大鼠局灶性脑缺血半暗带细胞凋亡动态变化规律的研究
作者：赵性泉 龙洁 张在强 李小玲 王群
单位：(首都医科大学附属北京天坛医院神经内科)
关键词：细胞凋亡；缺血半暗带；大脑中动脉阻塞
首都医科大学学报000108 摘 要：用线栓法制作大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型，然后用特异性细胞凋亡检测方法(TUNEL法)，对局灶缺血后不同时间点的脑组织进行观察。发现MCAO后各时间点局灶缺血范围内被标记的染色阳性的凋亡细胞主要位于局灶性缺血半暗带区，而且随着缺血时间的延长，凋亡细胞数逐渐增多(缺血1、3、6、12 h分别为3.60±1.02 、15.60±2.06、22.40±1.85、33.00±2.83/mm2)，24 h达到高峰(46.60±3.01/mm2)，48 h以后明显减少(13.60±2.47/mm2)，72 h以后，凋亡表现逐渐消失(5.00±1.41/mm2)，各时间点的凋亡细胞数目有显著差异(P<0.01)；同时两两比较表明除缺血后1 h与72 h，3 h与12 h及48 h外，其余各点之间均有显著性差异(P<0.01)。假手术组及对侧大脑半球各时间点基本上没有凋亡细胞出现。本研究从细胞凋亡角度重新认识急性缺血性脑血管病治疗的“时间窗”，为缺血性卒中的治疗提供依据。
, http://www.100md.com
分类号：R364.1+1; R743
Dynamic Changes of Apoptosis Happened
in Local Ischemic Penumbra of Rats
Zhao Xingquan Long Jie Zhang Zaiqiang Li Xiaoling Wang Qun
(Department of Neurology, Beijing Tiantan Hosptal, Affiliate of Capital University of Medical Sciences)
Abstract：In order to observe dynamic change characters of the apoptosis happened in the local ischemic penumbra of rats,models of MCAO(middle cerebral artery obstruction)were made with the thread-plugged method. A specific method to test apoptosis named TUNEL method was supplied to observe the ischemia involved brain tissue that happened at different time. Most of the marked positive cells, which were detected at different time, were noticed at local ischemic penumbra areas. The number of apoptosis cells were 3.60±1.02/mm2, 15.60±2.06/mm2, 22.40±1.85/mm2, 33.00±2.83/mm2 respectively which were calculated at 1,3,6,12 h after artery obstruction .It reached at 46.60±3.01/mm2 24 h after obstruction and reduced to 13.60±2.47/mm2 48 h later. It gradually disappeared (5.00±1.41/mm2)after 72 h. The differences above were confirmed by the statistic analyses(P<0.01).The number of apoptosis increased following the duration after ischemia of brains, it reached at peak value at 24 h later and reduced significantly after 48 h,then, it almost disappeared after 72 h of obstruction.
, 百拇医药
Key words：apoptosis； ischemic penumbra； MCAO ▲
为探讨脑局灶性缺血损伤后缺血半暗带细胞凋亡的动态变化规律，探讨急性缺血性脑卒中治疗的“时间窗”，于1998年10月至1999年3月，对大鼠局灶性脑缺血后不同时间点凋亡细胞的分布部位及数目进行了观察。
1 材料和方法
雄性Wistar大鼠40只(均为中国医学科学院动物研究所提供的1级大鼠)，体质量250～300 g。
用Koizumi和Zea Longa线栓法制作大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型，按缺血时间分为A、B、C、D、E、F、G组及S组(假手术组)，每组5只，分别在1、3、6、12、24、48、72 h处死取脑(S组在24 h取脑)。立即用10%中性甲醛固定24 h以上，常规用梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。取尾壳核平面切片(厚10 μm)，进行HE染色和原位末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)标记法(TdT-mediated dUTP nick end Labeling，TUNEL)细胞凋亡检测，光镜下进行观察。
, http://www.100md.com
观察HE染色的脑组织切片缺血不同时间点的组织病理形态学特征及其演变规律。TUNEL法染色的脑组织切片染色为黄色的细胞为阳性凋亡细胞，观察缺血不同时间点凋亡细胞的分布及数目，总结出凋亡细胞的分布和时程变化规律。
统计分析采用SPSS FOR WINDOWS软件中双因素方差分析及两两比较。
2 结果
2.1 对各时间点HE染色组织切片的观察
发现在缺血的中心部位(1、2、3、5、7区)神经元的破坏在缺血后6 h即可出现，并随着缺血时间的延长逐渐向半暗带区(4、60区)扩展，脑梗死灶逐渐扩大，但半暗带区神经元的完整性保持相对较好且时间相对较长。
2.2 TUNEL法凋亡细胞检测结果
, 百拇医药 发现MCAO后各时间点局灶缺血范围内被标记的染色阳性细胞主要位于局灶性缺血半暗带区，即额顶皮质上部、扣带皮质和尾壳核内侧部，而缺血中心区极少见到。由表1可见，凋亡细胞在缺血1 h即可出现(3.60±1.02/mm2)，随缺血时间的延长，在缺血3、6、12 h凋亡细胞逐渐增多(分别为15.60±2.06、22.40±1.85、33.00±2.83/ mm2)，直至出现细胞固缩、凋亡小体出现等凋亡中晚期形态特征，并在24 h达到高峰(46.60±3.01/ mm2)，48 h以后凋亡细胞明显减少(13.60±2.47/ mm2)，72 h以后，凋亡表现逐渐消失(5.00±1.41/ mm2)。对各时间点的凋亡细胞数目进行双因素方差分析，均有非常显著性差异(P<0.01)；两两比较表明各时间点除缺血后1 h与72 h，3 h与12 h及48 h外，其余各点之间均有非常显著性差异(P<0.01)，而每时间点的5只小鼠之间的比较没有统计学差异(P>0.05)。假手术组仅为0.60±0.80/ mm2，对侧半球脑组织基本未见到染色阳性的神经元。
, 百拇医药
表1 TUNEL法凋亡细胞数检测结果 个/mm2 动物编号
A组
B组
C组
D组
E组
F组
G组
S组
1
4
15
22
, 百拇医药
31
46
13
6
0
2
3
12
24
33
44
12
5
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, 百拇医药
3
5
18
25
29
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4
0
4
4
16
21
35
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51
11
7
2
5
2
17
20
37
43
14
3
0
3 讨论
, http://www.100md.com
3.1 急性局灶性脑缺血后缺血半暗带内神经元凋亡的动态变化
局灶性脑缺血发生后神经元的死亡有2种不同的方式：细胞坏死(necrosis)和细胞凋亡(apoptosis)，且两者可以并存[1，2]。在缺血灶的中心区域以神经元的坏死为主，而在缺血半暗带区以神经元的凋亡为主[3，4]。本项研究应用原位末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)标记法(TUNEL)对各组大鼠的组织切片进行细胞凋亡特异性检测。结果发现：缺血早期(3 h内)在缺血中心区可见到零星分布的凋亡细胞。随着缺血时间的延长，凋亡细胞数目逐渐增多，至24 h达到高峰。缺血24 h后，凋亡细胞数目开始减少，至缺血72 h，半暗带内的神经元已基本全部死亡，这与国外的文献报道基本一致[5，6]。
3.2 局灶性脑缺血半暗带神经元细胞凋亡的发生机制
目前较为普遍的观点认为：神经元缺血损伤的程度取决于其组织灌注量下降的程度，不完全和短暂缺血导致了细胞凋亡的出现[7，8]。脑局灶性缺血损伤发生时，缺血半暗带位于缺血灶的周围，缺血程度相对较轻，加之侧支循环的及时建立，使半暗带区在缺血损伤后一定时间内能够保持一定的血液灌注，该区域的神经元虽不能维持其正常的生理功能，但保持了部分蛋白合成能力和某些基因的表达。由于半暗带内的神经元受到不同程度的缺血缺氧损害，细胞膜去极化造成Ca2+异常内流，使Ca2+依赖性的核酸内切酶被激活，这种酶作用于DNA链,最后形成凋亡细胞特异的凋亡小体(apoptotic bodies)。由于细胞外的Ca2+内流，刺激突触前终板释放过量的兴奋性氨基酸(EAAs)，造成大量的EAAs在缺血组织堆积[9]，进一步改变了细胞膜的通透性能，加剧Ca2+内流导致神经元凋亡程序的起动。
, http://www.100md.com
3.3 脑缺血半暗带区的“可塑性”与临床干预的“时间窗”
在缺血半暗带区内存在一些特殊的蛋白及与细胞凋亡有关的基因，它们使缺血半暗带区域的神经元能够在一定时间内不发生坏死[10]，而是发生以细胞凋亡为主的程序性细胞死亡，使得该部位的神经元有机会在得到再灌注或药物干预的情况下发生逆转。这种特性称之为缺血半暗带的“可塑性”，它为临床上预防和治疗局灶性脑缺血后的神经元损害提供了可能。
研究结果提示可通过减少刺激细胞凋亡起动的因素或调节其调控基因的表达等方式，阻止细胞凋亡发生。细胞凋亡时程变化的规律为临床上进行缺血区域再灌注和药物干预的时机即“时间窗”提供了理论依据。提示在24 h内进行干预是最佳时机，它可能使受到缺血损害的神经元恢复其正常生理功能，最大限度地保留神经功能。■
参考文献：
[1]Hill H E.DNA fragmentation indicative of apoptosis following unilateral cerebral hyoxia ischemia in the neonatal rat. Brain Res，1995，676：398～403
, 百拇医药
[2]Charriant M C.Apoptosis and necrosis after reversible focal ischemia.J Cereb Blood Flow Metab，1996,16：186～194
[3]Kiessling M，Gass P.Stimulus-transcription coupling in focal cerebral ischemia.Brain Pathol,1994,4(1):77～83
[4]Memezawa H.Ischemic penumbra in a model of reversible middle cerebral artery occlusion in the rat. Exp Brain Res，1992,89：67～78
[5]Lonnik M D.Evidence supporting a role for programmed cell death in focal cerebral ischemia in rats . Stroke，1993,676：398～403
, 百拇医药
[6]Macmanus J.Global ischemia can cause DNA fragmentation indicative of apoptosis in rat brain.Neurosci Lett，1993,164：691～717
[7]Islam N.Detection of DNA damage induced by apoptosis in the rat brain following incomplete ischemia. Neurosci Lett，1995,188(3)：159～162
[8]Kogure T, Kogure K. Molecular and biochemical events within the brain subjected to cerebral ischemia (targets for therapeutical intervention).Clin Neurosci,1997,4(4):179～183
[9]Mitani A.Origin of ischemia induced glutamine efflux in the CA1 field of the gerbil hippocampus.J Neurochem,1994，63：2152～2164
[10]Qin Z.A review of therapeutic potential in ischemic stroke. Rev Neurol,1998,39(suppl 1):21～25
收稿日期：199-10-06, http://www.100md.com
单位：(首都医科大学附属北京天坛医院神经内科)
关键词：细胞凋亡；缺血半暗带；大脑中动脉阻塞
首都医科大学学报000108 摘 要：用线栓法制作大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型，然后用特异性细胞凋亡检测方法(TUNEL法)，对局灶缺血后不同时间点的脑组织进行观察。发现MCAO后各时间点局灶缺血范围内被标记的染色阳性的凋亡细胞主要位于局灶性缺血半暗带区，而且随着缺血时间的延长，凋亡细胞数逐渐增多(缺血1、3、6、12 h分别为3.60±1.02 、15.60±2.06、22.40±1.85、33.00±2.83/mm2)，24 h达到高峰(46.60±3.01/mm2)，48 h以后明显减少(13.60±2.47/mm2)，72 h以后，凋亡表现逐渐消失(5.00±1.41/mm2)，各时间点的凋亡细胞数目有显著差异(P<0.01)；同时两两比较表明除缺血后1 h与72 h，3 h与12 h及48 h外，其余各点之间均有显著性差异(P<0.01)。假手术组及对侧大脑半球各时间点基本上没有凋亡细胞出现。本研究从细胞凋亡角度重新认识急性缺血性脑血管病治疗的“时间窗”，为缺血性卒中的治疗提供依据。
, http://www.100md.com
分类号：R364.1+1; R743
Dynamic Changes of Apoptosis Happened
in Local Ischemic Penumbra of Rats
Zhao Xingquan Long Jie Zhang Zaiqiang Li Xiaoling Wang Qun
(Department of Neurology, Beijing Tiantan Hosptal, Affiliate of Capital University of Medical Sciences)
Abstract：In order to observe dynamic change characters of the apoptosis happened in the local ischemic penumbra of rats,models of MCAO(middle cerebral artery obstruction)were made with the thread-plugged method. A specific method to test apoptosis named TUNEL method was supplied to observe the ischemia involved brain tissue that happened at different time. Most of the marked positive cells, which were detected at different time, were noticed at local ischemic penumbra areas. The number of apoptosis cells were 3.60±1.02/mm2, 15.60±2.06/mm2, 22.40±1.85/mm2, 33.00±2.83/mm2 respectively which were calculated at 1,3,6,12 h after artery obstruction .It reached at 46.60±3.01/mm2 24 h after obstruction and reduced to 13.60±2.47/mm2 48 h later. It gradually disappeared (5.00±1.41/mm2)after 72 h. The differences above were confirmed by the statistic analyses(P<0.01).The number of apoptosis increased following the duration after ischemia of brains, it reached at peak value at 24 h later and reduced significantly after 48 h,then, it almost disappeared after 72 h of obstruction.
, 百拇医药
Key words：apoptosis； ischemic penumbra； MCAO ▲
为探讨脑局灶性缺血损伤后缺血半暗带细胞凋亡的动态变化规律，探讨急性缺血性脑卒中治疗的“时间窗”，于1998年10月至1999年3月，对大鼠局灶性脑缺血后不同时间点凋亡细胞的分布部位及数目进行了观察。
1 材料和方法
雄性Wistar大鼠40只(均为中国医学科学院动物研究所提供的1级大鼠)，体质量250～300 g。
用Koizumi和Zea Longa线栓法制作大鼠大脑中动脉阻塞(MCAO)模型，按缺血时间分为A、B、C、D、E、F、G组及S组(假手术组)，每组5只，分别在1、3、6、12、24、48、72 h处死取脑(S组在24 h取脑)。立即用10%中性甲醛固定24 h以上，常规用梯度乙醇脱水，二甲苯透明，石蜡包埋。取尾壳核平面切片(厚10 μm)，进行HE染色和原位末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)标记法(TdT-mediated dUTP nick end Labeling，TUNEL)细胞凋亡检测，光镜下进行观察。
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观察HE染色的脑组织切片缺血不同时间点的组织病理形态学特征及其演变规律。TUNEL法染色的脑组织切片染色为黄色的细胞为阳性凋亡细胞，观察缺血不同时间点凋亡细胞的分布及数目，总结出凋亡细胞的分布和时程变化规律。
统计分析采用SPSS FOR WINDOWS软件中双因素方差分析及两两比较。
2 结果
2.1 对各时间点HE染色组织切片的观察
发现在缺血的中心部位(1、2、3、5、7区)神经元的破坏在缺血后6 h即可出现，并随着缺血时间的延长逐渐向半暗带区(4、60区)扩展，脑梗死灶逐渐扩大，但半暗带区神经元的完整性保持相对较好且时间相对较长。
2.2 TUNEL法凋亡细胞检测结果
, 百拇医药 发现MCAO后各时间点局灶缺血范围内被标记的染色阳性细胞主要位于局灶性缺血半暗带区，即额顶皮质上部、扣带皮质和尾壳核内侧部，而缺血中心区极少见到。由表1可见，凋亡细胞在缺血1 h即可出现(3.60±1.02/mm2)，随缺血时间的延长，在缺血3、6、12 h凋亡细胞逐渐增多(分别为15.60±2.06、22.40±1.85、33.00±2.83/ mm2)，直至出现细胞固缩、凋亡小体出现等凋亡中晚期形态特征，并在24 h达到高峰(46.60±3.01/ mm2)，48 h以后凋亡细胞明显减少(13.60±2.47/ mm2)，72 h以后，凋亡表现逐渐消失(5.00±1.41/ mm2)。对各时间点的凋亡细胞数目进行双因素方差分析，均有非常显著性差异(P<0.01)；两两比较表明各时间点除缺血后1 h与72 h，3 h与12 h及48 h外，其余各点之间均有非常显著性差异(P<0.01)，而每时间点的5只小鼠之间的比较没有统计学差异(P>0.05)。假手术组仅为0.60±0.80/ mm2，对侧半球脑组织基本未见到染色阳性的神经元。
, 百拇医药
表1 TUNEL法凋亡细胞数检测结果 个/mm2 动物编号
A组
B组
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3.1 急性局灶性脑缺血后缺血半暗带内神经元凋亡的动态变化
局灶性脑缺血发生后神经元的死亡有2种不同的方式：细胞坏死(necrosis)和细胞凋亡(apoptosis)，且两者可以并存[1，2]。在缺血灶的中心区域以神经元的坏死为主，而在缺血半暗带区以神经元的凋亡为主[3，4]。本项研究应用原位末端脱氧核苷酸转移酶(TdT)标记法(TUNEL)对各组大鼠的组织切片进行细胞凋亡特异性检测。结果发现：缺血早期(3 h内)在缺血中心区可见到零星分布的凋亡细胞。随着缺血时间的延长，凋亡细胞数目逐渐增多，至24 h达到高峰。缺血24 h后，凋亡细胞数目开始减少，至缺血72 h，半暗带内的神经元已基本全部死亡，这与国外的文献报道基本一致[5，6]。
3.2 局灶性脑缺血半暗带神经元细胞凋亡的发生机制
目前较为普遍的观点认为：神经元缺血损伤的程度取决于其组织灌注量下降的程度，不完全和短暂缺血导致了细胞凋亡的出现[7，8]。脑局灶性缺血损伤发生时，缺血半暗带位于缺血灶的周围，缺血程度相对较轻，加之侧支循环的及时建立，使半暗带区在缺血损伤后一定时间内能够保持一定的血液灌注，该区域的神经元虽不能维持其正常的生理功能，但保持了部分蛋白合成能力和某些基因的表达。由于半暗带内的神经元受到不同程度的缺血缺氧损害，细胞膜去极化造成Ca2+异常内流，使Ca2+依赖性的核酸内切酶被激活，这种酶作用于DNA链,最后形成凋亡细胞特异的凋亡小体(apoptotic bodies)。由于细胞外的Ca2+内流，刺激突触前终板释放过量的兴奋性氨基酸(EAAs)，造成大量的EAAs在缺血组织堆积[9]，进一步改变了细胞膜的通透性能，加剧Ca2+内流导致神经元凋亡程序的起动。
, http://www.100md.com
3.3 脑缺血半暗带区的“可塑性”与临床干预的“时间窗”
在缺血半暗带区内存在一些特殊的蛋白及与细胞凋亡有关的基因，它们使缺血半暗带区域的神经元能够在一定时间内不发生坏死[10]，而是发生以细胞凋亡为主的程序性细胞死亡，使得该部位的神经元有机会在得到再灌注或药物干预的情况下发生逆转。这种特性称之为缺血半暗带的“可塑性”，它为临床上预防和治疗局灶性脑缺血后的神经元损害提供了可能。
研究结果提示可通过减少刺激细胞凋亡起动的因素或调节其调控基因的表达等方式，阻止细胞凋亡发生。细胞凋亡时程变化的规律为临床上进行缺血区域再灌注和药物干预的时机即“时间窗”提供了理论依据。提示在24 h内进行干预是最佳时机，它可能使受到缺血损害的神经元恢复其正常生理功能，最大限度地保留神经功能。■
参考文献：
[1]Hill H E.DNA fragmentation indicative of apoptosis following unilateral cerebral hyoxia ischemia in the neonatal rat. Brain Res，1995，676：398～403
, 百拇医药
[2]Charriant M C.Apoptosis and necrosis after reversible focal ischemia.J Cereb Blood Flow Metab，1996,16：186～194
[3]Kiessling M，Gass P.Stimulus-transcription coupling in focal cerebral ischemia.Brain Pathol,1994,4(1):77～83
[4]Memezawa H.Ischemic penumbra in a model of reversible middle cerebral artery occlusion in the rat. Exp Brain Res，1992,89：67～78
[5]Lonnik M D.Evidence supporting a role for programmed cell death in focal cerebral ischemia in rats . Stroke，1993,676：398～403
, 百拇医药
[6]Macmanus J.Global ischemia can cause DNA fragmentation indicative of apoptosis in rat brain.Neurosci Lett，1993,164：691～717
[7]Islam N.Detection of DNA damage induced by apoptosis in the rat brain following incomplete ischemia. Neurosci Lett，1995,188(3)：159～162
[8]Kogure T, Kogure K. Molecular and biochemical events within the brain subjected to cerebral ischemia (targets for therapeutical intervention).Clin Neurosci,1997,4(4):179～183
[9]Mitani A.Origin of ischemia induced glutamine efflux in the CA1 field of the gerbil hippocampus.J Neurochem,1994，63：2152～2164
[10]Qin Z.A review of therapeutic potential in ischemic stroke. Rev Neurol,1998,39(suppl 1):21～25
收稿日期：199-10-06, http://www.100md.com