ICE重组质粒转染血管平滑肌细胞及其促凋亡作用的观察
作者：何奔 徐迎佳 王彬尧 朱顺和 郑道声
单位：上海第二医科大学附属仁济医院心内科 200001
关键词：白介素-1β-转换酶；血管平滑肌细胞；凋亡
高血压杂志000122 摘 要：目的：观察转染白介素-1β-转换酶(ICE)基因对血管平滑肌细胞的促凋亡作用。方法：通过阳离子脂质体介导的方法将重组质粒及报告质粒PSV-β-gal共 转染体外培养的血管平滑肌细胞,运用生化染色、电镜观察、流式细胞仪及DNA凝胶电泳等检测方法了解细胞转染后的凋亡发生情况。结果：ICE转染阳性的细胞具有凋亡的典型形态学变化，且试验组的凋亡百分率较正常对照组及空白质粒对照组显著升高。结论：ICE基因可诱导体外培养的平滑肌细胞发生凋亡。
分类号：Q78;R543;Q493.9 文献标识码：A
, http://www.100md.com
文章编号：1006-2866(2000)01-0064-03
Induction of Apoptosis in Vascular Smooth Muscle Cell after
Transfected Recombinant Plasmid PCI-ICE
HE Ben XU Yingjia WANG Binyao ZHU Shunhe ZHENG Daosheng
(Department of Cardiology, Renji Hospital affiliated to Shanghai Second Medical University.200001,Shanghai)
ABSTRACT：Objective: To investigate the effec ts of apoptosis-induced gene-interlukin-1β-converting enzyme(ICE) on cultured vascular smooth muscle cells(SMCs).
, http://www.100md.com
Methods:Using the cationic liposome mediation method, recombinant plasmid PCI-ICE was transfected into cultured vascular SMCs. Apoptosis was detected by biochemical staining, transmission elec tron microscopy, flow cytometry and gel electrophoretic analysis of DNA.
Result:Gene transfected vascular SMCs displayed morphologic changes consistent with those of apoptosis. The incidence of apoptosis in gene transfected group was significantly higher than that of con trol group.
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Conclusion:ICE gene could effectively induce apoptosis in cultured vascular SMCs.
key words：interlukin-1β-converting enzyme(ICE), vascular smooth m uscle cells, apoptosis▲
近年的研究表明，细胞凋亡(apoptosis)参与机体许多病理生理调 节过程。在心血管疾病病理过程中，已经发现在终末期衰竭心脏和致心律失常性右室发育不良具有细胞凋亡过度现象[1]，在动脉粥样硬化组织和血管成形术后再狭窄组织具有细胞凋亡不足 现象[2]。最近，Bauriedel等比较了稳定性心绞痛和PTCA术后再狭窄动脉内膜定向旋切标本，发现再狭窄组织较之粥样硬化组织细胞凋亡水平明显为低[3]。有些学者提出假设：既然 再狭窄机制可能具有凋亡不足参与，诱导凋亡可能有助于抑制增生，但未见进一步的研究报道。Yonemitsu等最近报道了野生形P53基因转染后可有效抑制体内外平滑肌细胞的增生[4 ]，初步证实了上述假说，为再狭窄的转基因治疗开辟了新的思路。细胞凋亡是一个主动的生理过程，受到许多基因及其表达产物的有序的调控[5]，现有的研究表明，虽然多达 几十种基因参与凋亡的过程，但白介素-1β-转换酶(ICE)在哺乳类动物细胞凋亡中起关键作用，是凋亡信号传递的共同途径[6]。本研究在成功克隆ICE并构建PCI-ICE重组质粒的 基础上[7]，观察PCI-ICE转染后的平滑肌细胞的促凋亡效应，旨在为今后在体试 验打基础。
, 百拇医药
MATERIALS AND METHODS
1 细胞和载体：PCI质粒、PSV-β-gal报告质粒购自Promega公司，PCI-ICE重组质粒、血管平滑肌细胞本室制备。
2 试剂：SuperFect Transfection Reagent(QIAGRN),RPMI-1640(Gibco)、Agarose(Prome ga)。
3 传代细胞培养：血管平滑肌细胞置37℃，5%CO2条件下进行传代培养。
4 DNA转染血管平滑肌细胞：转染前24小时将细胞分至六孔板，细胞数2×105，第1、4孔为正常对照，2、5孔为空白质粒对照加PSV-β-gal和PCI混合液，第3、6孔为加PSV-β-gal及PCI-ICE的DNA液，37℃，5%CO2孵育24～48小时。
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5 染色鉴定：用1%戊二醛固定细胞，倒置显微镜观察。
6 电镜观察：用2%戊二醛固定细胞，琼脂糖凝胶包埋，锇酸染色，制成超薄切片，透射电镜观察。
7 DNA抽提及电泳：转染后细胞经裂解、蛋白酶K消化，酚-氯仿-异戊醇(25∶24 ∶1)抽体，置1%琼脂糖凝胶板电泳。
8 流式细胞仪检测：采用单荧光染色法，取转染后细胞约2×106用胰酶消化，经70%冰乙醇固定，碘化丙啶(PI)染色，上机检测。
9 统计学处理： 数据以均数±标准差表示，采用两样本均数比较的t检验，P<0.0 5差异有显著性，P<0.01差异有高度显著性。
RESULTS
1 细胞染色：将报告基因PSV-β-gal与目的基因共转染平滑肌细胞，转染阳性细胞可表 达β-gal呈兰色。正常对照细胞无蓝染，空白质粒对照组的蓝染细胞形态同正常平滑肌细 胞。实验组的蓝染细胞圆缩，染色质浓集，发生凋亡。(图1,2)
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图 1 将报告基因PSV-β-gal与目的基因共转染平滑肌细胞，转染阳性细胞可表达β-gal呈兰色。正常对照细胞无蓝染，空白质粒对照组的蓝染细胞形态同正 常平滑肌细胞。
图 2 实验组的蓝染细胞圆缩，染色质浓集，发生凋亡。
2 电镜观察：正常平滑肌细胞呈长梭形，染色质布均，核仁清晰。实验 细胞外形皱缩，核仁固缩，胞浆浓集，胞膜泡状突起。(图 3,4)。(注：图1～图4见彩色 插图)
图 3 电镜观察，正常平滑肌细胞呈长梭形，染色质布均，核仁清晰。
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图 4 电镜观察，实验细胞外形皱缩，核仁固缩，胞浆浓集，胞膜泡状突起。
3 DNA电泳定性检测：(图 5)。
图 5(1,2)正常血管平滑肌细胞及空白质粒对照细胞总DNA电泳表现为
大分子基因组型DNA带形。(3)而实验组总DNA电泳示DNA断裂、降解。
4 实验组与正常对照及空白质粒对照相比，凋亡百分率升高，差异有 显著性,表 1。
表 1 各组细胞凋亡测定结果比较(
±s) 凋亡(%)
, 百拇医药 n
正常对照组(n=6)
1.1±0.31
PSV+PCI组(n=6)
2.1±0.54
PSV+PCI-ICE组(n=6)
11.4±1.2*#
*:P<0.01 vs control; #:P<0.01与PSV+PCI组比较
5 流式细胞仪分析：凋亡细胞位于正常二倍体细胞之前， 有一亚二倍体峰，称Ap峰(根据Ap峰的高低可以推测发生凋亡的细胞数)。ICE基因转染24小 时后的平滑肌细胞可检测到明显的Ap峰，而正常对照、空白质粒对照则无该峰形成(图 6,7) 。
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图 6 空质粒对照组流式细胞仪分析
图 7 实验组流式细胞仪显示的AP峰
DISCUSSION
血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖在许多心血管疾病病理生理过程中扮演重要角色，在血管成形术后再狭窄,动脉粥样硬化组织，高血压的血管重构等均可见到VSMCs的异常增殖；细胞的增值和凋亡是一对矛盾的两个方面，通过转基因而诱导凋亡已成为近年治疗平滑肌细胞增殖性疾病的新的方向。
基因转移及导入细胞的过程中载体的选择是关键。现有载体中有病毒和非病毒两大类，非病毒载体包括质粒，噬菌体和酵母人工染色体等。质粒载体基因转移效率虽不如病毒载体，但与之相比，其可携带的靶基因长度长，不具感染性，免疫源性低，安全且构建容易。不同的真核表达载体有不同的基因表达效率，其中启动子是最关键的因素，一般认为SV和CMV启动子效果好。本研究以哺乳动物表达载体PCI为运载体，构建了受控于CMV启动子的ICE cDNA表达载体，同时利用阳离子脂质体介导的转染技术，将重组ICE表达载体转染入平滑肌细胞。阳离子脂质体具有操作简便，重复性好，转染效率较高[8]等优点。本实验中根据报告基因PSV-β-gal使细胞 蓝染证实转染效率在10%左右；与文献报告相似[8]。
, 百拇医药
本研究通过光镜，电镜形态学观察，DNA凝胶电泳，流式细胞仪检测分析转基因后的凋亡情况，发现转基因组具有典型的凋亡形态学变化：如细胞体积缩小，核固缩，边聚，胞浆浓缩等。DNA电泳结果提示，转基因组有DNA的断裂，降解。其未出现特征性阶梯状条带的原因可能与细胞尚处于凋亡早期，且转基因效率较低有关。流式细胞仪检测表明，转基因组 有明显的亚二倍体峰出现，凋亡百分率亦显著高于正常对照组及空白质粒对照组。我们在本实验中选择的是流式细胞仪单荧光染色法，与双激光双染色法，缺口平移末端标记法(TUNEL)比较，敏感性与特异性虽稍低，但由于此法成本低，操作简便，仍得到广泛的应用[9]。
本实验初步证实了转染ICE基因可有效诱导体外培养的平滑肌细胞发生凋亡，为进一步作载体转基因治疗研究打下基础。■
REFERENCES：
[1]Narula J, Haider N, Virmani R et al:Apoptosis in myocytes in end-stage heart failure[J] Engl J Med 1996;335:1182-1189
, 百拇医药
[2]Han DKM, Haudenschild CC, Hong MK et al: Evidence for apoptosis in human atherogenesis and in a rat vascular injury model[J] Am J Pathol 1995;147 :267-277
[3]Bauriedel G, Schluckebier S, Hutter R et al: Apoptosis in restenosis versus s table-angina atherosclerosis:Implications for the pathogenesis of restenosis[J] Arterios cler Thromb Vasc Biol 1998;18:1132-1139
[4]Yonemitsu Y, Kaneda Y, Tanaka S et al: Transfer of wild-type p53 gene effect ively inhibits vascular smooth muscle cell proliferation in vitro and in vivo[J] Circ Res 1998;82:147-156
, 百拇医药
[5]Stewart BW: Mechanisms of apoptosis: integration of genetic, biochemical and cellular indicators[J] J Natl Cancer Inst 1994;86(17):1286-1295
[6]Steller H: Mechanisms and genes of cellular suicide[J] Science 1995;2 67:1445-1449
[7]徐迎佳,何奔,沈南等:人白介素-1β-转换酶全长基因克隆及重组质粒构建[J] 基础医学与临床 1999;19(1):60-63
[8]Hofland HEJ, Shephard L, Sullivan SM: Formation of stable cationic lipid/DNA complexs for gene transfer[J] Proc Natl Acad Sci USA 1996;93(14):7305-7309
[9]Ormerod MG, Sun XM, Brown D et al: Quantification of apoptosis and necrosis b y flow cytometry[J] Acta Oncologica 1993;32(4):417-424
收稿日期：1999-07-14, 百拇医药
单位：上海第二医科大学附属仁济医院心内科 200001
关键词：白介素-1β-转换酶；血管平滑肌细胞；凋亡
高血压杂志000122 摘 要：目的：观察转染白介素-1β-转换酶(ICE)基因对血管平滑肌细胞的促凋亡作用。方法：通过阳离子脂质体介导的方法将重组质粒及报告质粒PSV-β-gal共 转染体外培养的血管平滑肌细胞,运用生化染色、电镜观察、流式细胞仪及DNA凝胶电泳等检测方法了解细胞转染后的凋亡发生情况。结果：ICE转染阳性的细胞具有凋亡的典型形态学变化，且试验组的凋亡百分率较正常对照组及空白质粒对照组显著升高。结论：ICE基因可诱导体外培养的平滑肌细胞发生凋亡。
分类号：Q78;R543;Q493.9 文献标识码：A
, http://www.100md.com
文章编号：1006-2866(2000)01-0064-03
Induction of Apoptosis in Vascular Smooth Muscle Cell after
Transfected Recombinant Plasmid PCI-ICE
HE Ben XU Yingjia WANG Binyao ZHU Shunhe ZHENG Daosheng
(Department of Cardiology, Renji Hospital affiliated to Shanghai Second Medical University.200001,Shanghai)
ABSTRACT：Objective: To investigate the effec ts of apoptosis-induced gene-interlukin-1β-converting enzyme(ICE) on cultured vascular smooth muscle cells(SMCs).
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Methods:Using the cationic liposome mediation method, recombinant plasmid PCI-ICE was transfected into cultured vascular SMCs. Apoptosis was detected by biochemical staining, transmission elec tron microscopy, flow cytometry and gel electrophoretic analysis of DNA.
Result:Gene transfected vascular SMCs displayed morphologic changes consistent with those of apoptosis. The incidence of apoptosis in gene transfected group was significantly higher than that of con trol group.
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Conclusion:ICE gene could effectively induce apoptosis in cultured vascular SMCs.
key words：interlukin-1β-converting enzyme(ICE), vascular smooth m uscle cells, apoptosis▲
近年的研究表明，细胞凋亡(apoptosis)参与机体许多病理生理调 节过程。在心血管疾病病理过程中，已经发现在终末期衰竭心脏和致心律失常性右室发育不良具有细胞凋亡过度现象[1]，在动脉粥样硬化组织和血管成形术后再狭窄组织具有细胞凋亡不足 现象[2]。最近，Bauriedel等比较了稳定性心绞痛和PTCA术后再狭窄动脉内膜定向旋切标本，发现再狭窄组织较之粥样硬化组织细胞凋亡水平明显为低[3]。有些学者提出假设：既然 再狭窄机制可能具有凋亡不足参与，诱导凋亡可能有助于抑制增生，但未见进一步的研究报道。Yonemitsu等最近报道了野生形P53基因转染后可有效抑制体内外平滑肌细胞的增生[4 ]，初步证实了上述假说，为再狭窄的转基因治疗开辟了新的思路。细胞凋亡是一个主动的生理过程，受到许多基因及其表达产物的有序的调控[5]，现有的研究表明，虽然多达 几十种基因参与凋亡的过程，但白介素-1β-转换酶(ICE)在哺乳类动物细胞凋亡中起关键作用，是凋亡信号传递的共同途径[6]。本研究在成功克隆ICE并构建PCI-ICE重组质粒的 基础上[7]，观察PCI-ICE转染后的平滑肌细胞的促凋亡效应，旨在为今后在体试 验打基础。
, 百拇医药
MATERIALS AND METHODS
1 细胞和载体：PCI质粒、PSV-β-gal报告质粒购自Promega公司，PCI-ICE重组质粒、血管平滑肌细胞本室制备。
2 试剂：SuperFect Transfection Reagent(QIAGRN),RPMI-1640(Gibco)、Agarose(Prome ga)。
3 传代细胞培养：血管平滑肌细胞置37℃，5%CO2条件下进行传代培养。
4 DNA转染血管平滑肌细胞：转染前24小时将细胞分至六孔板，细胞数2×105，第1、4孔为正常对照，2、5孔为空白质粒对照加PSV-β-gal和PCI混合液，第3、6孔为加PSV-β-gal及PCI-ICE的DNA液，37℃，5%CO2孵育24～48小时。
, http://www.100md.com
5 染色鉴定：用1%戊二醛固定细胞，倒置显微镜观察。
6 电镜观察：用2%戊二醛固定细胞，琼脂糖凝胶包埋，锇酸染色，制成超薄切片，透射电镜观察。
7 DNA抽提及电泳：转染后细胞经裂解、蛋白酶K消化，酚-氯仿-异戊醇(25∶24 ∶1)抽体，置1%琼脂糖凝胶板电泳。
8 流式细胞仪检测：采用单荧光染色法，取转染后细胞约2×106用胰酶消化，经70%冰乙醇固定，碘化丙啶(PI)染色，上机检测。
9 统计学处理： 数据以均数±标准差表示，采用两样本均数比较的t检验，P<0.0 5差异有显著性，P<0.01差异有高度显著性。
RESULTS
1 细胞染色：将报告基因PSV-β-gal与目的基因共转染平滑肌细胞，转染阳性细胞可表 达β-gal呈兰色。正常对照细胞无蓝染，空白质粒对照组的蓝染细胞形态同正常平滑肌细 胞。实验组的蓝染细胞圆缩，染色质浓集，发生凋亡。(图1,2)
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图 1 将报告基因PSV-β-gal与目的基因共转染平滑肌细胞，转染阳性细胞可表达β-gal呈兰色。正常对照细胞无蓝染，空白质粒对照组的蓝染细胞形态同正 常平滑肌细胞。
图 2 实验组的蓝染细胞圆缩，染色质浓集，发生凋亡。
2 电镜观察：正常平滑肌细胞呈长梭形，染色质布均，核仁清晰。实验 细胞外形皱缩，核仁固缩，胞浆浓集，胞膜泡状突起。(图 3,4)。(注：图1～图4见彩色 插图)
图 3 电镜观察，正常平滑肌细胞呈长梭形，染色质布均，核仁清晰。
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图 4 电镜观察，实验细胞外形皱缩，核仁固缩，胞浆浓集，胞膜泡状突起。
3 DNA电泳定性检测：(图 5)。
图 5(1,2)正常血管平滑肌细胞及空白质粒对照细胞总DNA电泳表现为
大分子基因组型DNA带形。(3)而实验组总DNA电泳示DNA断裂、降解。
4 实验组与正常对照及空白质粒对照相比，凋亡百分率升高，差异有 显著性,表 1。
表 1 各组细胞凋亡测定结果比较(
±s) 凋亡(%), 百拇医药 n
正常对照组(n=6)
1.1±0.31
PSV+PCI组(n=6)
2.1±0.54
PSV+PCI-ICE组(n=6)
11.4±1.2*#
*:P<0.01 vs control; #:P<0.01与PSV+PCI组比较
5 流式细胞仪分析：凋亡细胞位于正常二倍体细胞之前， 有一亚二倍体峰，称Ap峰(根据Ap峰的高低可以推测发生凋亡的细胞数)。ICE基因转染24小 时后的平滑肌细胞可检测到明显的Ap峰，而正常对照、空白质粒对照则无该峰形成(图 6,7) 。
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图 6 空质粒对照组流式细胞仪分析
图 7 实验组流式细胞仪显示的AP峰
DISCUSSION
血管平滑肌细胞(VSMCs)增殖在许多心血管疾病病理生理过程中扮演重要角色，在血管成形术后再狭窄,动脉粥样硬化组织，高血压的血管重构等均可见到VSMCs的异常增殖；细胞的增值和凋亡是一对矛盾的两个方面，通过转基因而诱导凋亡已成为近年治疗平滑肌细胞增殖性疾病的新的方向。
基因转移及导入细胞的过程中载体的选择是关键。现有载体中有病毒和非病毒两大类，非病毒载体包括质粒，噬菌体和酵母人工染色体等。质粒载体基因转移效率虽不如病毒载体，但与之相比，其可携带的靶基因长度长，不具感染性，免疫源性低，安全且构建容易。不同的真核表达载体有不同的基因表达效率，其中启动子是最关键的因素，一般认为SV和CMV启动子效果好。本研究以哺乳动物表达载体PCI为运载体，构建了受控于CMV启动子的ICE cDNA表达载体，同时利用阳离子脂质体介导的转染技术，将重组ICE表达载体转染入平滑肌细胞。阳离子脂质体具有操作简便，重复性好，转染效率较高[8]等优点。本实验中根据报告基因PSV-β-gal使细胞 蓝染证实转染效率在10%左右；与文献报告相似[8]。
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本研究通过光镜，电镜形态学观察，DNA凝胶电泳，流式细胞仪检测分析转基因后的凋亡情况，发现转基因组具有典型的凋亡形态学变化：如细胞体积缩小，核固缩，边聚，胞浆浓缩等。DNA电泳结果提示，转基因组有DNA的断裂，降解。其未出现特征性阶梯状条带的原因可能与细胞尚处于凋亡早期，且转基因效率较低有关。流式细胞仪检测表明，转基因组 有明显的亚二倍体峰出现，凋亡百分率亦显著高于正常对照组及空白质粒对照组。我们在本实验中选择的是流式细胞仪单荧光染色法，与双激光双染色法，缺口平移末端标记法(TUNEL)比较，敏感性与特异性虽稍低，但由于此法成本低，操作简便，仍得到广泛的应用[9]。
本实验初步证实了转染ICE基因可有效诱导体外培养的平滑肌细胞发生凋亡，为进一步作载体转基因治疗研究打下基础。■
REFERENCES：
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[3]Bauriedel G, Schluckebier S, Hutter R et al: Apoptosis in restenosis versus s table-angina atherosclerosis:Implications for the pathogenesis of restenosis[J] Arterios cler Thromb Vasc Biol 1998;18:1132-1139
[4]Yonemitsu Y, Kaneda Y, Tanaka S et al: Transfer of wild-type p53 gene effect ively inhibits vascular smooth muscle cell proliferation in vitro and in vivo[J] Circ Res 1998;82:147-156
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[6]Steller H: Mechanisms and genes of cellular suicide[J] Science 1995;2 67:1445-1449
[7]徐迎佳,何奔,沈南等:人白介素-1β-转换酶全长基因克隆及重组质粒构建[J] 基础医学与临床 1999;19(1):60-63
[8]Hofland HEJ, Shephard L, Sullivan SM: Formation of stable cationic lipid/DNA complexs for gene transfer[J] Proc Natl Acad Sci USA 1996;93(14):7305-7309
[9]Ormerod MG, Sun XM, Brown D et al: Quantification of apoptosis and necrosis b y flow cytometry[J] Acta Oncologica 1993;32(4):417-424
收稿日期：1999-07-14, 百拇医药