间接法原位PCR检测喉鳞癌组织HPV感染
作者：李晓 吴能定 徐如君 沈宝珠 黎向红
单位：李晓(杭州市第一人民医院病理科，浙江杭州310006)；吴能定(杭州市第一人民医院病理科，浙江杭州310006)；徐如君(杭州市第一人民医院病理科，浙江杭州310006)；沈宝珠(杭州市第一人民医院病理科，浙江杭州310006)；黎向红(杭州市第一人民医院病理科，浙江杭州310006)
关键词：人乳头瘤病毒；喉鳞癌；免疫组化染色；原位杂交；聚合酶链反应；原位PCR
细胞与分子免疫学杂志000115
细胞与分子免疫学杂志
, http://www.100md.com
JOURNAL OF CELLULAR AND MOLECULAR IMMUNOLOGY
2000 Vol.16 No.1 P.045-048
间接法原位PCR检测喉鳞癌组织HPV感染
李晓 吴能定 徐如君 沈宝珠 黎向红
摘要：目的建立稳定的原位PCR方法，并探讨HPV感染与喉鳞癌发生的关系。方法采用免疫组化、原位杂交、PCR和间接原位PCR技术，检测了50例喉鳞癌中的HPV感染情况。结果免疫组化衣壳抗原阳性者6例(12%)，原位杂交阳性者13例(26%)，PCR阳性者10例(20%)，原位PCR阳性者17例(34%)，综合上述方法的检出率为42%(21例)。结论HPV感染与喉癌有着明显的关系，间接原位PCR在检测HPV感染中具有较高的敏感性、特异性和可靠性，可以定性、定位。
, 百拇医药
关键词：人乳头瘤病毒；喉鳞癌；免疫组化染色；原位杂交；聚合酶链反应；原位PCR
中图号：R36 文献标识码：A
文章编号:1007-8738(2000)01-0045-48
Detection of HPV infection in larynx squamous cell carcinoma tissues by indirect in situ polymerase chain reaction
LI Xiao WU Neng-ding,XU Ru-jung, SHEN Bao-zhu, LI Xiang-hong
Department of Pathology, First Municipal Hospital of Hangzhou, Hangzhou 310006, Zhejiang Province, China
, http://www.100md.com
Abstract: Aim To make up a stable method of in situ PCR and to probe the relationship between HPV infection and larynx squamous cell carcinomas. Metheds HPV infection in 50 specimens of larynx squamous cell carcinoma was examed by immunohistochemical staining. in situ hybridization,PCR and indirect in situ PCR. Results The positive detection rate of HPV DNA was 12% by immunohistochemistry, 26% by in situ hybridization,20% by PCR, 34% by in situ PCR, and totally 42% in twenty-one out of fifty cases. Conclusion HPV infection is related to the occurrence of larynx squamous cell carcinomas. Indirect in situ PCR has better sensitivity,reliability, and specificity than other methods. It is reliable and has the role of diagnosis of localization and nature of the lesion.
, 百拇医药
Keywords: human papilloma virus; larynx squamous cell carcinoma;immunohistochemistry staining; in situ hybridization polymerase chain reaction; indirect in situ PCR
近年研究表明，HPV与人类多种肿瘤的发生有关。人们曾应用免疫组化(IHC)、原位杂交或PCR等技术进行检测，以探讨HPV感染与喉癌发生的关系。我们综合应用上述方法，并进一步应用间接原位PCR技术，来检测HPV在喉鳞癌中的感染情况，旨在建立稳定的原位PCR方法，比较原位PCR与其它方法的差异，探讨HPV感染与喉癌的关系。间接原位PCR技术把分子生物学和病理组织学成功地结合起来，是一项具有发展前途且更易为病理学工作者所接受的分子病理技术。
1 材料和方法
1.1 材料 本院1990/1996，喉鳞状细胞癌活检或根治标本50例，均为男性，年龄41～73岁；术前均未做过放疗或化疗。所有标本均经100 mL/L福尔马林固定、石蜡包埋，经连续切片做HE、免疫组化、原位杂交、PCR和间接原位PCR。另各取6例尖锐湿疣和声带息肉分别作为阳性及阴性对照。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 免疫组化 经热平台做抗原修复后，进行ABC免疫组化，以DAB显色，苏木素复染。一抗采用衣壳抗原(BPV)购自中山生物公司。阴性对照不加一抗。
1.2.2 PCR 引物采用与高度保守的L1区同源的
通用型引物MY11和MY09(浙江农业大学合成)(扩增片段的长度约450 bp)，引物序列如下：
(1)MY11: 5′-GCMCAGGGWCATAAYAATGG-3′；
(2)MY09： 5′-CGTCCMARRGGAWACTGATC-3′。
R=A+G,W=A+T,Y=C+T.
将6～7 μm切片脱蜡，自然干燥，用50 μL蛋白酶K(200 mg/L)37 ℃消化过夜，煮沸10 min，12 000 r/min离心3 min。取5 μL上清液加于20 μL PCR反应液(Promega公司)(含10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP各200 μmol/L，Primer各0.5 μmol/L，Taq酶0.75 U，模板5 μL)中。循环参数如下：94 ℃预变性4 min，94℃变性1 min，55℃ 45 s，72℃ 40 s，共35个循环，72℃延伸5 min。以重蒸水代替样本作为阴性对照。
, http://www.100md.com
1.2.3 原位杂交 采用公用混和探针为生物素标记的寡核苷酸探针(上海生工生物工程公司合成)，序列如下：
GP1： CTGTTGTTGATACTACACGCAGTAC；
GP2： CTGTGGTAGATACCACWCGCAGTAC.
将4～5 μm厚切片，经脱蜡水化，Triton X100浸泡等预处理后，加杂交液50 μL，96℃变性10 min，37℃杂交过夜。杂交后洗涤，以羊血清封闭30 min，加碱性磷酸酶标记的亲和素作用1 h，TBS洗涤，BCIPNBT显色，常规封片。不加探针的杂交液作为阴性对照。
1.2.4 间接原位PCR 将7 μm厚切片捞于涂有APES胶的载玻片上，脱蜡水化，加蛋白酶K(30 mg/L)于37℃作用15 min。以2 g/L甘氨酸灭活蛋白酶K，酒精逐级脱水，自然晾干，加50 μL PCR反应液(10×PCR buffer 5 μL，dNTP各400 μmol/L，Taq酶 3 U及Primer 0.5 μmol/L)并盖上EASISEAL(Hybaid公司)，放入原位PCR仪(MJ公司)中扩增，循环参数如下：96℃预变性5 min，96℃变性1 min，55℃1 min，74℃1 min，30个循环，72℃延伸5 min，40 mL/L多聚甲醛固定10 min，酒精逐级脱水，自然晾干，以后步骤同原位杂交。分别以不加探针、Taq酶或引物的杂交液作为阴性对照。所用引物同PCR，探针同原位杂交。
, 百拇医药
2 结 果
在50例喉鳞癌中I级者20例，I～II级者18例，II级者11例，乳头状瘤癌变者1例(图1)。
图1 喉鳞癌HE染色
Fig 1 Larynx squamous cell carcinoma HE×200
nest of carcinoma cells infiltrated in stroma, with notably atypical nuclei, dyskeratosis and squamous pearls.
2.1 原位杂交 阳性者13例(26%)。阳性细胞的特征是：癌细胞核内出现蓝紫色颗粒，少数病例同时在胞质内也出现阳性信号(图2)。
, http://www.100md.com
图2 喉鳞癌的原位杂交
Fig 2 In situ hybridization of larynx squamous cell carci
noma BCIPNBT staining×200
Blueviolet granules within nuclei.
2.2 PCR 阳性者10例(20%)，扩增产物的电泳条带与阳性对照一致。以DNA的分子质量标准(上海华美生物工程公司)为对照，证实其产物的长度符合引物设计预期长度(约450 bp)。阴性对照未见任何扩增条带，6例尖锐湿疣呈阳性，6例声带息肉呈阴性(图3)。
, 百拇医药
图3 喉鳞癌的PCR电泳图
Fig 3 PCR electrophoregram of larynx squamous cell carcinoma
1: DNA marker;2: Positive control sample: condylomata acuminata;
3:Negative control: double distilled water instead of sample;
4,5: Samples of larynx squamous cell carcinoma.
2.3 间接原位PCR 阳性者17例(34%)。阳性特征: 癌细胞核内出现蓝紫色颗粒，少数病例同时在胞质内也出现阳性信号；阳性细胞在癌巢内呈灶状、散在分布；在近癌珠分化较好的癌细胞、凹空细胞及癌巢边缘分化差的细胞核内均可见到(图4)。
, 百拇医药
图4 喉鳞癌的原位PCR
Fig 4 In situ PCR of larynx squamous cell carcinoma,BCIPNBT staining ×200
Violet positive signals within nuclei.
2.4 免疫组化染色 衣壳抗原阳性者6例，均为PCR、原位杂交和(或)原位PCR阳性的病例，癌细胞胞质或核内出现棕黄色颗粒者为阳性(图5)。![t4702.gif (9407 字节)]()
图5 牛乳头状病毒感染的喉鳞癌的免疫组化染色
Fig 5 ImmunohistochemiCal staining of larynx squamous cell
, 百拇医药
carcinoma by(bovine papilloma virus)DAB staning×200
Yellow positive signals located within nuclei.
表1 喉鳞癌中HPV感染的4种方法检测结果
Tab 1 Detection results of HPV infection in larynx squamous
cell carcinomas by 4 methods
n
IHC
staining
, http://www.100md.com
In situ
hybridization
Indirect
PCR
in situ PCR
4
+
+
+
+
2
-
+
, 百拇医药
+
+
4
-
+
-
+
1
+
-
+
+
1
-
, 百拇医药
-
+
+
5
-
-
-
+
1
+
-
+
-
2
, 百拇医药
-
+
-
-
1
-
+
+
-
Total 21
6
(12%)
13
(26%)
, 百拇医药
10
(20%)
17
(34%)
3 讨 论
1982年，Syrianen首次提出HPV感染与喉癌的发生有关，以后对喉癌中HPV的检出阳性率在18%～58.8%，差异较大。另有作者报道，喉癌的发生与一些化学致癌因素(如吸烟)的关系更为密切〔1〕。考虑这可能与肺癌、食管癌相似，存在地区性差异〔2，3〕，同时也与检测的HPV型别、检测手段、各实验室具体条件等的不同，以及标本固定和蜡块的保存等有一定关系。我们综合应用免疫组化、原位杂交和PCR方法，并进一步应用原位PCR，对50例喉鳞癌中的HPV进行检测，所用通用型引物可扩增HPV6，11，16，18，33等40多型的HPV。结果阳性者21例(42%)，虽低于文献报道最高的阳性率〔4〕，但仍可见本组喉癌与HPV感染有着密切的关系。
, 百拇医药
近年研究发现，原位PCR中的间接法较直接法特异性强，原位PCR假阳性的原因多数为直接法引起，可应用热启动，来克服、或减少同样存在于液相PCR中的引物与模板错配所致非特异性扩增现象，而用多重引物对减少扩增产物的弥散并非必要。我们在PCR和原位PCR中，使用的是相同的单对引物，并曾试用热启动方法，但未见明显差别。本组扩增产物序列长450 bp，控制循环数为30次。扩增后用多聚甲醛固定，并采用较厚的切片以防止弥散〔5〕。在实验中设置了多种对照，所采用的探针与原位杂交相同，是与扩增产物内部片段互补的寡核苷酸探针，可最大程度地避免探针与非特异性扩增产物、以及引物二聚体等非目的核酸片段杂交而导致的假阳性。综上所述我们认为，本组原位PCR阳性率高于PCR，且有4例仅见原位PCR阳性，不存在假阳性问题。原因可能是液相PCR在抽提过程中含靶序列的DNA被稀释于不含靶序列的DNA中，或同时目的基因受其它基因的干扰，从而降低了敏感性质量所致。而原位PCR时，由于一个细胞作为一个扩增的“微容器”，其中的靶DNA在一较高浓度的反应液中扩增，不被其它DNA稀释，也不受其它基因的干扰〔6〕，只要切片处理适当，切片内的靶DNA就不易丢失，从而较之PCR更易检出靶DNA。本组阳性细胞多呈灶状、片状分布，可能就是其表现。因此，靶DNA在组织细胞中的区域浓度才是原位PCR敏感性的真正指标。原位PCR很少会出现液相PCR中由于各种污染而造成的假阳性，此因细胞膜的分隔作用和扩增后的洗涤，可使污染物难以进入细胞内或附着于细胞膜上〔6，7〕所致。所以，对石蜡切片标本而言，原位PCR比液相PCR有更高的敏感性和特异性。
, 百拇医药
我们发现原位PCR较原位杂交的阳性数及强度明显增加；同时显色时间明显缩短，以其中一例乳头状瘤癌变最为明显。在癌巢边缘分化较差的癌细胞核内也可见到阳性信号，这与在宫颈鳞状上皮病变中所见类似〔8〕。本组3例原位杂交可见有个别可疑的阳性但难以确定，其原位PCR为阳性，可见当靶DNA的拷贝数较少时，经过扩增后靶DNA的拷贝数可显著增加而使显色强度增加，出现阳性信号。本组有3例原位PCR阴性而原位杂交阳性，可能是这3例组织较小而破碎，在原位PCR中反复的高温对组织形态结构造成一定的破坏，使核酸及扩增产物丢失所致。所以如何在提高扩增效率的同时，尽可能地减少对组织的破坏，仍是原位PCR目前存在的一个问题。
在原位PCR实验过程中，我们的体会是：①切片的厚度对实验结果的影响不容忽视。由于切片越厚所含靶DNA序列的总量越多，且在较厚的切片上膜结构保存较多，能减少扩增产物的弥散〔9〕,从而使敏感性提高而背景染色降低。但厚切片存在容易脱片的问题，我们采用7 μm厚的切片，喉鳞癌组织本身虽较易脱片，但在应用了APES胶后取得了满意的效果。②采用合适的蛋白酶K浓度、适宜的消化时间与温度，才能保证好的实验结果，如消化过度或不足，则将降低原位PCR的敏感性和特异性。我们经反复实验确定，蛋白酶K的质量浓度为30 mg/L，以37℃作用15 min效果最佳，浓度较之文献报道的略高，考虑这与切片较厚有关。③扩增前是否要经RNase消化？我们通过比较发现，不用RNase消化背景染色也很低，可见非特异性扩增不明显，故认为可以省略这一步以简化操作。④在扩增过程中极易发生液体蒸发，而导致实验失败，我们应用Hybaid公司的 EasiSeal效果很好，保证了实验的顺利进行。
, 百拇医药
致谢：浙江医科大学病理学教研室来茂德教授等热情指导和帮助，深表感谢!
作者简介：李晓，女，35岁，主治医生
杭州市浣沙路261号.Tel.(0571)7065701-3350/3351
李晓(杭州市第一人民医院病理科，浙江杭州310006)
吴能定(杭州市第一人民医院病理科，浙江杭州310006)
徐如君(杭州市第一人民医院病理科，浙江杭州310006)
沈宝珠(杭州市第一人民医院病理科，浙江杭州310006)
黎向红(杭州市第一人民医院病理科，浙江杭州310006)
, 百拇医药
参考文献 ：
〔1〕 Sagar J, Vereczkey I, Toth J. Some etio-pathogenetic factors in laryngeal carcinogenesis〔J〕 . J Environ Pathol Toxicol Oncol, 1996; 15(2- 4):195- 199.
〔2〕李素凤，刘鸿瑞，张雷，等.肺鳞状细胞癌中人乳头瘤病毒感染的研究〔J〕.诊断病理学杂志，1997；4(4)：202-205.
〔3〕 Mario P, Cerar A, Seme K. Human papilloma virus infection in esophageal carcinomas: a study of 121 lesions using multiple bread- spectrum polymerase chain reactions and literature review〔J〕 . Hum Pathol, 1998; 29:266- 271.
, http://www.100md.com
〔4〕 Ma XL, Ueno K, Pan ZM, et al. Human papilloma virus DNA sequences and p53 over- expression in laryngeal squmous cell carcinomas in northern China〔J〕 . J Med Virol, 1998 ;54(3):186- 191.
〔5〕 Gu J. Principles and applications of in situ PCR〔J〕 . Cell Vision, 1994;1(1):8- 19.
〔6〕 Bagasra 0, Hauptman ST, Lischner HW, et al. Detection of human immunodeficiency virus type 1 provirus in mononuclear cells by in situ polymerase chain reaction〔J〕 . N Engl J Med,1992; 326:1388- 1391.
, http://www.100md.com
〔7〕郑宁，余竹元，朱世能.一种新型直接原位PCR法〔J〕.中华病理杂志，1998；27(2)：63-65.
〔8〕 Nucvo G, Mac Connell P. Forda A, et al. Detection of human papilloma virus DNA in formalin- fixed tissues by in situ hybridization after amplification by polymerase chain reaction〔J〕 . Am J Pathol, 1991; 139:847- 854.
〔9〕苏慧慈，刘彦仿.原位PCR.北京：科学技术出版社，1995：90-91.
收稿日期：1999-01-18
修回日期：1999-04-23, http://www.100md.com
单位：李晓(杭州市第一人民医院病理科，浙江杭州310006)；吴能定(杭州市第一人民医院病理科，浙江杭州310006)；徐如君(杭州市第一人民医院病理科，浙江杭州310006)；沈宝珠(杭州市第一人民医院病理科，浙江杭州310006)；黎向红(杭州市第一人民医院病理科，浙江杭州310006)
关键词：人乳头瘤病毒；喉鳞癌；免疫组化染色；原位杂交；聚合酶链反应；原位PCR
细胞与分子免疫学杂志000115
细胞与分子免疫学杂志
, http://www.100md.com
JOURNAL OF CELLULAR AND MOLECULAR IMMUNOLOGY
2000 Vol.16 No.1 P.045-048
间接法原位PCR检测喉鳞癌组织HPV感染
李晓 吴能定 徐如君 沈宝珠 黎向红
摘要：目的建立稳定的原位PCR方法，并探讨HPV感染与喉鳞癌发生的关系。方法采用免疫组化、原位杂交、PCR和间接原位PCR技术，检测了50例喉鳞癌中的HPV感染情况。结果免疫组化衣壳抗原阳性者6例(12%)，原位杂交阳性者13例(26%)，PCR阳性者10例(20%)，原位PCR阳性者17例(34%)，综合上述方法的检出率为42%(21例)。结论HPV感染与喉癌有着明显的关系，间接原位PCR在检测HPV感染中具有较高的敏感性、特异性和可靠性，可以定性、定位。
, 百拇医药
关键词：人乳头瘤病毒；喉鳞癌；免疫组化染色；原位杂交；聚合酶链反应；原位PCR
中图号：R36 文献标识码：A
文章编号:1007-8738(2000)01-0045-48
Detection of HPV infection in larynx squamous cell carcinoma tissues by indirect in situ polymerase chain reaction
LI Xiao WU Neng-ding,XU Ru-jung, SHEN Bao-zhu, LI Xiang-hong
Department of Pathology, First Municipal Hospital of Hangzhou, Hangzhou 310006, Zhejiang Province, China
, http://www.100md.com
Abstract: Aim To make up a stable method of in situ PCR and to probe the relationship between HPV infection and larynx squamous cell carcinomas. Metheds HPV infection in 50 specimens of larynx squamous cell carcinoma was examed by immunohistochemical staining. in situ hybridization,PCR and indirect in situ PCR. Results The positive detection rate of HPV DNA was 12% by immunohistochemistry, 26% by in situ hybridization,20% by PCR, 34% by in situ PCR, and totally 42% in twenty-one out of fifty cases. Conclusion HPV infection is related to the occurrence of larynx squamous cell carcinomas. Indirect in situ PCR has better sensitivity,reliability, and specificity than other methods. It is reliable and has the role of diagnosis of localization and nature of the lesion.
, 百拇医药
Keywords: human papilloma virus; larynx squamous cell carcinoma;immunohistochemistry staining; in situ hybridization polymerase chain reaction; indirect in situ PCR
近年研究表明，HPV与人类多种肿瘤的发生有关。人们曾应用免疫组化(IHC)、原位杂交或PCR等技术进行检测，以探讨HPV感染与喉癌发生的关系。我们综合应用上述方法，并进一步应用间接原位PCR技术，来检测HPV在喉鳞癌中的感染情况，旨在建立稳定的原位PCR方法，比较原位PCR与其它方法的差异，探讨HPV感染与喉癌的关系。间接原位PCR技术把分子生物学和病理组织学成功地结合起来，是一项具有发展前途且更易为病理学工作者所接受的分子病理技术。
1 材料和方法
1.1 材料 本院1990/1996，喉鳞状细胞癌活检或根治标本50例，均为男性，年龄41～73岁；术前均未做过放疗或化疗。所有标本均经100 mL/L福尔马林固定、石蜡包埋，经连续切片做HE、免疫组化、原位杂交、PCR和间接原位PCR。另各取6例尖锐湿疣和声带息肉分别作为阳性及阴性对照。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 免疫组化 经热平台做抗原修复后，进行ABC免疫组化，以DAB显色，苏木素复染。一抗采用衣壳抗原(BPV)购自中山生物公司。阴性对照不加一抗。
1.2.2 PCR 引物采用与高度保守的L1区同源的
通用型引物MY11和MY09(浙江农业大学合成)(扩增片段的长度约450 bp)，引物序列如下：
(1)MY11: 5′-GCMCAGGGWCATAAYAATGG-3′；
(2)MY09： 5′-CGTCCMARRGGAWACTGATC-3′。
R=A+G,W=A+T,Y=C+T.
将6～7 μm切片脱蜡，自然干燥，用50 μL蛋白酶K(200 mg/L)37 ℃消化过夜，煮沸10 min，12 000 r/min离心3 min。取5 μL上清液加于20 μL PCR反应液(Promega公司)(含10×PCR buffer 2.5 μL，dNTP各200 μmol/L，Primer各0.5 μmol/L，Taq酶0.75 U，模板5 μL)中。循环参数如下：94 ℃预变性4 min，94℃变性1 min，55℃ 45 s，72℃ 40 s，共35个循环，72℃延伸5 min。以重蒸水代替样本作为阴性对照。
, http://www.100md.com
1.2.3 原位杂交 采用公用混和探针为生物素标记的寡核苷酸探针(上海生工生物工程公司合成)，序列如下：
GP1： CTGTTGTTGATACTACACGCAGTAC；
GP2： CTGTGGTAGATACCACWCGCAGTAC.
将4～5 μm厚切片，经脱蜡水化，Triton X100浸泡等预处理后，加杂交液50 μL，96℃变性10 min，37℃杂交过夜。杂交后洗涤，以羊血清封闭30 min，加碱性磷酸酶标记的亲和素作用1 h，TBS洗涤，BCIPNBT显色，常规封片。不加探针的杂交液作为阴性对照。
1.2.4 间接原位PCR 将7 μm厚切片捞于涂有APES胶的载玻片上，脱蜡水化，加蛋白酶K(30 mg/L)于37℃作用15 min。以2 g/L甘氨酸灭活蛋白酶K，酒精逐级脱水，自然晾干，加50 μL PCR反应液(10×PCR buffer 5 μL，dNTP各400 μmol/L，Taq酶 3 U及Primer 0.5 μmol/L)并盖上EASISEAL(Hybaid公司)，放入原位PCR仪(MJ公司)中扩增，循环参数如下：96℃预变性5 min，96℃变性1 min，55℃1 min，74℃1 min，30个循环，72℃延伸5 min，40 mL/L多聚甲醛固定10 min，酒精逐级脱水，自然晾干，以后步骤同原位杂交。分别以不加探针、Taq酶或引物的杂交液作为阴性对照。所用引物同PCR，探针同原位杂交。
, 百拇医药
2 结 果
在50例喉鳞癌中I级者20例，I～II级者18例，II级者11例，乳头状瘤癌变者1例(图1)。
图1 喉鳞癌HE染色
Fig 1 Larynx squamous cell carcinoma HE×200
nest of carcinoma cells infiltrated in stroma, with notably atypical nuclei, dyskeratosis and squamous pearls.
2.1 原位杂交 阳性者13例(26%)。阳性细胞的特征是：癌细胞核内出现蓝紫色颗粒，少数病例同时在胞质内也出现阳性信号(图2)。
, http://www.100md.com
图2 喉鳞癌的原位杂交
Fig 2 In situ hybridization of larynx squamous cell carci
noma BCIPNBT staining×200
Blueviolet granules within nuclei.
2.2 PCR 阳性者10例(20%)，扩增产物的电泳条带与阳性对照一致。以DNA的分子质量标准(上海华美生物工程公司)为对照，证实其产物的长度符合引物设计预期长度(约450 bp)。阴性对照未见任何扩增条带，6例尖锐湿疣呈阳性，6例声带息肉呈阴性(图3)。
, 百拇医药
图3 喉鳞癌的PCR电泳图
Fig 3 PCR electrophoregram of larynx squamous cell carcinoma
1: DNA marker;2: Positive control sample: condylomata acuminata;
3:Negative control: double distilled water instead of sample;
4,5: Samples of larynx squamous cell carcinoma.
2.3 间接原位PCR 阳性者17例(34%)。阳性特征: 癌细胞核内出现蓝紫色颗粒，少数病例同时在胞质内也出现阳性信号；阳性细胞在癌巢内呈灶状、散在分布；在近癌珠分化较好的癌细胞、凹空细胞及癌巢边缘分化差的细胞核内均可见到(图4)。
, 百拇医药
图4 喉鳞癌的原位PCR
Fig 4 In situ PCR of larynx squamous cell carcinoma,BCIPNBT staining ×200
Violet positive signals within nuclei.
2.4 免疫组化染色 衣壳抗原阳性者6例，均为PCR、原位杂交和(或)原位PCR阳性的病例，癌细胞胞质或核内出现棕黄色颗粒者为阳性(图5)。
图5 牛乳头状病毒感染的喉鳞癌的免疫组化染色
Fig 5 ImmunohistochemiCal staining of larynx squamous cell
, 百拇医药
carcinoma by(bovine papilloma virus)DAB staning×200
Yellow positive signals located within nuclei.
表1 喉鳞癌中HPV感染的4种方法检测结果
Tab 1 Detection results of HPV infection in larynx squamous
cell carcinomas by 4 methods
n
IHC
staining
, http://www.100md.com
In situ
hybridization
Indirect
PCR
in situ PCR
4
+
+
+
+
2
-
+
, 百拇医药
+
+
4
-
+
-
+
1
+
-
+
+
1
-
, 百拇医药
-
+
+
5
-
-
-
+
1
+
-
+
-
2
, 百拇医药
-
+
-
-
1
-
+
+
-
Total 21
6
(12%)
13
(26%)
, 百拇医药
10
(20%)
17
(34%)
3 讨 论
1982年，Syrianen首次提出HPV感染与喉癌的发生有关，以后对喉癌中HPV的检出阳性率在18%～58.8%，差异较大。另有作者报道，喉癌的发生与一些化学致癌因素(如吸烟)的关系更为密切〔1〕。考虑这可能与肺癌、食管癌相似，存在地区性差异〔2，3〕，同时也与检测的HPV型别、检测手段、各实验室具体条件等的不同，以及标本固定和蜡块的保存等有一定关系。我们综合应用免疫组化、原位杂交和PCR方法，并进一步应用原位PCR，对50例喉鳞癌中的HPV进行检测，所用通用型引物可扩增HPV6，11，16，18，33等40多型的HPV。结果阳性者21例(42%)，虽低于文献报道最高的阳性率〔4〕，但仍可见本组喉癌与HPV感染有着密切的关系。
, 百拇医药
近年研究发现，原位PCR中的间接法较直接法特异性强，原位PCR假阳性的原因多数为直接法引起，可应用热启动，来克服、或减少同样存在于液相PCR中的引物与模板错配所致非特异性扩增现象，而用多重引物对减少扩增产物的弥散并非必要。我们在PCR和原位PCR中，使用的是相同的单对引物，并曾试用热启动方法，但未见明显差别。本组扩增产物序列长450 bp，控制循环数为30次。扩增后用多聚甲醛固定，并采用较厚的切片以防止弥散〔5〕。在实验中设置了多种对照，所采用的探针与原位杂交相同，是与扩增产物内部片段互补的寡核苷酸探针，可最大程度地避免探针与非特异性扩增产物、以及引物二聚体等非目的核酸片段杂交而导致的假阳性。综上所述我们认为，本组原位PCR阳性率高于PCR，且有4例仅见原位PCR阳性，不存在假阳性问题。原因可能是液相PCR在抽提过程中含靶序列的DNA被稀释于不含靶序列的DNA中，或同时目的基因受其它基因的干扰，从而降低了敏感性质量所致。而原位PCR时，由于一个细胞作为一个扩增的“微容器”，其中的靶DNA在一较高浓度的反应液中扩增，不被其它DNA稀释，也不受其它基因的干扰〔6〕，只要切片处理适当，切片内的靶DNA就不易丢失，从而较之PCR更易检出靶DNA。本组阳性细胞多呈灶状、片状分布，可能就是其表现。因此，靶DNA在组织细胞中的区域浓度才是原位PCR敏感性的真正指标。原位PCR很少会出现液相PCR中由于各种污染而造成的假阳性，此因细胞膜的分隔作用和扩增后的洗涤，可使污染物难以进入细胞内或附着于细胞膜上〔6，7〕所致。所以，对石蜡切片标本而言，原位PCR比液相PCR有更高的敏感性和特异性。
, 百拇医药
我们发现原位PCR较原位杂交的阳性数及强度明显增加；同时显色时间明显缩短，以其中一例乳头状瘤癌变最为明显。在癌巢边缘分化较差的癌细胞核内也可见到阳性信号，这与在宫颈鳞状上皮病变中所见类似〔8〕。本组3例原位杂交可见有个别可疑的阳性但难以确定，其原位PCR为阳性，可见当靶DNA的拷贝数较少时，经过扩增后靶DNA的拷贝数可显著增加而使显色强度增加，出现阳性信号。本组有3例原位PCR阴性而原位杂交阳性，可能是这3例组织较小而破碎，在原位PCR中反复的高温对组织形态结构造成一定的破坏，使核酸及扩增产物丢失所致。所以如何在提高扩增效率的同时，尽可能地减少对组织的破坏，仍是原位PCR目前存在的一个问题。
在原位PCR实验过程中，我们的体会是：①切片的厚度对实验结果的影响不容忽视。由于切片越厚所含靶DNA序列的总量越多，且在较厚的切片上膜结构保存较多，能减少扩增产物的弥散〔9〕,从而使敏感性提高而背景染色降低。但厚切片存在容易脱片的问题，我们采用7 μm厚的切片，喉鳞癌组织本身虽较易脱片，但在应用了APES胶后取得了满意的效果。②采用合适的蛋白酶K浓度、适宜的消化时间与温度，才能保证好的实验结果，如消化过度或不足，则将降低原位PCR的敏感性和特异性。我们经反复实验确定，蛋白酶K的质量浓度为30 mg/L，以37℃作用15 min效果最佳，浓度较之文献报道的略高，考虑这与切片较厚有关。③扩增前是否要经RNase消化？我们通过比较发现，不用RNase消化背景染色也很低，可见非特异性扩增不明显，故认为可以省略这一步以简化操作。④在扩增过程中极易发生液体蒸发，而导致实验失败，我们应用Hybaid公司的 EasiSeal效果很好，保证了实验的顺利进行。
, 百拇医药
致谢：浙江医科大学病理学教研室来茂德教授等热情指导和帮助，深表感谢!
作者简介：李晓，女，35岁，主治医生
杭州市浣沙路261号.Tel.(0571)7065701-3350/3351
李晓(杭州市第一人民医院病理科，浙江杭州310006)
吴能定(杭州市第一人民医院病理科，浙江杭州310006)
徐如君(杭州市第一人民医院病理科，浙江杭州310006)
沈宝珠(杭州市第一人民医院病理科，浙江杭州310006)
黎向红(杭州市第一人民医院病理科，浙江杭州310006)
, 百拇医药
参考文献 ：
〔1〕 Sagar J, Vereczkey I, Toth J. Some etio-pathogenetic factors in laryngeal carcinogenesis〔J〕 . J Environ Pathol Toxicol Oncol, 1996; 15(2- 4):195- 199.
〔2〕李素凤，刘鸿瑞，张雷，等.肺鳞状细胞癌中人乳头瘤病毒感染的研究〔J〕.诊断病理学杂志，1997；4(4)：202-205.
〔3〕 Mario P, Cerar A, Seme K. Human papilloma virus infection in esophageal carcinomas: a study of 121 lesions using multiple bread- spectrum polymerase chain reactions and literature review〔J〕 . Hum Pathol, 1998; 29:266- 271.
, http://www.100md.com
〔4〕 Ma XL, Ueno K, Pan ZM, et al. Human papilloma virus DNA sequences and p53 over- expression in laryngeal squmous cell carcinomas in northern China〔J〕 . J Med Virol, 1998 ;54(3):186- 191.
〔5〕 Gu J. Principles and applications of in situ PCR〔J〕 . Cell Vision, 1994;1(1):8- 19.
〔6〕 Bagasra 0, Hauptman ST, Lischner HW, et al. Detection of human immunodeficiency virus type 1 provirus in mononuclear cells by in situ polymerase chain reaction〔J〕 . N Engl J Med,1992; 326:1388- 1391.
, http://www.100md.com
〔7〕郑宁，余竹元，朱世能.一种新型直接原位PCR法〔J〕.中华病理杂志，1998；27(2)：63-65.
〔8〕 Nucvo G, Mac Connell P. Forda A, et al. Detection of human papilloma virus DNA in formalin- fixed tissues by in situ hybridization after amplification by polymerase chain reaction〔J〕 . Am J Pathol, 1991; 139:847- 854.
〔9〕苏慧慈，刘彦仿.原位PCR.北京：科学技术出版社，1995：90-91.
收稿日期：1999-01-18
修回日期：1999-04-23, http://www.100md.com