日本血吸虫32 ku抗原基因的克隆及在耻垢分枝杆菌中的表达
作者：肖红 郑波 祁学忠 皇甫永穆
单位：同济医科大学实验医学研究中心医学分子生物学研究室，武汉 430030
关键词：分枝杆菌；质粒；血吸虫；日本；疫苗，合成；基因表达
同济医科大学学报000102 摘要 日本血吸虫32 ku抗原(简称sj32ku)是血吸虫的一种保护性抗原, 为研究其重组疫苗的保护作用，将该抗原基因的全编码序列按正确的阅读框顺序插入到穿梭质粒pBCG2100, 受控于人结核杆菌热休克蛋白70(Heat shock protein70，简称hsp70)启动子，构建成重组表达质粒 pBCG-sj32，在大肠杆菌-分枝杆菌两个系统中能稳定复制。重组分枝杆菌于42 ℃诱导2 h或45 ℃诱导30 min，经SDS-PAGE，在 32ku的位置能见到明显的蛋白条带，表明32 ku抗原能在分枝杆菌中高效表达。
, http://www.100md.com 中图法分类号 R378.91, R383.2, R979.5， Q343.1
Cloning and Expression of the Schistosoma Japo nicum
32 ku AntigenGene in Mycobacteria
Xiao Hong Zheng Bo Qi Xuezhong et al
(Department of Medical Molecular Biology, Research Cent er of ExperimentalMedicine,Tongji Medical University, Wuhan 430030)
Abstract The Schistosoma japonicum 32 ku antigen (sj32ku) was a protective antigen in the adult. In order to construct therecombinant vaccine against Sc histosoma japonicum, the complete coding sequence of sj32ku gene was inserted intothe Escherichia coli-Mycobacteria shuttle plasmid (pBCG2100) which was controlled by M.tubercuiosis heatshock protein70 (hsp70) protomer and coul d express foreign gene efficently. The recombinant plasmid (pBCG-sj32) wasiden tified by PCR and restriction endonuclease cut. pBCG-sj32 could replicate in bo th E.coli and mycobacteriasystems . The coding sequence of sj32 ku was cloned exactly into the downstream of the hsp70 promoter and could beexpressed at 42℃,45 ℃ in Mycobacteria. The expressed sj32ku protein could be obse rved in SDS-PAGE with themolecular weight of 32 ku.
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Keywords Mycobacteria; plasmids; Schistosoma ja ponicum; vaccines, synthetic; geneexpression
疫苗在疾病防治中占重要地位，以卡介苗(Bacillus calmette guerin，简称BCG)为主的分枝杆菌疫苗由于具有其它疫苗不可比拟的优越性而得到广泛的应用。快生长耻垢分枝杆菌(M.Smegmatis)是一种非致病性的、比BCG生长快的分枝杆菌，分枝杆菌分子生物学方法的发展可使外源基因在其内表达[1]，因此，耻垢分枝杆菌有望成为一种有吸引力的重组基因工程活疫苗。
在日本血吸虫候选的抗原中，32ku抗原不但可用于免疫学诊断[2，3]，而且可诱导机体产生免疫保护作用[4]，是一种理想的候选疫苗抗原。本研究利用分子生物学技术，将日本血吸虫32 ku 抗原的编码基因克隆到大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒pBCG2100中，研究其在耻垢分枝杆菌mc2155的表达情况，为日本血吸虫病的防治及分枝杆菌多价疫苗的发展奠定了基础。
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1 材料与方法
1.1 材料
pBluescript-sj32(含日本血吸虫32ku抗原基因)为同济医科大学寄生虫学教研室提供。穿梭质粒pBCG2100为本室构建。耻垢分枝杆菌(M.Smegmatis mc2155)由美国Dr.Jacobs赠送。DNA限制性内切酶、T4 DNA连接酶以及DNA和蛋白质分子质量标准，均购于华美生物工程公司。为鉴定sj32阳性克隆设计 PCR引物P1：AGC TCT ACA TAT TCA GGA GG A TTC ACCATG(pBCG2100 hsp70 promoter 5′端引物)，引物P2：CGC TCT AGA GAA TTA TTT TAA CTT AACCGC(sj32 ku 基因3′端引物)，由上海生工生物工程公司合成。
1.2 方法
1.2.1重组DNA技术：参照文献[5]。
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1.2.2 日本血吸虫32 ku抗原基因表达载体的构建：质粒pBluescript(sk)-sj32用KpnI酶 切，再用BamH I酶切，低熔点琼脂糖凝胶电泳回收sj32 ku抗原基因片段; pBCG2100质粒 用Kpn I酶切，再用BamH I酶切，低熔点琼脂糖凝胶电泳回收；回收的sj32 ku抗原基因 片段与回收的pBCG2100连接，即构建成穿梭质粒pBCG-sj32(图1)。
图1 重组质粒pBCG-sj32的构建
OriE:大肠杆菌复制子; OriM: 分枝杆菌复制子;
Phsp70: 结核杆菌热休克蛋白70启动子; MCS:多克隆位点;sj32: 血吸虫32 ku抗原基因
1.2.3 分枝杆菌的培养与转化： 从平板上挑取M.Smegmatismc2155于100 ml M7H 9-Tween80(含0.05 ml/L)的液体培养基中，37 ℃培养至对数期(波长600nm吸光度为0. 5～1.0), 冰浴2.5 h; 4℃ 5000 r/min 离心10 min, 收集细菌，沉淀悬浮于100 ml预冷 的10ml/L甘油中，4 ℃ 3000 r/min 离心10 min，沉淀悬浮于50 ml预冷的10 ml/L甘油中 ，4℃ 2000 r/min离心10min，沉淀悬浮于25 ml预冷的10 ml/L甘油中，4 ℃ 1500 r/min 离心15 min，沉淀悬浮于1.5 ml预冷的10ml/L甘油中, 此细胞可直接用于电转化。80 μl 细胞于eppendorf管中，加入2 μl DNA(约1 μg)，冰浴1min，将Gene Pulser(Bio-Rad) 设置为2.5 kV, 25 μF, Gene controller设置为1000Ω,进行电转化(转化常数约为15～ 25 ms)，立即加入1 ml M7H9培养基中，轻轻混匀，转入玻璃试管，37℃温育2 h，取0.1 ml涂于含25 mg/L卡那霉素的M7H9培养基平板上37℃孵育。
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1.2.4 分枝杆菌的培养： 受体菌M.Smegmatis mc2155在37 ℃培养于含0.05 ml/LTween-80的M7H9培养基中，转化子则在含25 mg/L卡那霉素的M7H9固体培养基上筛选 。
1.2.5 分枝杆菌的诱导表达及SDS-PAGE：分别从含25 mg/L卡那霉素的平板上挑取含pBCG-sj32的M.Smegmatis mc2155转化子pBCG-sj32 和pBCG2100(对照)，3 7℃于M7H9液体培养基中，150 r/min培养48～72 h，于42 ℃诱导2 h或45 ℃诱导30 min， 离心收集菌体,沉淀用1ml分枝杆菌裂解液(250 g/L surose,50 mmol/L EDTA,50 mmol/L Tr is-HCl，pH8.0)悬浮，加入10 g/LSDS(十二烷基磺酸钠)至终浓度为1 g/L，37 ℃水浴 至溶液粘稠，加等体积2×SDS加样缓冲液(100 mmol/LTris-HCl,pH6.8，100 ml/L巯基 乙醇，40 g/L SDS，2 g/L溴酚蓝，200 ml/L甘油)100 ℃ ,4 min,取25μl用于SDS-PAGE 分析，用coomassie blue染色。
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2 结果
2.1 重组体pBCG-sj32的酶切鉴定
重组体pBCG-sj32酶切鉴定结果如图2所示，XbalI.SmalI单酶切显示重组体的分子大小 为7.1kb，BamHI、KpnI双酶切得到两个片段，分子大小为5.7 kb和1.4 kb，与载体和sj32分子大小相符，PCR鉴定结果如图3所示，P1引物为pBCG2100上hsp70启动子引物，P2为sj3 2ku基因的3′端引物,以pBCG-sj32为模板，经PCR扩增出sj32基因(1.4 kb),证明sj32ku基因已克隆到载体pBCG2100，阳性克隆命名为pBCG-sj32。
图2 重组质粒pBCG-sj32的酶切鉴定
1： pBCG-sj32用SmalI酶切； 2： pBCG-sj32用XbalI酶切； 3： pBCG2100 用BamHI酶切； 4：pBCG-sj32用KpnI+BamHI双酶切； 5： λDNA EcoRI+HindⅢ 双酶切分子量标准
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图3 重组质粒pBCG-sj32的PCR鉴定
1为 阴性对照； 2为pBCG-sj32 PCR产物；3为PCR分子标准
2.2 32ku抗原基因在分枝杆菌中的表达
如图4所示，含质粒pBCG-sj32的耻垢分枝杆菌M.Smegmatis mc2155，42 ℃ 诱导2 h、45 ℃水浴诱导30min，在分子质量为32 ku处均有明显的表达蛋白带(图4)。
图4 日本血吸虫32ku抗原在耻垢分枝杆菌表达的SDS-PAGE图 谱
1为蛋白分子质量标准；2、3为pBCG-sj32/M.Smegmatis mc2155菌体45 ℃诱导后总蛋白； 4、5为pBCG-sj32/M.Smegmatismc2155菌体42 ℃诱导总蛋白； 6为pBCG2100/M.Smegmatis mc2155菌体总蛋白；7、8为pBCG-sj32/M.Smegmatis mc2155菌体37 ℃总蛋白
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3 讨论
分枝杆菌(如BCG)能在体内巨噬细胞内存活，并将自身产生的蛋白质释放到宿主细胞中，经抗原提呈处理后，刺激宿主免疫系统，使细胞毒T细胞(CTL)和Th1淋巴细胞产生γ-IFN，增强抗微生物 效应[6]。用表达免疫缺陷病毒 gag 的重组BCG免疫小鼠及弥猴的实验表明：外源蛋白在宿主细胞内经处理后与MHC-I类抗原结合而发挥CTL作用，也能诱导机体产生特异的体液免疫[1,6，7]。我们小组已成功地将日本血吸虫26 ku抗原基因在耻垢分枝杆菌和BCG中获得了高效表达，用其免疫小鼠，证明对日本血吸虫尾蚴的攻击感染有明显的对抗作用，其减虫率达39.8% (P<0.01),减卵率达62.1% (P<0.001)。因此用分枝杆菌疫苗表达病原体的保护性抗原，可达到预防疾病的目的，而且有着其它疫苗不可比拟的优越性。其优越性：(1) 所表达的保护性抗原不需纯化，可直接用于免疫反应，免去了蛋白质处理的复杂过程；(2) 因分枝杆菌是活疫苗，可在体内长期存活并不断产生外源抗原，单次接种即可持续诱导对靶抗原的反应、维持机体的免疫反应；(3) 运用分子生物学手段，通过对靶抗原的修饰，可使疫苗理想化；(4) 分枝杆菌本身可作为一种强免疫佐剂，提高宿主的免疫力。
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M.Smegmatismc2155是一种生长快、转化效率高的分枝杆菌突变株，作为构建重组BCG疫苗的预实验，可解决BCG生长缓慢的问题，大大加快基因工程疫苗的研究；而且它本身无致病性，是一种强的细胞免疫佐剂，可被发展成为一种新型活疫苗载体。
热休克蛋白(hsp)是所有原核和真核细胞遭受高温和其他应激所产生的一组高度保守的蛋白质分子，其中热休克蛋白70(hsp70)由于在进化过程中具有高度的保守性[9]、应激条件下能过量表达，所以用人结核杆菌hsp70启动子作为分枝杆菌中表达外源基因的启动子，既有利于分枝杆菌的RNA聚合酶识别，又易于通过应激对其转录进行控制。
血吸虫成虫32ku蛋白具有较高的特异性和敏感性，免疫学诊断价值已得到公认[2 .3]。血吸虫32ku蛋白现已证实为天冬酰胺肽链酶[10]，该蛋白作为疫苗抗原也具有潜在价值。沈定文等[4]对32 ku蛋白的保护性免疫力研究发现可使小鼠减虫率达28.1%，减卵率达71.4% ，虫卵肉芽肿面积和周长均值明显低于对照组，提示sj32蛋白可减少虫负荷、降低成虫的产卵率、抑制虫卵肉芽肿的形成。因此，表达32 ku抗原基因的分枝杆菌疫苗有望成为一种非常有效的血吸虫疫苗。
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我们将编码sj32ku抗原的基因按正确的阅读框顺序连接于hsp70启动子下游，替代hsp70 的编码区，使32ku抗原基因在分枝杆菌M.Smegmatis mc2155中诱导表达。同时发现 pBCG-sj32/M.Smegmatismc2155未经热诱导，在37 ℃也有sj32 ku蛋白的表达，说明该穿梭质粒为高拷贝质粒，外源基因的表达为组成型。M.Smegmatis表达系统的建立，为研究日本血吸虫病新型多价疫苗奠定了基础。
国务院总理基金资助项目(94-Y-19),国家自然科学基金资助项目(No.394800 22)
肖红，女，1970年生，讲师。现址：广州第一军医大学附属南方医院传染科博士研究生，广州 510515
参 考 文 献
1，Aldovini A, Young R A. Humoral andcell-mediated immune response to live recombinant BCG-HIV vaccines. Nature,1991,351:479
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2 石佑恩, Dell R, Diesfeld H J et al. 日本血吸虫成虫31/32 ku诊断蛋白：与血吸虫单克隆抗体和病人血清的免疫印斑反应. 中国寄生虫学及寄生虫病杂志, 1988 ,6(4)：245
3，Ruppel A,Diesjed H J,Rothers U. Immunoblot analysis of Schistosoma mansoniantigens with sera of Schistosomiasis patients:diagnostic potential o f an adult Schistosome polypeptide. Clin Exp Immunol,1985,62:499
4，沈定文，李雍龙，韩家俊等.日本血吸虫成虫31/32ku蛋白的纯化及保护性免 疫力的研究. 中国寄生虫学及寄生虫病杂志, 1993,11(4)：241
, 百拇医药 5 Sambrook J E F,Fritsch E F, Mantiatis T. Molecular cloning. A Labor atory Mannual. New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press,1987.97
6，程继忠，皇甫永穆.重组BCG疫苗的研究进展.微生物学杂志, 1996，16(4) ：47
7，Gheorghiu M,LagranderieM R R, Gicquel B M E et al. Mycobacteriu m bovis BCG priming induces a strong potentiation of the antibody reponseinduce d by reconbinant BCG expressing a foreign antigen.Infec Immun, 1994,6 2:4287
, 百拇医药
8，石佑恩，皇甫永穆，韩家俊等.日本血吸虫基因工程BCG多价疫苗的研究.中国 血吸虫病防治杂志,1998，10(增刊)：27
9，程继忠，郑波，肖红等，结核杆菌HSP70在耻垢分枝杆菌中的表达及其免疫原性研究.中华微生物学和免疫学杂志, 1998，18(5)：337
10，Dalton J P, Hola-JamriskaL, Brindley P J. Asparaginyl endopeptidas e activity in adult Schistosoma mansoni. Parasitol,1995,111:575
(1999-05-05 收稿), 百拇医药
单位：同济医科大学实验医学研究中心医学分子生物学研究室，武汉 430030
关键词：分枝杆菌；质粒；血吸虫；日本；疫苗，合成；基因表达
同济医科大学学报000102 摘要 日本血吸虫32 ku抗原(简称sj32ku)是血吸虫的一种保护性抗原, 为研究其重组疫苗的保护作用，将该抗原基因的全编码序列按正确的阅读框顺序插入到穿梭质粒pBCG2100, 受控于人结核杆菌热休克蛋白70(Heat shock protein70，简称hsp70)启动子，构建成重组表达质粒 pBCG-sj32，在大肠杆菌-分枝杆菌两个系统中能稳定复制。重组分枝杆菌于42 ℃诱导2 h或45 ℃诱导30 min，经SDS-PAGE，在 32ku的位置能见到明显的蛋白条带，表明32 ku抗原能在分枝杆菌中高效表达。
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Cloning and Expression of the Schistosoma Japo nicum
32 ku AntigenGene in Mycobacteria
Xiao Hong Zheng Bo Qi Xuezhong et al
(Department of Medical Molecular Biology, Research Cent er of ExperimentalMedicine,Tongji Medical University, Wuhan 430030)
Abstract The Schistosoma japonicum 32 ku antigen (sj32ku) was a protective antigen in the adult. In order to construct therecombinant vaccine against Sc histosoma japonicum, the complete coding sequence of sj32ku gene was inserted intothe Escherichia coli-Mycobacteria shuttle plasmid (pBCG2100) which was controlled by M.tubercuiosis heatshock protein70 (hsp70) protomer and coul d express foreign gene efficently. The recombinant plasmid (pBCG-sj32) wasiden tified by PCR and restriction endonuclease cut. pBCG-sj32 could replicate in bo th E.coli and mycobacteriasystems . The coding sequence of sj32 ku was cloned exactly into the downstream of the hsp70 promoter and could beexpressed at 42℃,45 ℃ in Mycobacteria. The expressed sj32ku protein could be obse rved in SDS-PAGE with themolecular weight of 32 ku.
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Keywords Mycobacteria; plasmids; Schistosoma ja ponicum; vaccines, synthetic; geneexpression
疫苗在疾病防治中占重要地位，以卡介苗(Bacillus calmette guerin，简称BCG)为主的分枝杆菌疫苗由于具有其它疫苗不可比拟的优越性而得到广泛的应用。快生长耻垢分枝杆菌(M.Smegmatis)是一种非致病性的、比BCG生长快的分枝杆菌，分枝杆菌分子生物学方法的发展可使外源基因在其内表达[1]，因此，耻垢分枝杆菌有望成为一种有吸引力的重组基因工程活疫苗。
在日本血吸虫候选的抗原中，32ku抗原不但可用于免疫学诊断[2，3]，而且可诱导机体产生免疫保护作用[4]，是一种理想的候选疫苗抗原。本研究利用分子生物学技术，将日本血吸虫32 ku 抗原的编码基因克隆到大肠杆菌-分枝杆菌穿梭质粒pBCG2100中，研究其在耻垢分枝杆菌mc2155的表达情况，为日本血吸虫病的防治及分枝杆菌多价疫苗的发展奠定了基础。
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1 材料与方法
1.1 材料
pBluescript-sj32(含日本血吸虫32ku抗原基因)为同济医科大学寄生虫学教研室提供。穿梭质粒pBCG2100为本室构建。耻垢分枝杆菌(M.Smegmatis mc2155)由美国Dr.Jacobs赠送。DNA限制性内切酶、T4 DNA连接酶以及DNA和蛋白质分子质量标准，均购于华美生物工程公司。为鉴定sj32阳性克隆设计 PCR引物P1：AGC TCT ACA TAT TCA GGA GG A TTC ACCATG(pBCG2100 hsp70 promoter 5′端引物)，引物P2：CGC TCT AGA GAA TTA TTT TAA CTT AACCGC(sj32 ku 基因3′端引物)，由上海生工生物工程公司合成。
1.2 方法
1.2.1重组DNA技术：参照文献[5]。
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1.2.2 日本血吸虫32 ku抗原基因表达载体的构建：质粒pBluescript(sk)-sj32用KpnI酶 切，再用BamH I酶切，低熔点琼脂糖凝胶电泳回收sj32 ku抗原基因片段; pBCG2100质粒 用Kpn I酶切，再用BamH I酶切，低熔点琼脂糖凝胶电泳回收；回收的sj32 ku抗原基因 片段与回收的pBCG2100连接，即构建成穿梭质粒pBCG-sj32(图1)。
图1 重组质粒pBCG-sj32的构建
OriE:大肠杆菌复制子; OriM: 分枝杆菌复制子;
Phsp70: 结核杆菌热休克蛋白70启动子; MCS:多克隆位点;sj32: 血吸虫32 ku抗原基因
1.2.3 分枝杆菌的培养与转化： 从平板上挑取M.Smegmatismc2155于100 ml M7H 9-Tween80(含0.05 ml/L)的液体培养基中，37 ℃培养至对数期(波长600nm吸光度为0. 5～1.0), 冰浴2.5 h; 4℃ 5000 r/min 离心10 min, 收集细菌，沉淀悬浮于100 ml预冷 的10ml/L甘油中，4 ℃ 3000 r/min 离心10 min，沉淀悬浮于50 ml预冷的10 ml/L甘油中 ，4℃ 2000 r/min离心10min，沉淀悬浮于25 ml预冷的10 ml/L甘油中，4 ℃ 1500 r/min 离心15 min，沉淀悬浮于1.5 ml预冷的10ml/L甘油中, 此细胞可直接用于电转化。80 μl 细胞于eppendorf管中，加入2 μl DNA(约1 μg)，冰浴1min，将Gene Pulser(Bio-Rad) 设置为2.5 kV, 25 μF, Gene controller设置为1000Ω,进行电转化(转化常数约为15～ 25 ms)，立即加入1 ml M7H9培养基中，轻轻混匀，转入玻璃试管，37℃温育2 h，取0.1 ml涂于含25 mg/L卡那霉素的M7H9培养基平板上37℃孵育。
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1.2.4 分枝杆菌的培养： 受体菌M.Smegmatis mc2155在37 ℃培养于含0.05 ml/LTween-80的M7H9培养基中，转化子则在含25 mg/L卡那霉素的M7H9固体培养基上筛选 。
1.2.5 分枝杆菌的诱导表达及SDS-PAGE：分别从含25 mg/L卡那霉素的平板上挑取含pBCG-sj32的M.Smegmatis mc2155转化子pBCG-sj32 和pBCG2100(对照)，3 7℃于M7H9液体培养基中，150 r/min培养48～72 h，于42 ℃诱导2 h或45 ℃诱导30 min， 离心收集菌体,沉淀用1ml分枝杆菌裂解液(250 g/L surose,50 mmol/L EDTA,50 mmol/L Tr is-HCl，pH8.0)悬浮，加入10 g/LSDS(十二烷基磺酸钠)至终浓度为1 g/L，37 ℃水浴 至溶液粘稠，加等体积2×SDS加样缓冲液(100 mmol/LTris-HCl,pH6.8，100 ml/L巯基 乙醇，40 g/L SDS，2 g/L溴酚蓝，200 ml/L甘油)100 ℃ ,4 min,取25μl用于SDS-PAGE 分析，用coomassie blue染色。
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2 结果
2.1 重组体pBCG-sj32的酶切鉴定
重组体pBCG-sj32酶切鉴定结果如图2所示，XbalI.SmalI单酶切显示重组体的分子大小 为7.1kb，BamHI、KpnI双酶切得到两个片段，分子大小为5.7 kb和1.4 kb，与载体和sj32分子大小相符，PCR鉴定结果如图3所示，P1引物为pBCG2100上hsp70启动子引物，P2为sj3 2ku基因的3′端引物,以pBCG-sj32为模板，经PCR扩增出sj32基因(1.4 kb),证明sj32ku基因已克隆到载体pBCG2100，阳性克隆命名为pBCG-sj32。
图2 重组质粒pBCG-sj32的酶切鉴定
1： pBCG-sj32用SmalI酶切； 2： pBCG-sj32用XbalI酶切； 3： pBCG2100 用BamHI酶切； 4：pBCG-sj32用KpnI+BamHI双酶切； 5： λDNA EcoRI+HindⅢ 双酶切分子量标准
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图3 重组质粒pBCG-sj32的PCR鉴定
1为 阴性对照； 2为pBCG-sj32 PCR产物；3为PCR分子标准
2.2 32ku抗原基因在分枝杆菌中的表达
如图4所示，含质粒pBCG-sj32的耻垢分枝杆菌M.Smegmatis mc2155，42 ℃ 诱导2 h、45 ℃水浴诱导30min，在分子质量为32 ku处均有明显的表达蛋白带(图4)。
图4 日本血吸虫32ku抗原在耻垢分枝杆菌表达的SDS-PAGE图 谱
1为蛋白分子质量标准；2、3为pBCG-sj32/M.Smegmatis mc2155菌体45 ℃诱导后总蛋白； 4、5为pBCG-sj32/M.Smegmatismc2155菌体42 ℃诱导总蛋白； 6为pBCG2100/M.Smegmatis mc2155菌体总蛋白；7、8为pBCG-sj32/M.Smegmatis mc2155菌体37 ℃总蛋白
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3 讨论
分枝杆菌(如BCG)能在体内巨噬细胞内存活，并将自身产生的蛋白质释放到宿主细胞中，经抗原提呈处理后，刺激宿主免疫系统，使细胞毒T细胞(CTL)和Th1淋巴细胞产生γ-IFN，增强抗微生物 效应[6]。用表达免疫缺陷病毒 gag 的重组BCG免疫小鼠及弥猴的实验表明：外源蛋白在宿主细胞内经处理后与MHC-I类抗原结合而发挥CTL作用，也能诱导机体产生特异的体液免疫[1,6，7]。我们小组已成功地将日本血吸虫26 ku抗原基因在耻垢分枝杆菌和BCG中获得了高效表达，用其免疫小鼠，证明对日本血吸虫尾蚴的攻击感染有明显的对抗作用，其减虫率达39.8% (P<0.01),减卵率达62.1% (P<0.001)。因此用分枝杆菌疫苗表达病原体的保护性抗原，可达到预防疾病的目的，而且有着其它疫苗不可比拟的优越性。其优越性：(1) 所表达的保护性抗原不需纯化，可直接用于免疫反应，免去了蛋白质处理的复杂过程；(2) 因分枝杆菌是活疫苗，可在体内长期存活并不断产生外源抗原，单次接种即可持续诱导对靶抗原的反应、维持机体的免疫反应；(3) 运用分子生物学手段，通过对靶抗原的修饰，可使疫苗理想化；(4) 分枝杆菌本身可作为一种强免疫佐剂，提高宿主的免疫力。
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M.Smegmatismc2155是一种生长快、转化效率高的分枝杆菌突变株，作为构建重组BCG疫苗的预实验，可解决BCG生长缓慢的问题，大大加快基因工程疫苗的研究；而且它本身无致病性，是一种强的细胞免疫佐剂，可被发展成为一种新型活疫苗载体。
热休克蛋白(hsp)是所有原核和真核细胞遭受高温和其他应激所产生的一组高度保守的蛋白质分子，其中热休克蛋白70(hsp70)由于在进化过程中具有高度的保守性[9]、应激条件下能过量表达，所以用人结核杆菌hsp70启动子作为分枝杆菌中表达外源基因的启动子，既有利于分枝杆菌的RNA聚合酶识别，又易于通过应激对其转录进行控制。
血吸虫成虫32ku蛋白具有较高的特异性和敏感性，免疫学诊断价值已得到公认[2 .3]。血吸虫32ku蛋白现已证实为天冬酰胺肽链酶[10]，该蛋白作为疫苗抗原也具有潜在价值。沈定文等[4]对32 ku蛋白的保护性免疫力研究发现可使小鼠减虫率达28.1%，减卵率达71.4% ，虫卵肉芽肿面积和周长均值明显低于对照组，提示sj32蛋白可减少虫负荷、降低成虫的产卵率、抑制虫卵肉芽肿的形成。因此，表达32 ku抗原基因的分枝杆菌疫苗有望成为一种非常有效的血吸虫疫苗。
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我们将编码sj32ku抗原的基因按正确的阅读框顺序连接于hsp70启动子下游，替代hsp70 的编码区，使32ku抗原基因在分枝杆菌M.Smegmatis mc2155中诱导表达。同时发现 pBCG-sj32/M.Smegmatismc2155未经热诱导，在37 ℃也有sj32 ku蛋白的表达，说明该穿梭质粒为高拷贝质粒，外源基因的表达为组成型。M.Smegmatis表达系统的建立，为研究日本血吸虫病新型多价疫苗奠定了基础。
国务院总理基金资助项目(94-Y-19),国家自然科学基金资助项目(No.394800 22)
肖红，女，1970年生，讲师。现址：广州第一军医大学附属南方医院传染科博士研究生，广州 510515
参 考 文 献
1，Aldovini A, Young R A. Humoral andcell-mediated immune response to live recombinant BCG-HIV vaccines. Nature,1991,351:479
, http://www.100md.com
2 石佑恩, Dell R, Diesfeld H J et al. 日本血吸虫成虫31/32 ku诊断蛋白：与血吸虫单克隆抗体和病人血清的免疫印斑反应. 中国寄生虫学及寄生虫病杂志, 1988 ,6(4)：245
3，Ruppel A,Diesjed H J,Rothers U. Immunoblot analysis of Schistosoma mansoniantigens with sera of Schistosomiasis patients:diagnostic potential o f an adult Schistosome polypeptide. Clin Exp Immunol,1985,62:499
4，沈定文，李雍龙，韩家俊等.日本血吸虫成虫31/32ku蛋白的纯化及保护性免 疫力的研究. 中国寄生虫学及寄生虫病杂志, 1993,11(4)：241
, 百拇医药 5 Sambrook J E F,Fritsch E F, Mantiatis T. Molecular cloning. A Labor atory Mannual. New York:Cold SpringHarbor Laboratory Press,1987.97
6，程继忠，皇甫永穆.重组BCG疫苗的研究进展.微生物学杂志, 1996，16(4) ：47
7，Gheorghiu M,LagranderieM R R, Gicquel B M E et al. Mycobacteriu m bovis BCG priming induces a strong potentiation of the antibody reponseinduce d by reconbinant BCG expressing a foreign antigen.Infec Immun, 1994,6 2:4287
, 百拇医药
8，石佑恩，皇甫永穆，韩家俊等.日本血吸虫基因工程BCG多价疫苗的研究.中国 血吸虫病防治杂志,1998，10(增刊)：27
9，程继忠，郑波，肖红等，结核杆菌HSP70在耻垢分枝杆菌中的表达及其免疫原性研究.中华微生物学和免疫学杂志, 1998，18(5)：337
10，Dalton J P, Hola-JamriskaL, Brindley P J. Asparaginyl endopeptidas e activity in adult Schistosoma mansoni. Parasitol,1995,111:575
(1999-05-05 收稿), 百拇医药