只。分别行台盼蓝肝脏原位灌流。
, 百拇医药
2 生化指标测定
2.1 血浆内毒素(endotoxin,ET)含量测定：采用改良过氯酸法。试剂盒由上海医学化验所提供。
2.2 血清乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性测定：药盒由中外合资上海长征医学科学有限公司提供。
3 台盼蓝肝脏原位灌流
按文献[1,2]略作改良进行。主要步骤如下：各组大鼠经50mg/kg的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，开腹行门静脉插管，用通有95% O2和5%CO2混合气体的krebs-Henseleit重碳酸盐缓冲液(pH7.40，37℃)进行灌流，流速为4ml/g liver/min,此为生理流速。同时剪断下腔静脉，使灌流液经门静脉入肝后，通过肝内的循环再从下腔静脉出肝，这样，则形成一个肝脏的独立循环状态。灌流速度采用的是肝脏生理状态下的血液循环流速，且灌流液中从始至终通有O2，使肝脏尽可能接近生理状态，但已不受大循环状态的影响。
, http://www.100md.com
待灌流的缓冲液将肝内的血液冲净后，换以0.2mM的台盼蓝溶液以同样流速灌流，记录肝脏全部均匀蓝染时间。该指标即可反映肝脏微循环的变化，如果肝有微循环障碍，则该部位的蓝染难度加大(由于台盼蓝溶液灌流不畅)，肝脏的蓝染时间延长(肉眼观察灌流时的肝脏蓝染变化，计时器记录蓝染时间)。
为了观察肝脏的病理改变，再用krebs-Henseleit液灌流冲洗后，用1%多聚甲醛灌流固定肝组织，石蜡包埋，切片，伊红复染，光镜下观察，胞浆被染为红色，坏死的肝细胞核被染为蓝色。
4 统计学处理
采用SPSS+/PC4.0 通用软件进行，数据以均数±标准差(±s)表示，采用方差分析，q检验。
结 果
1 血浆内毒素含量变化
, http://www.100md.com
注射TAA后，血浆内毒素含量逐渐升高，与正常对照组相比，24h、36h组均有显著差异(P<0.05)，见表1)。
2 血清LDH活性变化
注射TAA后，血清LDH活性明显升高，组间相比，具有显著差异(P<0.05或P<0.01，表1)。
表1 血浆内毒素(ET)及血清乳酸脱氢酶(LDH)的动态变化(±s)
Guoup
N
6h
12h
24h
36h
, http://www.100md.com
n
6
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7
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ET(Eu/ml)
0.156±0.010
0.216±0.056
0.195±0.033
0.249±0.036n
0.265±0.024n
, 百拇医药
LDH(U/L)
77±62
350±169n
501±215a
1894±1272abc
4193±2171abcd
注： a: P<0.05 vs N; b: P<0.05 vs 6h; c: P<0.05 vs 12h; d: P<0.05 vs 24h
表2 台盼蓝灌流时间的动态变化(±s)
Guoup
, http://www.100md.com
N
6h
12h
24h
36h
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9
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Time(s)
195.7±45.7
, 百拇医药 564.8±181.4a
809.7±126.2ab
1082.4±333.8ab
1370.1±410.5abc
注： a, b, c同表1。
3 肝脏台盼蓝灌流时间的变化
随着注射TAA时间的延长，灌流时间明显延长(P<0.01)，见表2。提示肝组织发生了微循环障碍。
4 肝组织病理学改变(台盼蓝灌流之肝脏)
注射TAA后6h肝细胞肿胀变性，肝窦变窄，汇管区有炎细胞浸润。12h 可见肝细胞的点状坏死，坏死区有炎细胞浸润(图1，见插页4)。24h可见肝细胞的大片状坏死，肝窦结构被破坏(图2，见插页4)。36h肝细胞坏死进一步加重，且中央静脉周围与周边区连成一片，肝窦被挤压(图3，见插页4)。正常对照组肝组织形态学(图4，见插页4)。
, http://www.100md.com
图1 12h组肝细胞点状坏死×400
图2 24h组肝细胞大片状坏死，肝窦结构被破坏×200
图3 36h组中央静脉周围与周边区的坏死灶连成一片×100
图4 正常对照组台盼蓝灌流之肝脏×200
讨 论
我们以往的实验及本实验均已表明TAA除了具有直接的肝毒性作用外，还可导致肠源性内毒素血症的形成[3]。内毒素一方面可直接致肝微循环障碍，是内毒素所致肝损害的突出特点，表现为肝脏出血性坏死，病理上可见肝窦内纤维蛋白血栓形成和红细胞聚集[4]；另一方面内毒素又可刺激枯否细胞、内皮细胞等产生细胞因子，细胞因子又可引起内皮细胞、贮脂细胞的收缩而致肝微循环障碍，造成组织的损伤[5]。此外，TAA的直接肝毒性作用所致的肝损伤，使肿胀变性的肝细胞挤压肝窦又可加重肝微循环障碍。位于肝窦内的枯否细胞可通过改变其体积而起括约肌样作用，协助调节肝内微循环。TAA可使枯否细胞功能受损也可致肝脏发生微循环障碍。肝微循环障碍又会引起组织器官的缺血、缺氧，进一步加重肝损伤[4]。
, 百拇医药
本实验结果显示，内毒素血症的严重程度、反映缺血性肝损伤程度的LDH活性以及表示肝微循环灌注状况的台盼蓝在肝内的分布时间与肝的病理形态学改变，在TAA损伤作用的不同时间，其变化趋势都是一致的。从而提示，内毒素血症在肝微循环障碍发生发展中具有重要作用，而肝微循环障碍又可诱发肝细胞的损伤。
同时我们的实验结果也表明了台盼蓝肝脏原位灌流能很好评价肝的微循环状况与肝小叶的坏死区域，是研究肝脏微循环障碍较为理想的方法。
参考文献
1，Belinsky SA, Popp JA, kauffman FC, et al. Trypan blue uptake as a new method to investigate hepatotoxicity in periportal and pericentral regions of the liver lobule: studies with allyl alcohol in the perfused liver. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 1984,230:755
, http://www.100md.com
2，Jones SM, Thurman RG. L-arginine minimizes reperfusion injury in a low-flow, reflow model of liver perfusion. Hepatology. 1996,24:163
3，韩德五肝功能衰竭发病机制的研究—肠源性内毒素血症假说中华肝脏病杂志1995，3(3)：46
4，艺山雄老ェンドトキシンと肝障害代谢1989，26(5)：441
5，Rockey D. The cellular pathogenesis of portal hypertension: stellate cell contractility, endothelin, and nitric oxide. Hepatologe. 1997,25:2
(收稿1998-09-03修回1998-12-09), 百拇医药
单位：刘立新(030001 山西省太原市，山西医科大学第一医院)；韩德五(病理生理教研室)‘许瑞龄(病理生理教研室)
关键词：肝脏原位灌流；微循环；硫代乙酰胺
中国微循环000111
【摘要】 目的 探讨台盼蓝肝脏原位灌流在研究肝微循环变化中的应用。方法 采用台盼蓝肝脏原位灌流的方法观察硫代乙酰胺(thioacetamide,TAA)所致大鼠肝脏损伤时的微循环状态。结果 内毒素血症的严重程度、反映缺血性肝损伤程度的LDH活性、以及表示肝微循环灌注状况的台盼蓝在肝内的分布时间与肝的病理形态学改变，在TAA损伤作用的不同时间，其变化趋势都是一致的。结论 1.内毒素血症在肝微循环障碍发生发展中具有重要作用，而肝微循环障碍又可诱发肝细胞的损伤。2.台盼蓝肝脏原位灌流能很好评价肝的微循环状况与肝小叶的坏死区域，是研究肝脏微循环障碍较为理想的方法。
, 百拇医药
Application of Trypan Blue in the Perfused Liver to Investigate the Microcirculatory Changes
Liu Lixin, Han Dewu, Xu Ruiling.
(Shanxi Medical University, Taiyuan 030001)
【Abstract】 Objective To study application of trypan_blue in the perfused liver to investigate the microcirculatory changes. Methods We investigate the microcirculatory changes with thioacetamide. Result The plasma endotoxin levels, LDH activity, trypan blue distribution time and the morphological changes of liver tissue were significantly enhanced in the rats of thioacetamide-induced liver injury. Conclusion The endotoxemia played an important role in hepatic microcirculatory disturbance and the latter could cause liver cell damage. This method could evaluate changes of hepatic microcirulation and the necrotic regions of the liver lobule. It is a good method in studying hepatic microcirculatory disturbance.
, 百拇医药
【Key words】 Perfused liver Microcirculation Thioacetamide
急、慢性肝病时肝脏均有不同程度的血液循环障碍，包括微循环及血流动力学改变。由于肝脏是富含血液供应的实质性器官，普通活体微循环显微镜的透射光不易穿透，难以观察其微循环状态，故以往对肝微循环障碍的研究大多采用组织形态学的观察方法。我们采用的台盼蓝肝脏原位灌流的方法观察TAA所致大鼠肝损伤时的微循环状态，评价此法是否能充分反映肝微循环的变化，借以探索研究肝微循环障碍的方法。
材料与方法
1 动物分组及模型复制
选用体重230～260g雄性Wistar大鼠32只，由本校实验动物中心提供。随机分为5组。正常对照组(N)6只。皮下注射10ml/kg生理盐水；急性肝损伤组，皮下注射TAA600 mg/kg，按TAA皮下注射时间分6h组(6只)、12h组(6只)、 24h组(7只)、 36h组(7只)。在轻度乙醚麻醉下，无菌无热原取腹主动脉血做血浆内毒素含量和血清乳酸脱氢酶活性测定。 另取相同体重Wistar雄性大鼠36只，随机分为5组：给药方法同前，N组9只，6h组6只，12h组6只，24h组7只，36h组8只。分别行台盼蓝肝脏原位灌流。
, 百拇医药
2 生化指标测定
2.1 血浆内毒素(endotoxin,ET)含量测定：采用改良过氯酸法。试剂盒由上海医学化验所提供。
2.2 血清乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性测定：药盒由中外合资上海长征医学科学有限公司提供。
3 台盼蓝肝脏原位灌流
按文献[1,2]略作改良进行。主要步骤如下：各组大鼠经50mg/kg的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，开腹行门静脉插管，用通有95% O2和5%CO2混合气体的krebs-Henseleit重碳酸盐缓冲液(pH7.40，37℃)进行灌流，流速为4ml/g liver/min,此为生理流速。同时剪断下腔静脉，使灌流液经门静脉入肝后，通过肝内的循环再从下腔静脉出肝，这样，则形成一个肝脏的独立循环状态。灌流速度采用的是肝脏生理状态下的血液循环流速，且灌流液中从始至终通有O2，使肝脏尽可能接近生理状态，但已不受大循环状态的影响。
, 百拇医药
待灌流的缓冲液将肝内的血液冲净后，换以0.2mM的台盼蓝溶液以同样流速灌流，记录肝脏全部均匀蓝染时间。该指标即可反映肝脏微循环的变化，如果肝有微循环障碍，则该部位的蓝染难度加大(由于台盼蓝溶液灌流不畅)，肝脏的蓝染时间延长(肉眼观察灌流时的肝脏蓝染变化，计时器记录蓝染时间)。
为了观察肝脏的病理改变，再用krebs-Henseleit液灌流冲洗后，用1%多聚甲醛灌流固定肝组织，石蜡包埋，切片，伊红复染，光镜下观察，胞浆被染为红色，坏死的肝细胞核被染为蓝色。
4 统计学处理
采用SPSS+/PC4.0 通用软件进行，数据以均数±标准差(±s)表示，采用方差分析，q检验。
结 果
1 血浆内毒素含量变化
, 百拇医药
注射TAA后，血浆内毒素含量逐渐升高，与正常对照组相比，24h、36h组均有显著差异(P<0.05)，见表1)。
2 血清LDH活性变化
注射TAA后，血清LDH活性明显升高，组间相比，具有显著差异(P<0.05或P<0.01，表1)。
表1 血浆内毒素(ET)及血清乳酸脱氢酶(LDH)的动态变化(±s)
Guoup
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12h
24h
36h
, 百拇医药
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ET(Eu/ml)
0.156±0.010
0.216±0.056
0.195±0.033
0.249±0.036n
0.265±0.024n
, http://www.100md.com
LDH(U/L)
77±62
350±169n
501±215a
1894±1272abc
4193±2171abcd
注： a: P<0.05 vs N; b: P<0.05 vs 6h; c: P<0.05 vs 12h; d: P<0.05 vs 24h
表2 台盼蓝灌流时间的动态变化(±s)
Guoup
, http://www.100md.com
N
6h
12h
24h
36h
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9
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Time(s)
195.7±45.7
, 百拇医药 564.8±181.4a
809.7±126.2ab
1082.4±333.8ab
1370.1±410.5abc
注： a, b, c同表1。
3 肝脏台盼蓝灌流时间的变化
随着注射TAA时间的延长，灌流时间明显延长(P<0.01)，见表2。提示肝组织发生了微循环障碍。
4 肝组织病理学改变(台盼蓝灌流之肝脏)
注射TAA后6h肝细胞肿胀变性，肝窦变窄，汇管区有炎细胞浸润。12h 可见肝细胞的点状坏死，坏死区有炎细胞浸润(图1，见插页4)。24h可见肝细胞的大片状坏死，肝窦结构被破坏(图2，见插页4)。36h肝细胞坏死进一步加重，且中央静脉周围与周边区连成一片，肝窦被挤压(图3，见插页4)。正常对照组肝组织形态学(图4，见插页4)。
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图1 12h组肝细胞点状坏死×400
图2 24h组肝细胞大片状坏死，肝窦结构被破坏×200
图3 36h组中央静脉周围与周边区的坏死灶连成一片×100
图4 正常对照组台盼蓝灌流之肝脏×200
讨 论
我们以往的实验及本实验均已表明TAA除了具有直接的肝毒性作用外，还可导致肠源性内毒素血症的形成[3]。内毒素一方面可直接致肝微循环障碍，是内毒素所致肝损害的突出特点，表现为肝脏出血性坏死，病理上可见肝窦内纤维蛋白血栓形成和红细胞聚集[4]；另一方面内毒素又可刺激枯否细胞、内皮细胞等产生细胞因子，细胞因子又可引起内皮细胞、贮脂细胞的收缩而致肝微循环障碍，造成组织的损伤[5]。此外，TAA的直接肝毒性作用所致的肝损伤，使肿胀变性的肝细胞挤压肝窦又可加重肝微循环障碍。位于肝窦内的枯否细胞可通过改变其体积而起括约肌样作用，协助调节肝内微循环。TAA可使枯否细胞功能受损也可致肝脏发生微循环障碍。肝微循环障碍又会引起组织器官的缺血、缺氧，进一步加重肝损伤[4]。
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本实验结果显示，内毒素血症的严重程度、反映缺血性肝损伤程度的LDH活性以及表示肝微循环灌注状况的台盼蓝在肝内的分布时间与肝的病理形态学改变，在TAA损伤作用的不同时间，其变化趋势都是一致的。从而提示，内毒素血症在肝微循环障碍发生发展中具有重要作用，而肝微循环障碍又可诱发肝细胞的损伤。
同时我们的实验结果也表明了台盼蓝肝脏原位灌流能很好评价肝的微循环状况与肝小叶的坏死区域，是研究肝脏微循环障碍较为理想的方法。
参考文献
1，Belinsky SA, Popp JA, kauffman FC, et al. Trypan blue uptake as a new method to investigate hepatotoxicity in periportal and pericentral regions of the liver lobule: studies with allyl alcohol in the perfused liver. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 1984,230:755
, 百拇医药
2，Jones SM, Thurman RG. L-arginine minimizes reperfusion injury in a low-flow, reflow model of liver perfusion. Hepatology. 1996,24:163
3，韩德五肝功能衰竭发病机制的研究—肠源性内毒素血症假说中华肝脏病杂志1995，3(3)：46
4，艺山雄老ェンドトキシンと肝障害代谢1989，26(5)：441
5，Rockey D. The cellular pathogenesis of portal hypertension: stellate cell contractility, endothelin, and nitric oxide. Hepatologe. 1997,25:2
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(收稿1998-09-03修回1998-12-09)
中国微循环 2000年第1期第4卷 实验研究
台盼蓝肝脏原位灌流在研究肝微循环变化中的应用
作者：刘立新 韩德五 许瑞龄
单位：刘立新(030001 山西省太原市，山西医科大学第一医院)；韩德五(病理生理教研室)；许瑞龄(病理生理教研室)
关键词：肝脏原位灌流；微循环；硫代乙酰胺
中国微循环000111
【摘要】 目的 探讨台盼蓝肝脏原位灌流在研究肝微循环变化中的应用。方法 采用台盼蓝肝脏原位灌流的方法观察硫代乙酰胺(thioacetamide,TAA)所致大鼠肝脏损伤时的微循环状态。结果 内毒素血症的严重程度、反映缺血性肝损伤程度的LDH活性、以及表示肝微循环灌注状况的台盼蓝在肝内的分布时间与肝的病理形态学改变，在TAA损伤作用的不同时间，其变化趋势都是一致的。结论 1.内毒素血症在肝微循环障碍发生发展中具有重要作用，而肝微循环障碍又可诱发肝细胞的损伤。2.台盼蓝肝脏原位灌流能很好评价肝的微循环状况与肝小叶的坏死区域，是研究肝脏微循环障碍较为理想的方法。
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Application of Trypan Blue in the Perfused Liver to Investigate the Microcirculatory Changes
Liu Lixin, Han Dewu, Xu Ruiling.
(Shanxi Medical University, Taiyuan 030001)
【Abstract】 Objective To study application of trypan_blue in the perfused liver to investigate the microcirculatory changes. Methods We investigate the microcirculatory changes with thioacetamide. Result The plasma endotoxin levels, LDH activity, trypan blue distribution time and the morphological changes of liver tissue were significantly enhanced in the rats of thioacetamide-induced liver injury. Conclusion The endotoxemia played an important role in hepatic microcirculatory disturbance and the latter could cause liver cell damage. This method could evaluate changes of hepatic microcirulation and the necrotic regions of the liver lobule. It is a good method in studying hepatic microcirculatory disturbance.
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【Key words】 Perfused liver Microcirculation Thioacetamide
急、慢性肝病时肝脏均有不同程度的血液循环障碍，包括微循环及血流动力学改变。由于肝脏是富含血液供应的实质性器官，普通活体微循环显微镜的透射光不易穿透，难以观察其微循环状态，故以往对肝微循环障碍的研究大多采用组织形态学的观察方法。我们采用的台盼蓝肝脏原位灌流的方法观察TAA所致大鼠肝损伤时的微循环状态，评价此法是否能充分反映肝微循环的变化，借以探索研究肝微循环障碍的方法。
材料与方法
1 动物分组及模型复制
选用体重230～260g雄性Wistar大鼠32只，由本校实验动物中心提供。随机分为5组。正常对照组(N)6只。皮下注射10ml/kg生理盐水；急性肝损伤组，皮下注射TAA600 mg/kg，按TAA皮下注射时间分6h组(6只)、12h组(6只)、 24h组(7只)、 36h组(7只)。在轻度乙醚麻醉下，无菌无热原取腹主动脉血做血浆内毒素含量和血清乳酸脱氢酶活性测定。 另取相同体重Wistar雄性大鼠36只，随机分为5组：给药方法同前，N组9只，6h组6只，12h组6只，24h组7只，36h组8只。分别行台盼蓝肝脏原位灌流。
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2 生化指标测定
2.1 血浆内毒素(endotoxin,ET)含量测定：采用改良过氯酸法。试剂盒由上海医学化验所提供。
2.2 血清乳酸脱氢酶(lactate dehydrogenase,LDH)活性测定：药盒由中外合资上海长征医学科学有限公司提供。
3 台盼蓝肝脏原位灌流
按文献[1,2]略作改良进行。主要步骤如下：各组大鼠经50mg/kg的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，开腹行门静脉插管，用通有95% O2和5%CO2混合气体的krebs-Henseleit重碳酸盐缓冲液(pH7.40，37℃)进行灌流，流速为4ml/g liver/min,此为生理流速。同时剪断下腔静脉，使灌流液经门静脉入肝后，通过肝内的循环再从下腔静脉出肝，这样，则形成一个肝脏的独立循环状态。灌流速度采用的是肝脏生理状态下的血液循环流速，且灌流液中从始至终通有O2，使肝脏尽可能接近生理状态，但已不受大循环状态的影响。
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待灌流的缓冲液将肝内的血液冲净后，换以0.2mM的台盼蓝溶液以同样流速灌流，记录肝脏全部均匀蓝染时间。该指标即可反映肝脏微循环的变化，如果肝有微循环障碍，则该部位的蓝染难度加大(由于台盼蓝溶液灌流不畅)，肝脏的蓝染时间延长(肉眼观察灌流时的肝脏蓝染变化，计时器记录蓝染时间)。
为了观察肝脏的病理改变，再用krebs-Henseleit液灌流冲洗后，用1%多聚甲醛灌流固定肝组织，石蜡包埋，切片，伊红复染，光镜下观察，胞浆被染为红色，坏死的肝细胞核被染为蓝色。
4 统计学处理
采用SPSS+/PC4.0 通用软件进行，数据以均数±标准差(±s)表示，采用方差分析，q检验。
结 果
1 血浆内毒素含量变化
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注射TAA后，血浆内毒素含量逐渐升高，与正常对照组相比，24h、36h组均有显著差异(P<0.05)，见表1)。
2 血清LDH活性变化
注射TAA后，血清LDH活性明显升高，组间相比，具有显著差异(P<0.05或P<0.01，表1)。
表1 血浆内毒素(ET)及血清乳酸脱氢酶(LDH)的动态变化(±s)
Guoup
N
6h
12h
24h
36h
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n
6
6
6
7
7
ET(Eu/ml)
0.156±0.010
0.216±0.056
0.195±0.033
0.249±0.036n
0.265±0.024n
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LDH(U/L)
77±62
350±169n
501±215a
1894±1272abc
4193±2171abcd
注： a: P<0.05 vs N; b: P<0.05 vs 6h; c: P<0.05 vs 12h; d: P<0.05 vs 24h
表2 台盼蓝灌流时间的动态变化(±s)
Guoup
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N
6h
12h
24h
36h
n
9
6
6
7
8
Time(s)
195.7±45.7
, 百拇医药 564.8±181.4a
809.7±126.2ab
1082.4±333.8ab
1370.1±410.5abc
注： a, b, c同表1。
3 肝脏台盼蓝灌流时间的变化
随着注射TAA时间的延长，灌流时间明显延长(P<0.01)，见表2。提示肝组织发生了微循环障碍。
4 肝组织病理学改变(台盼蓝灌流之肝脏)
注射TAA后6h肝细胞肿胀变性，肝窦变窄，汇管区有炎细胞浸润。12h 可见肝细胞的点状坏死，坏死区有炎细胞浸润(图1，见插页4)。24h可见肝细胞的大片状坏死，肝窦结构被破坏(图2，见插页4)。36h肝细胞坏死进一步加重，且中央静脉周围与周边区连成一片，肝窦被挤压(图3，见插页4)。正常对照组肝组织形态学(图4，见插页4)。
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图1 12h组肝细胞点状坏死×400
图2 24h组肝细胞大片状坏死，肝窦结构被破坏×200
图3 36h组中央静脉周围与周边区的坏死灶连成一片×100
图4 正常对照组台盼蓝灌流之肝脏×200
讨 论
我们以往的实验及本实验均已表明TAA除了具有直接的肝毒性作用外，还可导致肠源性内毒素血症的形成[3]。内毒素一方面可直接致肝微循环障碍，是内毒素所致肝损害的突出特点，表现为肝脏出血性坏死，病理上可见肝窦内纤维蛋白血栓形成和红细胞聚集[4]；另一方面内毒素又可刺激枯否细胞、内皮细胞等产生细胞因子，细胞因子又可引起内皮细胞、贮脂细胞的收缩而致肝微循环障碍，造成组织的损伤[5]。此外，TAA的直接肝毒性作用所致的肝损伤，使肿胀变性的肝细胞挤压肝窦又可加重肝微循环障碍。位于肝窦内的枯否细胞可通过改变其体积而起括约肌样作用，协助调节肝内微循环。TAA可使枯否细胞功能受损也可致肝脏发生微循环障碍。肝微循环障碍又会引起组织器官的缺血、缺氧，进一步加重肝损伤[4]。
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本实验结果显示，内毒素血症的严重程度、反映缺血性肝损伤程度的LDH活性以及表示肝微循环灌注状况的台盼蓝在肝内的分布时间与肝的病理形态学改变，在TAA损伤作用的不同时间，其变化趋势都是一致的。从而提示，内毒素血症在肝微循环障碍发生发展中具有重要作用，而肝微循环障碍又可诱发肝细胞的损伤。
同时我们的实验结果也表明了台盼蓝肝脏原位灌流能很好评价肝的微循环状况与肝小叶的坏死区域，是研究肝脏微循环障碍较为理想的方法。
参考文献
1，Belinsky SA, Popp JA, kauffman FC, et al. Trypan blue uptake as a new method to investigate hepatotoxicity in periportal and pericentral regions of the liver lobule: studies with allyl alcohol in the perfused liver. The Journal of Pharmacology and Experimental Therapeutics. 1984,230:755
, http://www.100md.com
2，Jones SM, Thurman RG. L-arginine minimizes reperfusion injury in a low-flow, reflow model of liver perfusion. Hepatology. 1996,24:163
3，韩德五肝功能衰竭发病机制的研究—肠源性内毒素血症假说中华肝脏病杂志1995，3(3)：46
4，艺山雄老ェンドトキシンと肝障害代谢1989，26(5)：441
5，Rockey D. The cellular pathogenesis of portal hypertension: stellate cell contractility, endothelin, and nitric oxide. Hepatologe. 1997,25:2
(收稿1998-09-03修回1998-12-09), 百拇医药