大鼠中脑损伤后脑内BDNFmRNA的表达和定位
作者：张家瑾 翟晶 常鹏飞
单位：(北京市神经外科研究所)
关键词：BDNFmRNA；中脑损伤；原位杂交
首都医科大学学报000102 摘 要：立体定位注射微量(3 μL)神经毒素鹅膏蕈氨酸(ibotenic acid, IA)，造成大鼠中脑网状结构损伤。用地高辛标记的寡核苷酸探针进行原位杂交(in situ hybridization, ISH)，对脑源性神经营养因子(BDNF)mRNA在大鼠脑中的表达和定位进行了研究。结果发现，在海马组织有强标记的神经元，在周围的锥体层、粒状层及齿状回的脐部皆有标记信号发现。这些区域的其他神经元中发现有弱的标记信号或没有标记信号。BDNFmRNA高水平的表达在脑皮质星散的神经元、屏状核神经元和其他区域皆有发现。
分类号：R741.02
, http://www.100md.com
Expression and Localization of BDNFmRNA
to Neurons in the Brain Following
Midbrain Reticular Formation Injury
by in Situ Hybridization
Zhang Jiajin Zhai Jing Chang Pengfei
(Beijing Neurosurgical Institute)
Abstract：In order to observe the expression and localization of brain-derived neurotrophic factor(BDNF)mRNA in the rat brain following midbrain reticular formation(MRF) injury, MRF injury was produced by means of neurotoxin ibotenic acid(IA) injection into MRF. Synthetic oligonucleotide probed for BDNFmRNA was lebeled with digoxigenin(DIG). In situ hybridization was used to study expression and localization of BDNFmRNA in brain. In the hippocampal formation, strongly labeled neurons were found in and around the pyramidal layer, as well as in the granular layer and hilus of the dentate gyrus of the rats. Other neurons in these areas were more weakly labeled or unlabeled. High BDNFmRNA expression was also observed in scattered neurons in cortex cerebri, in many neurons in claustrum and in certain other areas. These results suggested that BDNF might act via a direct neuron-to-neuron interaction. The localization of BDNFmRNA expression in cortical areas and in claustrum suggested that the target neurons for this factor extended beyond the sensory ganglion and retinal ganglion cells. Finaily, BDNFmRNA expression in vivo in the central nervous system appeared to be mostly confined to neurons.
, 百拇医药
Key words：BDNFmRNA localization; midbrain injury; in situ hybridization▲
中脑损伤可以导致意识障碍及其他一系列病理生理变化，这些变化在一定程度上可自行恢复，但机制不详[1]。在前期研究中发现大鼠中脑网状结构损伤后30 min，大脑胼胝体、外囊、中脑被盖、大脑脚区脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)表达明显增强，可持续5 d以上。BDNF对神经元的生长、发育、功能维持和可塑性有重要的作用[2]。1997年1月至1998年1月，我们应用原位杂交法(in situ hybridization, ISH)，研究中脑损伤后神经元或神经节细胞是否为BDNF的主要来源及BDNFmRNA在脑中的表达和定位。
1 材料和方法
, 百拇医药 1.1 中脑损伤模型的制备
Wistar大鼠(首都医科大学实验动物中心提供)，雄性，体质量200～250 g。1%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔内注射麻醉。将头固定于立体定位仪上，正中切皮，暴露颅骨及矢状缝。根据大鼠脑立体定位图谱[3]，确定中脑网状结构损伤点坐标：A 3.2 mm，中线旁1.5 mm，耳间线背侧4 mm。颅骨钻孔后缓慢插入微量注射针头于靶点，缓慢注入神经毒素鹅膏蕈氨酸(ibotenic acid,IA)，两侧各3 μL。术后30 min用生理盐水(250 mL)，随后用4%多聚甲醛、0.1 mol/L PBS固定缓冲液(300 mL，pH 7.4)经升主动脉进行灌注。灌注后迅速取脑，置上述固定液中3～6 h，然后分离出脑的海马、皮质、小脑、中脑和屏状核等部分，置于含30%蔗糖、30%乙二醇的50 mmol/L PBS防冻液中(pH 7.4)，于-20 ℃贮存待用。
1.2 组织制备
, 百拇医药
将冷冻贮存的脑组织取出后用经焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate, DEPC)处理过的500 mL 0.1 mol/L PBS缓冲液充分漂洗过夜，然后行常规石蜡包埋，切成10 μm切片，载玻片经清洗、消毒和DEPC处理后涂以铬钒明胶用以捞片，然后置于52 ℃烘箱中过夜。
1.3 原位杂交
原位杂交过程中所用玻璃、塑料器皿、器械和溶液皆经DEPC和高压消毒处理。寡核苷酸探针互补于大鼠脑BDNFmRNA，相应于猪BDNF序列bp746～795[4]，由美国GIBCO/BRL公司提供。探针用德国宝利曼公司提供的地高辛寡核苷酸标记盒标记。
切片参照文献[5]方法预处理后加100 μL预杂交液(4×SSC，50%甲酰胺，0.02% ficoll，0.02%聚乙烯吡咯烷酮，0.02%牛血清白蛋白，100 mg/L鲑鱼精DNA，100 mg/L聚腺苷酸，250 mg/L酵母tRNA，10%葡聚糖硫酸盐)37 ℃温育1 h，然后用4×SSC漂洗3次，每次2 min，再浸入4×SSC， 50%甲酰胺中温育20 min。
, 百拇医药
预杂交后的切片加50 μL杂交液(4×SSC，50%甲酰胺，2%阻断剂，0.1%十二烷酰肌氨酸钠，0.02% SDS，10%葡聚糖硫酸盐和0.5 mg/L地高辛标记的寡核苷酸探针)，加盖玻片，在湿盒中42 ℃反应20 h。对照试验杂交液中不加探针或加未标记探针，或切片先经RNase处理后再杂交。
杂交后按文献[5]方法处理切片。用德国宝利曼公司提供的地高辛核苷酸检测药盒进行检测。
2 结果
冠状切片杂交结果表明，强的标记信号主要在海马、皮质、大脑脚、大脑胼胝体、外囊和中脑被盖。
海马区：海马组织的许多锥体细胞和粒状细胞有中等标记信号，锥体细胞周围许多星散细胞，齿状回的脐部有强的标记信号(图1、2)。
, 百拇医药
图1 大鼠海马组织切片原位杂交
大鼠海马组织切片用特异性BDNFmRNA寡核苷酸探针杂交，在CA3和齿状回部位有强的杂交信号显现 ×200
图2 大鼠海马组织切片原位杂交
大鼠海马组织切片用BDNFmRNA寡核苷酸探针杂交，海马锥体层出现从强标记、中等标记到无标记杂交信号神经细胞 ×200
大脑皮质：大脑皮质区内、外侧锥体层锥体细胞亚群有强的标记信号(图3)。
图3 图3(A)大鼠脑冠状切片原位杂交
, 百拇医药
示在脑颞皮质外锥体层，有强的标记信号存在，而脑皮质大部分神经仅有弱的或无标记信号 ×200
图3(B)大鼠屏状核切片原位杂交
示屏状核有强的杂交信号，在胶质神经细胞周围无杂交信号 ×200
屏状核：屏状核中等和大神经元占优的区域，从背外侧到外囊侧面，发现有强的标记信号(图3、4)。
图4 大鼠屏状核切片原位杂交
示大鼠屏状核区域，有许多强的杂交信号出现 ×200
小脑：在小脑的粒状层发现有标记信号，但信号密度低于脑其他区域(图5)。
, 百拇医药
图5 大鼠小脑切片原位杂交
示大鼠整个小脑粒状层皆有杂交信号显现，但强度较低，而脑的其他区域，粒状层杂交信号不明显 ×200
其他区域：在上丘发现有星散的强标记信号，这个区域大多数神经元仅有弱的或没有标记信号。尾状核、豆状核和苍白球只有很少的标记信号出现。白质中神经胶质细胞和囊内侧未发现有标记信号。
3 讨论
脑损伤后内源性脑损害因子和脑保护因子表达迅速明显增加，它们和脑继发性损伤及损伤修复密切相关，在脑损伤的组织代谢中发挥重要作用[6]。BDNF属于调节神经营养的脑保护因子。以前的研究发现中脑损伤后30 min，大脑胼胝体、外囊、中脑被盖、大脑脚区等神经纤维丰富的区域BDNF表达明显增强。本研究用分子原位杂交技术检测到在中脑损伤后，海马、皮质、小脑、上丘以及远离中脑的屏状核皆发现有BDNFmRNA的强标记信号，其中以海马表达水平最高。这表明BDNF确为脑神经元产生，在中脑损伤后通过机体自身某种应激调节机制，大脑有关区域大量表达编码神经元蛋白BDNF，以修复损伤或对抗脑损害因子。
, http://www.100md.com
在屏状核神经元发现有BDNFmRNA表达，表明这个区域接收来自BDNF依赖性神经元影响。屏状核与许多感觉和副感觉皮质有很多联系，因此，BDNFmRNA在屏状核的表达可能与它在感觉输入过程中的作用有关。
神经元的损伤促使BDNFmRNA在脑中的表达，远离损伤部位BDNFmRNA表达的增加可能是产生同步神经元放电传播所致。感觉皮质BDNFmRNA的表达可能由外周刺激调节。
意识障碍的发生机制是网状结构上下轴突纤维联系的阻断，而非中脑中“觉醒中枢”的受损。BDNFmRNA的表达有利于神经元的发育和存活，有利于突触活性[7]，因此推测中脑损伤后BDNFmRNA大量表达有利于意识障碍的恢复。■
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39600151)
参考文献：
, http://www.100md.com
[1]Denoyer M, Sallanon M, Buola C, et al. Neurotoxic lesion of the mesencephalic reticular formation and/or the posterior hypothalamus does not alter waking in the cat. Brain Res, 1991,539：278
[2]Barde Y A. Trophyic factors and neuronal survival. Neuron, 1989,2:1525
[3]包新民,舒斯云.大鼠脑立体定位图谱.北京:人民卫生出版社,1991
[4]Leibrock J, Lottspeich F, Hohn A, et al. Molecular cloning and expression of brain-derived neurotrophic factor. Nature, 1989,341:149
[5]路建平.非放射性杂交技术.海口:南海出版社,1996
[6]Yakovlev A G, Faden A I. Molecular strategies in CNS injury. J Neurotrauma, 1995,12(5):767
[7]Barde Y A, Edgar D, Thoenon H. Purification of a new neurotrophic factor from mammalian brain. EMBO J, 1982,1:549
收稿日期：1999-01-25, 百拇医药
单位：(北京市神经外科研究所)
关键词：BDNFmRNA；中脑损伤；原位杂交
首都医科大学学报000102 摘 要：立体定位注射微量(3 μL)神经毒素鹅膏蕈氨酸(ibotenic acid, IA)，造成大鼠中脑网状结构损伤。用地高辛标记的寡核苷酸探针进行原位杂交(in situ hybridization, ISH)，对脑源性神经营养因子(BDNF)mRNA在大鼠脑中的表达和定位进行了研究。结果发现，在海马组织有强标记的神经元，在周围的锥体层、粒状层及齿状回的脐部皆有标记信号发现。这些区域的其他神经元中发现有弱的标记信号或没有标记信号。BDNFmRNA高水平的表达在脑皮质星散的神经元、屏状核神经元和其他区域皆有发现。
分类号：R741.02
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Expression and Localization of BDNFmRNA
to Neurons in the Brain Following
Midbrain Reticular Formation Injury
by in Situ Hybridization
Zhang Jiajin Zhai Jing Chang Pengfei
(Beijing Neurosurgical Institute)
Abstract：In order to observe the expression and localization of brain-derived neurotrophic factor(BDNF)mRNA in the rat brain following midbrain reticular formation(MRF) injury, MRF injury was produced by means of neurotoxin ibotenic acid(IA) injection into MRF. Synthetic oligonucleotide probed for BDNFmRNA was lebeled with digoxigenin(DIG). In situ hybridization was used to study expression and localization of BDNFmRNA in brain. In the hippocampal formation, strongly labeled neurons were found in and around the pyramidal layer, as well as in the granular layer and hilus of the dentate gyrus of the rats. Other neurons in these areas were more weakly labeled or unlabeled. High BDNFmRNA expression was also observed in scattered neurons in cortex cerebri, in many neurons in claustrum and in certain other areas. These results suggested that BDNF might act via a direct neuron-to-neuron interaction. The localization of BDNFmRNA expression in cortical areas and in claustrum suggested that the target neurons for this factor extended beyond the sensory ganglion and retinal ganglion cells. Finaily, BDNFmRNA expression in vivo in the central nervous system appeared to be mostly confined to neurons.
, 百拇医药
Key words：BDNFmRNA localization; midbrain injury; in situ hybridization▲
中脑损伤可以导致意识障碍及其他一系列病理生理变化，这些变化在一定程度上可自行恢复，但机制不详[1]。在前期研究中发现大鼠中脑网状结构损伤后30 min，大脑胼胝体、外囊、中脑被盖、大脑脚区脑源性神经营养因子(brain-derived neurotrophic factor, BDNF)表达明显增强，可持续5 d以上。BDNF对神经元的生长、发育、功能维持和可塑性有重要的作用[2]。1997年1月至1998年1月，我们应用原位杂交法(in situ hybridization, ISH)，研究中脑损伤后神经元或神经节细胞是否为BDNF的主要来源及BDNFmRNA在脑中的表达和定位。
1 材料和方法
, 百拇医药 1.1 中脑损伤模型的制备
Wistar大鼠(首都医科大学实验动物中心提供)，雄性，体质量200～250 g。1%戊巴比妥钠(30 mg/kg)腹腔内注射麻醉。将头固定于立体定位仪上，正中切皮，暴露颅骨及矢状缝。根据大鼠脑立体定位图谱[3]，确定中脑网状结构损伤点坐标：A 3.2 mm，中线旁1.5 mm，耳间线背侧4 mm。颅骨钻孔后缓慢插入微量注射针头于靶点，缓慢注入神经毒素鹅膏蕈氨酸(ibotenic acid,IA)，两侧各3 μL。术后30 min用生理盐水(250 mL)，随后用4%多聚甲醛、0.1 mol/L PBS固定缓冲液(300 mL，pH 7.4)经升主动脉进行灌注。灌注后迅速取脑，置上述固定液中3～6 h，然后分离出脑的海马、皮质、小脑、中脑和屏状核等部分，置于含30%蔗糖、30%乙二醇的50 mmol/L PBS防冻液中(pH 7.4)，于-20 ℃贮存待用。
1.2 组织制备
, 百拇医药
将冷冻贮存的脑组织取出后用经焦碳酸二乙酯(diethyl pyrocarbonate, DEPC)处理过的500 mL 0.1 mol/L PBS缓冲液充分漂洗过夜，然后行常规石蜡包埋，切成10 μm切片，载玻片经清洗、消毒和DEPC处理后涂以铬钒明胶用以捞片，然后置于52 ℃烘箱中过夜。
1.3 原位杂交
原位杂交过程中所用玻璃、塑料器皿、器械和溶液皆经DEPC和高压消毒处理。寡核苷酸探针互补于大鼠脑BDNFmRNA，相应于猪BDNF序列bp746～795[4]，由美国GIBCO/BRL公司提供。探针用德国宝利曼公司提供的地高辛寡核苷酸标记盒标记。
切片参照文献[5]方法预处理后加100 μL预杂交液(4×SSC，50%甲酰胺，0.02% ficoll，0.02%聚乙烯吡咯烷酮，0.02%牛血清白蛋白，100 mg/L鲑鱼精DNA，100 mg/L聚腺苷酸，250 mg/L酵母tRNA，10%葡聚糖硫酸盐)37 ℃温育1 h，然后用4×SSC漂洗3次，每次2 min，再浸入4×SSC， 50%甲酰胺中温育20 min。
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预杂交后的切片加50 μL杂交液(4×SSC，50%甲酰胺，2%阻断剂，0.1%十二烷酰肌氨酸钠，0.02% SDS，10%葡聚糖硫酸盐和0.5 mg/L地高辛标记的寡核苷酸探针)，加盖玻片，在湿盒中42 ℃反应20 h。对照试验杂交液中不加探针或加未标记探针，或切片先经RNase处理后再杂交。
杂交后按文献[5]方法处理切片。用德国宝利曼公司提供的地高辛核苷酸检测药盒进行检测。
2 结果
冠状切片杂交结果表明，强的标记信号主要在海马、皮质、大脑脚、大脑胼胝体、外囊和中脑被盖。
海马区：海马组织的许多锥体细胞和粒状细胞有中等标记信号，锥体细胞周围许多星散细胞，齿状回的脐部有强的标记信号(图1、2)。
, 百拇医药
图1 大鼠海马组织切片原位杂交
大鼠海马组织切片用特异性BDNFmRNA寡核苷酸探针杂交，在CA3和齿状回部位有强的杂交信号显现 ×200
图2 大鼠海马组织切片原位杂交
大鼠海马组织切片用BDNFmRNA寡核苷酸探针杂交，海马锥体层出现从强标记、中等标记到无标记杂交信号神经细胞 ×200
大脑皮质：大脑皮质区内、外侧锥体层锥体细胞亚群有强的标记信号(图3)。
图3 图3(A)大鼠脑冠状切片原位杂交
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示在脑颞皮质外锥体层，有强的标记信号存在，而脑皮质大部分神经仅有弱的或无标记信号 ×200
图3(B)大鼠屏状核切片原位杂交
示屏状核有强的杂交信号，在胶质神经细胞周围无杂交信号 ×200
屏状核：屏状核中等和大神经元占优的区域，从背外侧到外囊侧面，发现有强的标记信号(图3、4)。
图4 大鼠屏状核切片原位杂交
示大鼠屏状核区域，有许多强的杂交信号出现 ×200
小脑：在小脑的粒状层发现有标记信号，但信号密度低于脑其他区域(图5)。
, 百拇医药
图5 大鼠小脑切片原位杂交
示大鼠整个小脑粒状层皆有杂交信号显现，但强度较低，而脑的其他区域，粒状层杂交信号不明显 ×200
其他区域：在上丘发现有星散的强标记信号，这个区域大多数神经元仅有弱的或没有标记信号。尾状核、豆状核和苍白球只有很少的标记信号出现。白质中神经胶质细胞和囊内侧未发现有标记信号。
3 讨论
脑损伤后内源性脑损害因子和脑保护因子表达迅速明显增加，它们和脑继发性损伤及损伤修复密切相关，在脑损伤的组织代谢中发挥重要作用[6]。BDNF属于调节神经营养的脑保护因子。以前的研究发现中脑损伤后30 min，大脑胼胝体、外囊、中脑被盖、大脑脚区等神经纤维丰富的区域BDNF表达明显增强。本研究用分子原位杂交技术检测到在中脑损伤后，海马、皮质、小脑、上丘以及远离中脑的屏状核皆发现有BDNFmRNA的强标记信号，其中以海马表达水平最高。这表明BDNF确为脑神经元产生，在中脑损伤后通过机体自身某种应激调节机制，大脑有关区域大量表达编码神经元蛋白BDNF，以修复损伤或对抗脑损害因子。
, http://www.100md.com
在屏状核神经元发现有BDNFmRNA表达，表明这个区域接收来自BDNF依赖性神经元影响。屏状核与许多感觉和副感觉皮质有很多联系，因此，BDNFmRNA在屏状核的表达可能与它在感觉输入过程中的作用有关。
神经元的损伤促使BDNFmRNA在脑中的表达，远离损伤部位BDNFmRNA表达的增加可能是产生同步神经元放电传播所致。感觉皮质BDNFmRNA的表达可能由外周刺激调节。
意识障碍的发生机制是网状结构上下轴突纤维联系的阻断，而非中脑中“觉醒中枢”的受损。BDNFmRNA的表达有利于神经元的发育和存活，有利于突触活性[7]，因此推测中脑损伤后BDNFmRNA大量表达有利于意识障碍的恢复。■
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39600151)
参考文献：
, http://www.100md.com
[1]Denoyer M, Sallanon M, Buola C, et al. Neurotoxic lesion of the mesencephalic reticular formation and/or the posterior hypothalamus does not alter waking in the cat. Brain Res, 1991,539：278
[2]Barde Y A. Trophyic factors and neuronal survival. Neuron, 1989,2:1525
[3]包新民,舒斯云.大鼠脑立体定位图谱.北京:人民卫生出版社,1991
[4]Leibrock J, Lottspeich F, Hohn A, et al. Molecular cloning and expression of brain-derived neurotrophic factor. Nature, 1989,341:149
[5]路建平.非放射性杂交技术.海口:南海出版社,1996
[6]Yakovlev A G, Faden A I. Molecular strategies in CNS injury. J Neurotrauma, 1995,12(5):767
[7]Barde Y A, Edgar D, Thoenon H. Purification of a new neurotrophic factor from mammalian brain. EMBO J, 1982,1:549
收稿日期：1999-01-25, 百拇医药