TGF-β1对肾间质成纤维细胞Ⅲ型胶原表达的影响
作者：王伟铭 姚建 石蓉 董德长
单位：王伟铭(上海第二医科大学附属瑞金医院肾脏科，上海200025)；姚建(上海第二医科大学附属瑞金医院肾脏科，上海200025)；石蓉(上海第二医科大学附属瑞金医院肾脏科，上海200025)；董德长(上海第二医科大学附属瑞金医院肾脏科，上海200025)
关键词：TGF-β1；肾间质成纤维细胞；Ⅲ型胶原；细胞增殖
细胞与分子免疫学杂志000109
摘要:目的通过观察TGF-β1对肾间质成纤维细胞的增殖及Ⅲ型胶原mRNA表达的影响，探讨肾间质成纤维细胞在肾纤维化过程中的作用。方法应用大鼠肾间质成纤维细胞体外培养，以MTT比色法和RT-PCR法，观察TGF-β1对肾间质成纤维细胞的增殖作用和对Ⅲ型胶原mRNA表达的影响。结果TGF-β1可促进肾间质成纤维细胞的增殖，且与TGF-β1的质量浓度呈正相关；TGF-β1可刺激肾间质成纤细胞Ⅲ型胶原mRNA的表达，并呈剂量和时间依赖效应。结论TGF-β1与肾间质成纤维细胞的相互作用，在肾间质纤维化中可能起重要的作用。
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中图号：R392.12 文献标识码：A
文章编号:1007-8738(2000)01-0029-31
Effects of TGF-β1 on cellular proliferation and expression of type Ⅲ collagen by cultured rat renal interstitial fibroblasts
WANG Wei-ming,YAO Jian,SHI Rong,DONG De-chang
Department of Nephrology,Ruijin Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025, China
Abstract:Aim To investigate the effects of TGF-β1 on proliferation and type Ⅲ collagen mRNA expression of rat renal interstitial fibroblasts in vitro for elucidating the role of fibroblasts and TGF-β1 in renal interstitial fibrosis. Methods The cells were cultured in media containing various contents of TGF-β1. The Proliferation and expression of type Ⅲ collagen mRNA of the cells were assayed with MTT method and RT-PCR, respectively. Results TGF-β1 had a stimulating effect on proliferation with dose-dependence(TGF-β1 0～20 μ g/L),and induced an increasing expression of type Ⅲ collagen mRNA with dose-de-pendence(TGF-β1 0～ 10 μ g/L)and time-dependence(0～48 hours)to the renal fibroblasts. Conclusion TGF-β1 is involved in proliferation of renal interstitial fibroblasts with their type Ⅲ collagen mRNA expression, and might play an important role in renal interstitial fibrosis.
, 百拇医药
Keywords: TGF-β1; typeⅢ collagen; renal interstitial fibroblast; cellular proliferation
原发性肾病、肾血管病变和慢性间质性肾炎的病变发展到慢性肾功能衰竭的发病机制，至今尚未完全阐明〔1〕。近年研究显示，肾间质病变与肾衰发展的关系更为密切。肾间质纤维化是各种慢性肾脏疾病发展至终末期肾衰的共同病理表现。其组织学特征是，成纤维细胞的大量增多及主要由其分泌的细胞外基质的大量堆积〔2〕。我们通过观察TGF-β1对肾间质成纤维细胞的增殖及Ⅲ型胶原mRNA表达的影响，以探讨肾间质成纤维细胞在肾间质纤维化过程中的作用。
1 材料和方法
1.1 肾间质成纤维细胞的培养和增殖的测定 大鼠肾间质细胞采用Lonnemann等〔3〕提出的方法从正常Waster大鼠肾髓质中培养获得，具体步骤：将髓质肾组织切成1 mm3的小块，用0.5 g/L胶原酶消化20 min，1000 r/min离心5 min，去上清液，加RPMI 1640培养液洗两遍，分别通过不同孔径的筛网(80～200目)。收集200目以下的细胞悬液，用RPMI 1640培养液洗涤后，种入培养瓶中，加入含100 mL/L小牛血清的RPMI 1640培养液，置37℃，50 mL/L CO2培养箱中培养。生长出的细胞，根据形态学和免疫学表型确定为成纤维细胞。细胞增殖应用MTT比色法测定〔4〕。将肾间质成纤维细胞接种于96孔板(1×104/孔)。加无血清培养液37℃孵育24 h，使细胞生长同步进入休止期。弃上清液，加入含100 mL/L小牛血清的培养液刺激24 h。于刺激作用结束前4 h，加入MTT(5 g/L)(20 μL/孔)，经溶解后于酶标仪波长595 nm处读取A值。
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1.2 RT-PCR法检测Ⅲ型胶原mRNA的表达 经不同浓度(0～10 μg/L)的TGF-β1刺激和经TGF-β1不同时间(0～48 h)刺激的细胞总RNA的提取，依照Trizol试剂盒的方法进行。取20～30 μg细胞总RNA，经12 g/L琼脂糖-3 mol/L甲醛凝胶电泳分离，溴乙锭染色照相。取总RNA 2 μg做逆转录，所获产物各取5 μL进行Ⅲ型胶原与3′-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)的PCR扩增。各取PCR产物10 μL，经16 g/L琼脂糖凝胶电泳后，于反射紫外灯下观察并照相。引物根据文献〔5，6〕报道，由中国科学院细胞所合成，序列如下：
Ⅲ型胶原：
3′-AGAAAGTGGAGACAATGGAGC-5′;
5′-AACCCAGTATTCTCCACTCTT-3′.
, 百拇医药
Product size:349 bp
3′-磷酸甘油醛脱氢酶:
3′-TTACATAGGCAACACCTAGA-5′;
5′-TCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3′.
Product size:309 bp
统计学处理:两组比较采用配对t检验，显著性标准为P<0.05。TGF-β1的质量浓度与细胞增殖采用相关性检验。
2 结 果
2.1 TGF-β1对肾间质成纤维细胞增殖的作用
TGF-β1可促进肾间质成纤维细胞的增殖，且呈现一定的浓度正相关(r=0.9519, P<0.05)，即随着 TGF-β1质量浓度的增加， 细胞的增殖程度逐渐增强(图1)。
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图1 不同质量浓度TGF-β1对肾间质成纤维细胞增殖的影响
Fig 1 Effect of TGF-β1 with different contents on proliferation
of renal interstitial fibroblasts
2.2 TGF-β1对Ⅲ型胶原mRNA表达的影响
TGF-β1可促进肾间质成纤维细胞Ⅲ型胶原mRNA的表达，且与TGF-β1的浓度和刺激时间呈一定的正相关(图2，3)。
图2 不同质量浓度的TGF-β1对肾间质成纤维细胞Ⅲ型胶
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原mRNA表达的影响
Fig 2 Effect of TGF-β1 with different contents on mRNA expr
ession of type Ⅲ collagen by renal interstitial fibroblasts
M:pGEM-7Zf(+)/Hae Ⅲ DNA marker
图3 TGF-β1作用时间对肾间质成纤维细胞Ⅲ型胶原mR
NA表达的影响
Fig 3 Time effect of TGF-β1 on the mRNA expression of
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type Ⅲ collagen by renal interstitial fibroblasts
M: pGEM-7Zf(+)/Hae Ⅲ DNA marker
3 讨 论
多种细胞因子，如IL-α，IL-β，PDGF，TGF-α，TGF-β和TNF-α均具有致纤维化产生的作用(尤其是TGF-β)，且参与肾间质纤维化的各个细节〔7〕。活化的TGF-β可促进基质合成增多、抑制基质降解、整合素基质粘附分子的上调，以及趋化成纤维细胞和单核细胞。TGF-β是一类具有激素样活性的多肽，广泛存在于许多不同类型的正常细胞和转化细胞。其生物学功能是多方面的，对上皮细胞、结缔组织的正常细胞或恶性细胞，均具有极广泛的调节作用。在不同条件下，可刺激细胞的增殖、分化与生长〔7，8〕。而且在多种肾脏病变模型中，已发现TGF-β1的表达增加。本结果显示，TGF-β1可促进肾间质成纤维细胞的增殖，且随剂量的增加，促增殖效应进一步增强，与其对其它组织中成纤维细胞增殖的影响相似〔9，10〕。
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TGF-β1表达的增加与基质的积聚有关，其机制可能与TGF-β1可增加基质的产生和抑制基质的降解有关。本研究结果显示，TGF-β1可促进Ⅲ型胶原mRNA的表达，且在其浓度为2～10 μg/L之间与质量浓度呈正相关；在6～48 h内与时间呈正相关，同国外的报道相似〔11〕。
近年研究已显示，在肾间质纤维化过程中，存在细胞外基质代谢的异常，包括细胞外基质合成的增加和降解的减少。其原因可能是由于间质成纤维细胞受炎症或细胞因子(如TGF-β1)刺激后细胞的特性改变，增殖合成能力增强，而致细胞外基质合成增多所致。本结果也具有相似的结论。另外，有研究提示，可能是由于间质细胞产生的基质蛋白降解酶减少，或产生的基质蛋白降解酶抑制物增多等的综合作用所致。综上所述，提示在肾间质纤维化过程中，间质成纤维细胞的细胞外基质的积聚起着重要的作用。
作者简介：王伟铭，男,34岁，主治医师，硕士
, 百拇医药
上海市瑞金二路197号，Tel.(021)64370045-665333
参考文献：
〔1〕 Bohle A, Muller GA,Wehrmann M, et al. Pathogenesis of chronic renal failure in the primary glomerulopathies,renal vasculopathies, and chronic interstitial nephritides〔J〕 . Kidney Int,1996;49(Suppl; 54):S2- S9.
〔2〕 Eddy AA. Expression of genes that promote renal interstitial fibrosis in rats with proteinuria〔J〕 . Kidney Int, 1996;49(Suppl 54):S49- S54.
, http://www.100md.com
〔3〕 Rodemann HP, Muller GA. Abnormal growth and clonal proliferation of fibroblasts derived from kidneys with interstitial fibrosis〔J〕 . J Exp Biol Med, 1990;195:57- 63.
〔4〕 Clayton A, Steadman R, Williams JD. Cells isolated from the human cortical interstitium resemble myofibroblasts and bind neutrophils in an ICAM-1-dependent manner〔J〕 . J Am Soc Nephrol, 1997;8:604- 613.
〔5〕 Glumoff V, Makela JK, Vuorio E. Cloning of rat proalpha 1(Ⅲ )collagen mRNA, different expression patterns ot type I and type III collagen and fibronectin genes in experimental granulation tissue〔J〕 . Biochim Biophys Acta, 1994;1217(1):41- 50.
, http://www.100md.com
〔6〕 Terada Y, Tomita K, Nonoguchi H, et al. Expression of endothin-3 mRNA along rat nephron segments using polymerase chain reaction〔J〕 . Kidney Int,1993;44:1273- 1285.
〔7〕 Eddy AA. Molecular insights into renal interstitial fibrosis〔J〕 . J Am Soc Nephrol,1996;7:2495- 2508.
〔8〕 Strutz F, Neilson EG. The role of lymphocytes in the progression of interstitial disease〔J〕 . Kidney Int,1994;45(Suppl 45):S106- S110.
, 百拇医药
〔9〕 Rodemann HP, Binder A, Burger A, et al. The underlying cellular mechanism of fibrosis〔J〕 . Kidney Int, 1996;49(Suppl 54):S32- S36.
〔10〕 Lonnemann G, Shapiro L, Engler-Blum G, et al. Cytokins in human renal interatitial fibrosis. I. Interleukin-1 is a paracrine growth factor for cultured fibrosis-derived kidney fibroblasts〔J〕 . Kidney Int, 1995;47:837- 844.
〔11〕 D'Angelo M, Chen JM, Ward G, et al. Regulation of type Ⅲ collagen metabolism by transforming growth factor β in embryonic cells〔J〕 . J Cell Biol,1991;116:266a- 274a.
收稿日期：1999-01-24
修回日期：1999-04-06, 百拇医药
单位：王伟铭(上海第二医科大学附属瑞金医院肾脏科，上海200025)；姚建(上海第二医科大学附属瑞金医院肾脏科，上海200025)；石蓉(上海第二医科大学附属瑞金医院肾脏科，上海200025)；董德长(上海第二医科大学附属瑞金医院肾脏科，上海200025)
关键词：TGF-β1；肾间质成纤维细胞；Ⅲ型胶原；细胞增殖
细胞与分子免疫学杂志000109
摘要:目的通过观察TGF-β1对肾间质成纤维细胞的增殖及Ⅲ型胶原mRNA表达的影响，探讨肾间质成纤维细胞在肾纤维化过程中的作用。方法应用大鼠肾间质成纤维细胞体外培养，以MTT比色法和RT-PCR法，观察TGF-β1对肾间质成纤维细胞的增殖作用和对Ⅲ型胶原mRNA表达的影响。结果TGF-β1可促进肾间质成纤维细胞的增殖，且与TGF-β1的质量浓度呈正相关；TGF-β1可刺激肾间质成纤细胞Ⅲ型胶原mRNA的表达，并呈剂量和时间依赖效应。结论TGF-β1与肾间质成纤维细胞的相互作用，在肾间质纤维化中可能起重要的作用。
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中图号：R392.12 文献标识码：A
文章编号:1007-8738(2000)01-0029-31
Effects of TGF-β1 on cellular proliferation and expression of type Ⅲ collagen by cultured rat renal interstitial fibroblasts
WANG Wei-ming,YAO Jian,SHI Rong,DONG De-chang
Department of Nephrology,Ruijin Hospital, Shanghai Second Medical University, Shanghai 200025, China
Abstract:Aim To investigate the effects of TGF-β1 on proliferation and type Ⅲ collagen mRNA expression of rat renal interstitial fibroblasts in vitro for elucidating the role of fibroblasts and TGF-β1 in renal interstitial fibrosis. Methods The cells were cultured in media containing various contents of TGF-β1. The Proliferation and expression of type Ⅲ collagen mRNA of the cells were assayed with MTT method and RT-PCR, respectively. Results TGF-β1 had a stimulating effect on proliferation with dose-dependence(TGF-β1 0～20 μ g/L),and induced an increasing expression of type Ⅲ collagen mRNA with dose-de-pendence(TGF-β1 0～ 10 μ g/L)and time-dependence(0～48 hours)to the renal fibroblasts. Conclusion TGF-β1 is involved in proliferation of renal interstitial fibroblasts with their type Ⅲ collagen mRNA expression, and might play an important role in renal interstitial fibrosis.
, 百拇医药
Keywords: TGF-β1; typeⅢ collagen; renal interstitial fibroblast; cellular proliferation
原发性肾病、肾血管病变和慢性间质性肾炎的病变发展到慢性肾功能衰竭的发病机制，至今尚未完全阐明〔1〕。近年研究显示，肾间质病变与肾衰发展的关系更为密切。肾间质纤维化是各种慢性肾脏疾病发展至终末期肾衰的共同病理表现。其组织学特征是，成纤维细胞的大量增多及主要由其分泌的细胞外基质的大量堆积〔2〕。我们通过观察TGF-β1对肾间质成纤维细胞的增殖及Ⅲ型胶原mRNA表达的影响，以探讨肾间质成纤维细胞在肾间质纤维化过程中的作用。
1 材料和方法
1.1 肾间质成纤维细胞的培养和增殖的测定 大鼠肾间质细胞采用Lonnemann等〔3〕提出的方法从正常Waster大鼠肾髓质中培养获得，具体步骤：将髓质肾组织切成1 mm3的小块，用0.5 g/L胶原酶消化20 min，1000 r/min离心5 min，去上清液，加RPMI 1640培养液洗两遍，分别通过不同孔径的筛网(80～200目)。收集200目以下的细胞悬液，用RPMI 1640培养液洗涤后，种入培养瓶中，加入含100 mL/L小牛血清的RPMI 1640培养液，置37℃，50 mL/L CO2培养箱中培养。生长出的细胞，根据形态学和免疫学表型确定为成纤维细胞。细胞增殖应用MTT比色法测定〔4〕。将肾间质成纤维细胞接种于96孔板(1×104/孔)。加无血清培养液37℃孵育24 h，使细胞生长同步进入休止期。弃上清液，加入含100 mL/L小牛血清的培养液刺激24 h。于刺激作用结束前4 h，加入MTT(5 g/L)(20 μL/孔)，经溶解后于酶标仪波长595 nm处读取A值。
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1.2 RT-PCR法检测Ⅲ型胶原mRNA的表达 经不同浓度(0～10 μg/L)的TGF-β1刺激和经TGF-β1不同时间(0～48 h)刺激的细胞总RNA的提取，依照Trizol试剂盒的方法进行。取20～30 μg细胞总RNA，经12 g/L琼脂糖-3 mol/L甲醛凝胶电泳分离，溴乙锭染色照相。取总RNA 2 μg做逆转录，所获产物各取5 μL进行Ⅲ型胶原与3′-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase, GAPDH)的PCR扩增。各取PCR产物10 μL，经16 g/L琼脂糖凝胶电泳后，于反射紫外灯下观察并照相。引物根据文献〔5，6〕报道，由中国科学院细胞所合成，序列如下：
Ⅲ型胶原：
3′-AGAAAGTGGAGACAATGGAGC-5′;
5′-AACCCAGTATTCTCCACTCTT-3′.
, 百拇医药
Product size:349 bp
3′-磷酸甘油醛脱氢酶:
3′-TTACATAGGCAACACCTAGA-5′;
5′-TCCCTCAAGATTGTCAGCAA-3′.
Product size:309 bp
统计学处理:两组比较采用配对t检验，显著性标准为P<0.05。TGF-β1的质量浓度与细胞增殖采用相关性检验。
2 结 果
2.1 TGF-β1对肾间质成纤维细胞增殖的作用
TGF-β1可促进肾间质成纤维细胞的增殖，且呈现一定的浓度正相关(r=0.9519, P<0.05)，即随着 TGF-β1质量浓度的增加， 细胞的增殖程度逐渐增强(图1)。
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图1 不同质量浓度TGF-β1对肾间质成纤维细胞增殖的影响
Fig 1 Effect of TGF-β1 with different contents on proliferation
of renal interstitial fibroblasts
2.2 TGF-β1对Ⅲ型胶原mRNA表达的影响
TGF-β1可促进肾间质成纤维细胞Ⅲ型胶原mRNA的表达，且与TGF-β1的浓度和刺激时间呈一定的正相关(图2，3)。
图2 不同质量浓度的TGF-β1对肾间质成纤维细胞Ⅲ型胶
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原mRNA表达的影响
Fig 2 Effect of TGF-β1 with different contents on mRNA expr
ession of type Ⅲ collagen by renal interstitial fibroblasts
M:pGEM-7Zf(+)/Hae Ⅲ DNA marker
图3 TGF-β1作用时间对肾间质成纤维细胞Ⅲ型胶原mR
NA表达的影响
Fig 3 Time effect of TGF-β1 on the mRNA expression of
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type Ⅲ collagen by renal interstitial fibroblasts
M: pGEM-7Zf(+)/Hae Ⅲ DNA marker
3 讨 论
多种细胞因子，如IL-α，IL-β，PDGF，TGF-α，TGF-β和TNF-α均具有致纤维化产生的作用(尤其是TGF-β)，且参与肾间质纤维化的各个细节〔7〕。活化的TGF-β可促进基质合成增多、抑制基质降解、整合素基质粘附分子的上调，以及趋化成纤维细胞和单核细胞。TGF-β是一类具有激素样活性的多肽，广泛存在于许多不同类型的正常细胞和转化细胞。其生物学功能是多方面的，对上皮细胞、结缔组织的正常细胞或恶性细胞，均具有极广泛的调节作用。在不同条件下，可刺激细胞的增殖、分化与生长〔7，8〕。而且在多种肾脏病变模型中，已发现TGF-β1的表达增加。本结果显示，TGF-β1可促进肾间质成纤维细胞的增殖，且随剂量的增加，促增殖效应进一步增强，与其对其它组织中成纤维细胞增殖的影响相似〔9，10〕。
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TGF-β1表达的增加与基质的积聚有关，其机制可能与TGF-β1可增加基质的产生和抑制基质的降解有关。本研究结果显示，TGF-β1可促进Ⅲ型胶原mRNA的表达，且在其浓度为2～10 μg/L之间与质量浓度呈正相关；在6～48 h内与时间呈正相关，同国外的报道相似〔11〕。
近年研究已显示，在肾间质纤维化过程中，存在细胞外基质代谢的异常，包括细胞外基质合成的增加和降解的减少。其原因可能是由于间质成纤维细胞受炎症或细胞因子(如TGF-β1)刺激后细胞的特性改变，增殖合成能力增强，而致细胞外基质合成增多所致。本结果也具有相似的结论。另外，有研究提示，可能是由于间质细胞产生的基质蛋白降解酶减少，或产生的基质蛋白降解酶抑制物增多等的综合作用所致。综上所述，提示在肾间质纤维化过程中，间质成纤维细胞的细胞外基质的积聚起着重要的作用。
作者简介：王伟铭，男,34岁，主治医师，硕士
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参考文献：
〔1〕 Bohle A, Muller GA,Wehrmann M, et al. Pathogenesis of chronic renal failure in the primary glomerulopathies,renal vasculopathies, and chronic interstitial nephritides〔J〕 . Kidney Int,1996;49(Suppl; 54):S2- S9.
〔2〕 Eddy AA. Expression of genes that promote renal interstitial fibrosis in rats with proteinuria〔J〕 . Kidney Int, 1996;49(Suppl 54):S49- S54.
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〔3〕 Rodemann HP, Muller GA. Abnormal growth and clonal proliferation of fibroblasts derived from kidneys with interstitial fibrosis〔J〕 . J Exp Biol Med, 1990;195:57- 63.
〔4〕 Clayton A, Steadman R, Williams JD. Cells isolated from the human cortical interstitium resemble myofibroblasts and bind neutrophils in an ICAM-1-dependent manner〔J〕 . J Am Soc Nephrol, 1997;8:604- 613.
〔5〕 Glumoff V, Makela JK, Vuorio E. Cloning of rat proalpha 1(Ⅲ )collagen mRNA, different expression patterns ot type I and type III collagen and fibronectin genes in experimental granulation tissue〔J〕 . Biochim Biophys Acta, 1994;1217(1):41- 50.
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〔6〕 Terada Y, Tomita K, Nonoguchi H, et al. Expression of endothin-3 mRNA along rat nephron segments using polymerase chain reaction〔J〕 . Kidney Int,1993;44:1273- 1285.
〔7〕 Eddy AA. Molecular insights into renal interstitial fibrosis〔J〕 . J Am Soc Nephrol,1996;7:2495- 2508.
〔8〕 Strutz F, Neilson EG. The role of lymphocytes in the progression of interstitial disease〔J〕 . Kidney Int,1994;45(Suppl 45):S106- S110.
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〔9〕 Rodemann HP, Binder A, Burger A, et al. The underlying cellular mechanism of fibrosis〔J〕 . Kidney Int, 1996;49(Suppl 54):S32- S36.
〔10〕 Lonnemann G, Shapiro L, Engler-Blum G, et al. Cytokins in human renal interatitial fibrosis. I. Interleukin-1 is a paracrine growth factor for cultured fibrosis-derived kidney fibroblasts〔J〕 . Kidney Int, 1995;47:837- 844.
〔11〕 D'Angelo M, Chen JM, Ward G, et al. Regulation of type Ⅲ collagen metabolism by transforming growth factor β in embryonic cells〔J〕 . J Cell Biol,1991;116:266a- 274a.
收稿日期：1999-01-24
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