性发育异常患者SRY基因分析
作者：胡晓峰 虎宝先 朱宝生 李春华 肖燕忠 濮德敏 刘希贤
单位：刘希贤 肖燕忠 胡晓峰(同济医科大学基础医学院医学遗传学研究室，武汉 430030)；濮德敏 虎宝先(同济医科大学附属协和医院妇产科，武汉 430022)；朱宝生 李春华(云南省人民医院妇产科，昆明 650032)
关键词：性腺发育障碍症；性染色体异常；性别决定基因；聚合酶链反应；单链构象多态性分析
同济医科大学学报000104 摘要 应用SRY基因编码区1对特异寡核苷酸引物进行基因组DNA扩增，结合单链构象多态性分析，银染显色，探讨性别决定基 因(sex-determining region on Y,SRY)对性发育异常患者临床诊断的 意义。结果：5例患者中，2例46，XX男性显示与男性相同的特异扩增带；3例46，XY女性中2例无男性特异扩增带，1例显示SRY基因片段扩增，经单链构象多态性分析，显示与正常男性扩增片段相同的单链泳动带型。支持SRY基因是男性性别决定的关键基因的假说，提示SRY基因的调节基因等可能参与协同作用。
, http://www.100md.com
中图法分类号 R588， R596.1， R394
A Study on the SRY Gene in Cases of Sexual Abnor mality
Hu Xiaofeng
(Department of Medical Genetics, School of Basic Medical Sciences, Tongji Me dical University, Wuhan 430030)
Hu Baoxian
(Department of Obstetrics and Gynaecology, Xiehe Hospital, Tongji Medical Un iversity, Wuhan 430022 )
, 百拇医药
Zhu Baosheng
(Department of Obstetrics and Gynaecology, Yunnan No.1 People's Hospital, Ku nming 650032)
Abstract To investigate the clinical implication of the sex determining region on Y (SRY) gene in the diagnosis of sexual abnomality, amplifica tion of SRY sequences of 5 cases of sexualabnormality was carried out by using polymerase chain reaction followed by single strand conformation polymorphism analysis. The result revealed that among the 5 cases, two 46,XX males showed a SRY -specific 300bp band as norm al malecontrol. Among the 3 46,XY females, 2 had no male specific band, one sho wed a 300bp band, which displayed a normalsingle strand mobility by PCR-SSCP. The results further supported the hypothesis that SRY gene plays an important ro le innormal male sex differentiation, suggesting regulatory sequences of SRY or other genes are probably involved in the geneticmechanisms of sex determinatio n and differentiation.
, 百拇医药
Key words gonadaldysgenesis; sex chromosome abnormalit ies; SRY gene; polymerase chain reation; single strand conformationpolymorp hism
人类及其它哺乳动物的性别决定是遗传学的重要研究课题，长期以来研究焦点集中在对雄性决定因子的阐明。1990年，发现了Y染色体短臂上性别决定 区(sex-determining region onY，SRY)，即SRY基因是睾丸决定因子 (testis-determiningfactor，TDF)的最佳侯选基因[1]，SRY基因易位、点突变、缺失均可引起染色体性别、性腺性别与表型性别的不一致，造成各种性发育异常[2，3]。本文以人工合成的SRY特异性寡核苷酸引物，对5例性腺发育异常的患者基因组DNA进行了PCR扩增，并对其中1例作单链构象多态性(single strand conformationpolymorphism，SSCP)分析，结果报告如下。
, 百拇医药
1 资料与方法
1.1 病例
5例性腺发育不良患者均经细胞遗传学分析证实核型与表型不一致。其中1例核型为46，XY的女性，双侧性腺组织病理检查见发育不良卵巢组织，未发现睾丸间质细胞。病例临床特征及核型分析结果见表1。
表1 5例患者临床特征及核型 例号
社会
性别
年龄
(岁)
身高
(cm)
临 床 特 征
, 百拇医药
核 型
1
女
21
160
女性外表，女性内外生殖器，B超检查提示子宫发育不良，性 腺病理检查见卵巢
46，XY
组织发育不成熟
2
女
19
164
女性外表，幼稚型女性外生殖器，B超检查提示子宫、卵巢 发育不良
, 百拇医药
46，XY
3
男
13
157
男性外表，双睾6 ml，中度智力低下
46，XX
4
男
27
167
男性外表，有喉结，双睾指尖大小，精液常规无精子
4 6，XX
, 百拇医药
5
女
21
160
女性外表，女性外生殖器，阴蒂肥大,B超检查提示子宫发育不良，未见睾丸图像
46，XY
1.2 方法
1.2.1基因组DNA检测：按本室常规方法抽提患者外周血基因组DNA，紫外分 光光度法定量。
1.2.2 PCR扩增及产物检测：参照文献[4]合成SRY基因编码区一对引物，序列为Sp1:5′-CGGGAGAAAACAGTAAAGGC-3′;Sp2:5′-CTGCGGGAAGCAAACTGC-3′,该引物特异性扩增正常男性SRY基因保守区299 bp的DNA片段，扩增在PE-Cetus热循环仪上进行，扩增体系含DNA模板50～100 ng，两种引物浓度各为0.2 μmol/L， dNTP各200μmol/L，TaqDNA聚合酶1 U，10×缓冲液2.5 μl，反应总体积25 μ l，扩增条件为95 ℃变性5min，经30个周期循环(94 ℃，30 s变性，60 ℃ 30 s 退火，72 ℃ 1 min 30 s延伸)，最后于72 ℃保温7min，每一样品均作5份PCR 扩增，反应完成后，取扩增产物加入加样缓冲液10 μl，混匀，98 ℃变性5 min，迅速置于冰浴，每份样品取5 μl加入60 g/L变性聚丙烯酰胺凝胶(7.6 mol/L尿素，丙烯酰胺∶亚甲叉双丙烯酰胺=19∶1)加样孔中，200 V恒压电泳1～1.5 h，银染法显示扩增带纹，以pBR322/HaeⅢ作标准分子量对照，分析结果。
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1.2.3 PCR-SSCP分析：取4μl PCR扩增产物，加1 μl上样缓冲液，混合后 变性，点样于60 g/L聚丙烯酰胺凝胶，200 V恒压电泳6h，银染显示电泳结果。
1.2.4 细胞遗传学分析：按常规方法制备外周血染色体，并作G、C显带。
2 结果
5例性腺发育不良及2名正常人基因组PCR扩增结果见图1。例3、例4、例5及正常男性基因组扩增后均产生300 bp SRY基因片段，正常女性无此片段。例1、例2未扩增出SRY基因片段,重复5次PCR均为阴性，为排除DNA样品不纯等原因造成PCR反应结果阴性，例1、例2加作FMR-1基因重复序列扩增,电泳检测可见特异性扩增带。例3、4、5作SSCP分析，结果显示患者单链DNA电泳迁移率与正常男性对照相同，提示SRY基因未产生突变，见图2。
, 百拇医药
图1 SRY基因PCR扩增产物
M：pBR322/HaeⅢ分子量标记； NF：正常女性对照； NM：正常男性对照； 1～5依次为例1、2、3、4、5患者的扩增产物
图2 SRY基因PCR-SSCP电泳图
NM：正常男性PCR产物； 3～5依次为例3、4、5 PCR产物； SS：单链带 DS：双链带
3 讨论
近年来的大量研究证明SRY基因是睾丸决定因子的最佳候选基因，转基因 小鼠实验表明[5]，SRY基因能诱导核型为雌性的小鼠胚胎出现睾丸分化，向雄性方向发育。人类的SRY基因的研究表明，该基因含有一个能与DNA结合的HMG 基序(HMGbox)，后者是SRY编码蛋白质的唯一功能区，SRY蛋白在原始性腺 组织中表达，能特异识别和结合序列AACAAAG的DNA片段，使胚胎的原始性腺组织向睾丸组织分化。SRY基因在发育早期起着“开关”作用，一方面对其它基因表达进行调控，另一方面又受控于其它位于X 染色体或常染色体上的基因，通过基因间相互协调作用，实现其在男性的性别分化中的控制作用。SRY基因点突变、缺失、易位都可以导致性发育异常，因此，对性发育异常患者进行SRY基因检测，对临床诊断、治疗有着重要意义。
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迄今所见，SRY基因突变绝大多数发生于HMG盒内[6]。本文应用该区域特异寡核苷酸引物作PCR扩增，产物为299 bp，含有SRY基因中高度保守功能特异 性区域的240bp。例3、例4均为46，XX男性，基因组中含有SRY基因，提示可能其父精子形成的减数分裂过程中，Xp-Yp染色体的拟常染色体区发生了异常交换，使得X染色体上带有靠近Yp拟常染色体区的SRY基因，因此，虽其为女性染色体核型46，XX，表型却为男性。进一步证据有赖于染色体原位杂交。
46，XY女性病因较复杂，仅在15%的患者中发现SRY基因HMG编码突变[6]，另有报道提示，父方减数分裂中Xp-YpDNA同源交换造成Yp上SRY基因不同程度的缺失可能是病因之一[7]。本组例1为46，XY女性，但PCR未扩增出SRY基因片段，性腺病检未见睾丸间质细胞，说明虽然有Y染色体，但SRY基因缺失，使性腺组织向卵巢方向分化发育，导致染色体性别与核型性别不一致的性反转 综合征，例2PCR扩增结果与例1相同，从临床资料分析，其发病机制可能与例1相似，性腺组织病理检查将有助于病因探讨。
, 百拇医药
性别决定和分化是一个复杂的多基因协同作用的过程，SRY基因的获得与缺失并不能解释所有性反转患者的发病机制。迄今，多数病例分析仅限于基序序列，进一步对基序以外的其它部分，包括启动子或SRY基因所调控的下游基因以及位于X染色体上其它基因突变的研究，将有助于真正了解性别决定与分化的机制。本文例5为46，XY女性，有SRY基因序列，且SSCP分析单链DNA泳动带型与正常男性无差异，表明性发育异常非SRY基因突变所致。进一步将分析序列扩大到SRY基因核心区以外的侧翼序列，可能为这类患者发病的分子 机制提供更多有价值资料。
湖北省科委自然科学基金资助项目(No.98J100)
胡晓峰，女，1958年生，副教授
参 考 文 献
1，Sinclair A H, Berta P, Palmer M S etal. A gene from the human s ex -determining region encodes a protein with homology to a conserved DNA-bindingmotif. Nature,1990,346:240
, 百拇医药
2，Palmer M S, Sinclair A H, Berta P et al.Genetic evidence thatZF Y is not the testis-determining factor.Nature,1989,342:937
3，Bexta P, Hawkins J R, Sinclair AH et al.Genetic evidence equati ng SRY and the testis-determining factor.Nature,1990,348:448
4 Jager R J, Anveret M, Hall K et al.A human XY female with a fram e s hift mutation in the candidatetestis-determining gene SRY. Nature,1990,348:452
, 百拇医药
5，Koopman P, Ubbay J, Vivian N et al.Male development of chromoso mally female mice trangenic for SRY. Nature,1991,351:117
6 Hawkins J R,Taylor A, Betta P, et al.Mutational analysis of SRY: nonsense and mutations in XY sexreversal.Hum Genet,1992,88:471
7，Tuck-Muller C M, Chen H, Martinez J E et al.Isodicentric Y chr omosome: cytogenetic, molecular and clinical studies and review of the literatur e. HumGenet,1995,96:119
(1998-09-16 收稿), 百拇医药
单位：刘希贤 肖燕忠 胡晓峰(同济医科大学基础医学院医学遗传学研究室，武汉 430030)；濮德敏 虎宝先(同济医科大学附属协和医院妇产科，武汉 430022)；朱宝生 李春华(云南省人民医院妇产科，昆明 650032)
关键词：性腺发育障碍症；性染色体异常；性别决定基因；聚合酶链反应；单链构象多态性分析
同济医科大学学报000104 摘要 应用SRY基因编码区1对特异寡核苷酸引物进行基因组DNA扩增，结合单链构象多态性分析，银染显色，探讨性别决定基 因(sex-determining region on Y,SRY)对性发育异常患者临床诊断的 意义。结果：5例患者中，2例46，XX男性显示与男性相同的特异扩增带；3例46，XY女性中2例无男性特异扩增带，1例显示SRY基因片段扩增，经单链构象多态性分析，显示与正常男性扩增片段相同的单链泳动带型。支持SRY基因是男性性别决定的关键基因的假说，提示SRY基因的调节基因等可能参与协同作用。
, http://www.100md.com
中图法分类号 R588， R596.1， R394
A Study on the SRY Gene in Cases of Sexual Abnor mality
Hu Xiaofeng
(Department of Medical Genetics, School of Basic Medical Sciences, Tongji Me dical University, Wuhan 430030)
Hu Baoxian
(Department of Obstetrics and Gynaecology, Xiehe Hospital, Tongji Medical Un iversity, Wuhan 430022 )
, 百拇医药
Zhu Baosheng
(Department of Obstetrics and Gynaecology, Yunnan No.1 People's Hospital, Ku nming 650032)
Abstract To investigate the clinical implication of the sex determining region on Y (SRY) gene in the diagnosis of sexual abnomality, amplifica tion of SRY sequences of 5 cases of sexualabnormality was carried out by using polymerase chain reaction followed by single strand conformation polymorphism analysis. The result revealed that among the 5 cases, two 46,XX males showed a SRY -specific 300bp band as norm al malecontrol. Among the 3 46,XY females, 2 had no male specific band, one sho wed a 300bp band, which displayed a normalsingle strand mobility by PCR-SSCP. The results further supported the hypothesis that SRY gene plays an important ro le innormal male sex differentiation, suggesting regulatory sequences of SRY or other genes are probably involved in the geneticmechanisms of sex determinatio n and differentiation.
, 百拇医药
Key words gonadaldysgenesis; sex chromosome abnormalit ies; SRY gene; polymerase chain reation; single strand conformationpolymorp hism
人类及其它哺乳动物的性别决定是遗传学的重要研究课题，长期以来研究焦点集中在对雄性决定因子的阐明。1990年，发现了Y染色体短臂上性别决定 区(sex-determining region onY，SRY)，即SRY基因是睾丸决定因子 (testis-determiningfactor，TDF)的最佳侯选基因[1]，SRY基因易位、点突变、缺失均可引起染色体性别、性腺性别与表型性别的不一致，造成各种性发育异常[2，3]。本文以人工合成的SRY特异性寡核苷酸引物，对5例性腺发育异常的患者基因组DNA进行了PCR扩增，并对其中1例作单链构象多态性(single strand conformationpolymorphism，SSCP)分析，结果报告如下。
, 百拇医药
1 资料与方法
1.1 病例
5例性腺发育不良患者均经细胞遗传学分析证实核型与表型不一致。其中1例核型为46，XY的女性，双侧性腺组织病理检查见发育不良卵巢组织，未发现睾丸间质细胞。病例临床特征及核型分析结果见表1。
表1 5例患者临床特征及核型 例号
社会
性别
年龄
(岁)
身高
(cm)
临 床 特 征
, 百拇医药
核 型
1
女
21
160
女性外表，女性内外生殖器，B超检查提示子宫发育不良，性 腺病理检查见卵巢
46，XY
组织发育不成熟
2
女
19
164
女性外表，幼稚型女性外生殖器，B超检查提示子宫、卵巢 发育不良
, 百拇医药
46，XY
3
男
13
157
男性外表，双睾6 ml，中度智力低下
46，XX
4
男
27
167
男性外表，有喉结，双睾指尖大小，精液常规无精子
4 6，XX
, 百拇医药
5
女
21
160
女性外表，女性外生殖器，阴蒂肥大,B超检查提示子宫发育不良，未见睾丸图像
46，XY
1.2 方法
1.2.1基因组DNA检测：按本室常规方法抽提患者外周血基因组DNA，紫外分 光光度法定量。
1.2.2 PCR扩增及产物检测：参照文献[4]合成SRY基因编码区一对引物，序列为Sp1:5′-CGGGAGAAAACAGTAAAGGC-3′;Sp2:5′-CTGCGGGAAGCAAACTGC-3′,该引物特异性扩增正常男性SRY基因保守区299 bp的DNA片段，扩增在PE-Cetus热循环仪上进行，扩增体系含DNA模板50～100 ng，两种引物浓度各为0.2 μmol/L， dNTP各200μmol/L，TaqDNA聚合酶1 U，10×缓冲液2.5 μl，反应总体积25 μ l，扩增条件为95 ℃变性5min，经30个周期循环(94 ℃，30 s变性，60 ℃ 30 s 退火，72 ℃ 1 min 30 s延伸)，最后于72 ℃保温7min，每一样品均作5份PCR 扩增，反应完成后，取扩增产物加入加样缓冲液10 μl，混匀，98 ℃变性5 min，迅速置于冰浴，每份样品取5 μl加入60 g/L变性聚丙烯酰胺凝胶(7.6 mol/L尿素，丙烯酰胺∶亚甲叉双丙烯酰胺=19∶1)加样孔中，200 V恒压电泳1～1.5 h，银染法显示扩增带纹，以pBR322/HaeⅢ作标准分子量对照，分析结果。
, http://www.100md.com
1.2.3 PCR-SSCP分析：取4μl PCR扩增产物，加1 μl上样缓冲液，混合后 变性，点样于60 g/L聚丙烯酰胺凝胶，200 V恒压电泳6h，银染显示电泳结果。
1.2.4 细胞遗传学分析：按常规方法制备外周血染色体，并作G、C显带。
2 结果
5例性腺发育不良及2名正常人基因组PCR扩增结果见图1。例3、例4、例5及正常男性基因组扩增后均产生300 bp SRY基因片段，正常女性无此片段。例1、例2未扩增出SRY基因片段,重复5次PCR均为阴性，为排除DNA样品不纯等原因造成PCR反应结果阴性，例1、例2加作FMR-1基因重复序列扩增,电泳检测可见特异性扩增带。例3、4、5作SSCP分析，结果显示患者单链DNA电泳迁移率与正常男性对照相同，提示SRY基因未产生突变，见图2。
, 百拇医药
图1 SRY基因PCR扩增产物
M：pBR322/HaeⅢ分子量标记； NF：正常女性对照； NM：正常男性对照； 1～5依次为例1、2、3、4、5患者的扩增产物
图2 SRY基因PCR-SSCP电泳图
NM：正常男性PCR产物； 3～5依次为例3、4、5 PCR产物； SS：单链带 DS：双链带
3 讨论
近年来的大量研究证明SRY基因是睾丸决定因子的最佳候选基因，转基因 小鼠实验表明[5]，SRY基因能诱导核型为雌性的小鼠胚胎出现睾丸分化，向雄性方向发育。人类的SRY基因的研究表明，该基因含有一个能与DNA结合的HMG 基序(HMGbox)，后者是SRY编码蛋白质的唯一功能区，SRY蛋白在原始性腺 组织中表达，能特异识别和结合序列AACAAAG的DNA片段，使胚胎的原始性腺组织向睾丸组织分化。SRY基因在发育早期起着“开关”作用，一方面对其它基因表达进行调控，另一方面又受控于其它位于X 染色体或常染色体上的基因，通过基因间相互协调作用，实现其在男性的性别分化中的控制作用。SRY基因点突变、缺失、易位都可以导致性发育异常，因此，对性发育异常患者进行SRY基因检测，对临床诊断、治疗有着重要意义。
, http://www.100md.com
迄今所见，SRY基因突变绝大多数发生于HMG盒内[6]。本文应用该区域特异寡核苷酸引物作PCR扩增，产物为299 bp，含有SRY基因中高度保守功能特异 性区域的240bp。例3、例4均为46，XX男性，基因组中含有SRY基因，提示可能其父精子形成的减数分裂过程中，Xp-Yp染色体的拟常染色体区发生了异常交换，使得X染色体上带有靠近Yp拟常染色体区的SRY基因，因此，虽其为女性染色体核型46，XX，表型却为男性。进一步证据有赖于染色体原位杂交。
46，XY女性病因较复杂，仅在15%的患者中发现SRY基因HMG编码突变[6]，另有报道提示，父方减数分裂中Xp-YpDNA同源交换造成Yp上SRY基因不同程度的缺失可能是病因之一[7]。本组例1为46，XY女性，但PCR未扩增出SRY基因片段，性腺病检未见睾丸间质细胞，说明虽然有Y染色体，但SRY基因缺失，使性腺组织向卵巢方向分化发育，导致染色体性别与核型性别不一致的性反转 综合征，例2PCR扩增结果与例1相同，从临床资料分析，其发病机制可能与例1相似，性腺组织病理检查将有助于病因探讨。
, 百拇医药
性别决定和分化是一个复杂的多基因协同作用的过程，SRY基因的获得与缺失并不能解释所有性反转患者的发病机制。迄今，多数病例分析仅限于基序序列，进一步对基序以外的其它部分，包括启动子或SRY基因所调控的下游基因以及位于X染色体上其它基因突变的研究，将有助于真正了解性别决定与分化的机制。本文例5为46，XY女性，有SRY基因序列，且SSCP分析单链DNA泳动带型与正常男性无差异，表明性发育异常非SRY基因突变所致。进一步将分析序列扩大到SRY基因核心区以外的侧翼序列，可能为这类患者发病的分子 机制提供更多有价值资料。
湖北省科委自然科学基金资助项目(No.98J100)
胡晓峰，女，1958年生，副教授
参 考 文 献
1，Sinclair A H, Berta P, Palmer M S etal. A gene from the human s ex -determining region encodes a protein with homology to a conserved DNA-bindingmotif. Nature,1990,346:240
, 百拇医药
2，Palmer M S, Sinclair A H, Berta P et al.Genetic evidence thatZF Y is not the testis-determining factor.Nature,1989,342:937
3，Bexta P, Hawkins J R, Sinclair AH et al.Genetic evidence equati ng SRY and the testis-determining factor.Nature,1990,348:448
4 Jager R J, Anveret M, Hall K et al.A human XY female with a fram e s hift mutation in the candidatetestis-determining gene SRY. Nature,1990,348:452
, 百拇医药
5，Koopman P, Ubbay J, Vivian N et al.Male development of chromoso mally female mice trangenic for SRY. Nature,1991,351:117
6 Hawkins J R,Taylor A, Betta P, et al.Mutational analysis of SRY: nonsense and mutations in XY sexreversal.Hum Genet,1992,88:471
7，Tuck-Muller C M, Chen H, Martinez J E et al.Isodicentric Y chr omosome: cytogenetic, molecular and clinical studies and review of the literatur e. HumGenet,1995,96:119
(1998-09-16 收稿), 百拇医药