单纯分泌型TNF-α真核表达质粒的构建及表达细胞株的建立
作者：黄家强 卜夏 史须 李卓娅 龚非力
单位：黄家强(同济医科大学免疫学教研室,湖北武汉430030)；卜夏(同济医科大学免疫学教研室,湖北武汉430030)；史须(同济医科大学免疫学教研室,湖北武汉430030)；李卓娅(同济医科大学免疫学教研室,湖北武汉430030)；龚非力(同济医科大学免疫学教研室,湖北武汉430030)
关键词：分泌型TNF-α；膜型TNF-α；信号肽；基因表达
细胞与分子免疫学杂志000102
摘要：目的揭示膜结合的TNF-α前体(mTNF-α)与分泌型TNF-α(sTNF-α)生物学活性的不同。方法在克隆出mTNF-α基因的基础上,我们采用IL-2信号肽编码序列置换m-TNF-α前导肽编码序列,构建出只产生分泌型TNF-α的真核表达质粒pBK-sTNFm,并转染至NIH3T3细胞中。结果筛选出的阳性克隆细胞经Westernblot分析及活性测定显示,pBK-sTNFm转染细胞裂解液及培养上清，均可检出相对分子质量(Mr)17000的TNF-α,且上清具有sTNF-α活性,但细胞固定后其活性丧失。结论成功地构建了在真核细胞中只产生sTNF-α的表达质粒,并建立相应的表达细胞株。为比较两种类型的TNF-α的生物学活性及其作用机制奠定了基础。
, 百拇医药
中图号:Q78 文献标识码：A
文章编号:1007-8738(2000)01-0006-09
Construction of eukaryotic expression vector and establishment of cell line solely producing human TNF-α in secretory form
HUANG Jia-qiang,BU Xia, SHI Xu, LI Zhuo-ya, GONG Fei-li
Department of Immunology, Tongji Medical University, Wuhan 430030, Hubei Province, China
Abstract: Aim To reveal the differences between membrame-bound TNF-α precusor(mTNF-α ) and secretory TNF-α (sTNF-α)in the bioactivities. Methods A recombinant TNF with only secretory form(pBK-sTNFm) was constructed in which the leader sequence of TNF-α was replaced by the DNA sequence coding the human IL-2 signal peptide and then transfected into NIH3T3 cells. Results G418-resistant colonies and their expression products were identified by bioassay and Western blot. TNF with Mr 17 000 could be demonstrated both in cell lysate and culture supernatants of the pBK-sTNFm transfected cells and only the supernatant displayed cytotoxicity. Conclusion A cell line only producing sTNF-α is successfully established, which also provides the basis for studying the biologic activity and its mechanism.
, http://www.100md.com
Keywords:secretory TNF; membrane- bound TNF;signal peptide; gene transfer
TNF-α是一多效性细胞因子[1]。现已知,由233个氨基酸组成的TNF-α与典型的分泌型蛋白的合成及分泌机制不同[2,3]。TNF-αN端的含有由76个氨基酸组成的超常前导肽，在内质网中不被切除，而是首先通过其疏水氨基酸区将TNF-α前体“锚定”于胞膜表面,形成Mr为26000的膜结合型TNF-α(mTNF-α),进而通过TNF-α转换酶(TNF-α-converting enzyme,TACE)[4]裂解，产生由157个氨基酸组成的Mr17000的分泌型TNF(sTNF)，故TNF-α在体内可有两种形式存在。研究表明，两型TNF-α在生物学效应及其作用机制等方面各具特征[2-5]。为了能更好地分别研究两型TNF-α，我们构建了在真核细胞中只产生S-TNF-α的表达质粒，并建立相应的表达细胞株。
1材料和方法
, 百拇医药
1.1 材料 大肠杆菌XLI-BlueMEF和穿梭载体pBK-CMV，由翦必希博士惠赠。细胞株NIH3T3购自武汉大学中国典型物保藏中心;L929为本室保存。TRIzol试剂、Superscript逆转录试剂、T4DNA连接酶、限制性内切酶、G418、RPMI-1640和DMEM细胞培养基、小牛血清(Gibco)；质粒提取纯化试剂盒、DOTAP转染试剂(Boehringer Mannhe-in，BRM)；四甲基偶氮唑盐(MTT，Fluka)；抗hTNF-αmAbT4(北京邦定公司)。其它生化试剂均为进口或国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 M-TNFcDNA(mTNF)的克隆及测序〔6a〕 以LPS(100μg/L)刺激人外周血单核细胞4h后，提取总RNA，并逆转录合成cDNA第1条链。以此链为模板，进行PCR扩增mTNF-α，反应条件为:94℃ 1 min，64℃ 1 min，再72℃ 1 min，循环28次；再72℃ 10 min。PCR产物经沉淀、BamHI/HindIII双酶切、低溶点琼脂糖凝胶电泳回收纯化，再与相应酶切后的质粒pBK-CMV定向连接。经转化、筛选及鉴定后，命名为pBK-mTNF。用双脱氧核苷酸末端终止法，对插入片段用373A型DNA荧光测序仪(ABI公司)进行自动测序分析。
, 百拇医药
图1sTNFm的构建与序列分析
Fig 1 Construction and sequence analysis of sTNFm
1.2.2 单纯分泌型TNF-α基因(sTNFm)的构建及测序 采用基因重叠延伸拼接PCR法(gene splicing by overlapping extensionPCR，SOE-PCR)[7](图1)。提取ConA(20mg/L)刺激24h后的人外周血单个核细胞总RNA，以逆转录合成cDNA第1条链为模板。sTNFm扩增引物由一对外侧引物(P3和P2)和一对内重叠连接引物(P4和P5)组成。首先用P3和P4扩增基因片段A，PCR反应条件为：94℃30s，60℃50s，72℃30s，循环28次；再72℃5min。以测序验证后的pBK-mTNF为模板，以P5和P2扩增基因片段B，反应条件为:94℃4min，94℃1min，62℃1min，72℃1min，循环28次；再72℃10min。片段A，B经电泳回收纯化后，各取1μg混合作为模板，以上述一对外侧引物P3和P2进行PCR扩增，反应条件为:94℃1min，50℃2min，72℃3min，共25个循环。电泳回收纯化的PCR产物，按上述方法构建出sTNFm的真核表达质粒，命名为pBK-sTNFm并测序。
, 百拇医药
1.2.3 细胞转染及筛选〔6b] 用DOTAP试剂将pBK-mTNF、pBK-sTNFm及其对照pBK-CMV转入NIH3T3细胞，继续培养48h后，分别取部分细胞培养于8孔玻片(BRM)进行间接免疫荧光检测。其余细胞按1×105个/孔接种于24孔培养板内，加选择培养基。3wk后选择培养基逐渐减量，4wk后减至一半，并用有限稀释法对阳性克隆进行亚克隆。
1.2.4 克隆细胞株表达产物的鉴定 表达产物生物活性的检测与筛选:采用MTT法。收集1×106转染细胞培养上清，检测上清(分泌型蛋白)对靶细胞L-929的细胞毒活性[8]。转染细胞用10mL/L多聚甲醛固定10min，PBS洗3次，按效：靶比例10∶1加入L-929细胞，参照文献[5]检测膜结合型蛋白对靶细胞L-929的细胞毒活性。表达产物的Westernblot分析[6c]:收集1×106传代培养24h后的转染细胞及其培养上清(用Amicon浓缩器离心透析浓缩)，进行Westernblot分析。
, 百拇医药 2 结果
2.1 pBK-sTNFm的构建 通过RT-PCR，从人单个核细胞中扩增出的片段A，含有IL-2和5′端添加的酶切位点及3′端连接的sTNF-α重叠序列，大小应为84bp，与电泳结果相符(图2)。片段B的电泳位置接近于515bp，与预计的长度(504bp)一致(图3)。以片段A和B为模板，进行SOE-PCR扩增sTNFm并构建pBK-sTNFm。酶切(图3)及测序分析(图1)证明，已成功地构建了s-TNF-α的真核表达质粒。
图2 片段A基因扩增产物的(20g/L琼脂糖凝胶)电泳
Fig2 20g/L agarose gel electrophoresis of the PCR
amplified products of fragment A gene
, 百拇医药
1:PCR marker(SABC);2,3:PCR producs of fragment
A gene(84bp);4:PGEM marker(Promega).
图3 重组质粒pBK-sTNFm的酶切鉴定
Fig3 Identification of recombinant plasmid pBK-sTNFm by
restriction endonuclease digestion
1:PCR marker(SABC);2:PCR producs of fragment Bgene(504bp);3:PCR products by using pBK-mTNF as the template(551bp);4:pBK-sTNF/BamHI+Hind Ⅲ(544bp,4494bp);5:(DNA/EcoR I+Hind Ⅲ(SABC).
, 百拇医药
2.2 单纯分泌型TNF-α基因真核表达细胞株的建立 通过检测转染细胞阳性克隆的L-929细胞毒活性，筛选出活性较高的阳性克隆细胞各1株，分别命名为H-mTNF-α和H-sTNF-αm(图4)，并进行Westernblot分析(图5)。结果表明，①H-mTNF-α的培养上清可检出Mr17000的TNF-α，而裂解液可同时检出两种类型的TNF-α，且其固定细胞及培养上清均具有细胞毒效应；②H-sTNFm的细胞裂解液及培养上清均只可检出Mr17000的TNF-α，但只上清有细胞毒活性，细胞固定后其活性丧失，表明H-sTNF-α无mTNF-α活性而只具有sTNF-α活性。上述细胞毒效应均可被抗hTNF-αmAb所阻断(图4)。
图4 转染TNF-α重组体的NIH3T3细胞对L929细胞的杀伤效应
Fig4 Cytotoxic effect of TNF-α recombinants transfected NIH3T3 cells on L929 cell line
, 百拇医药
图5 TNF-α重组体转染细胞表达产物的Westernblot分析
Fig5 Western blot analysis of cell lysates and supernatants
der-ived from the NIH3T3 cells transfected with TNF-αgene recombinant
M:Protein Mr marker;1,3,5:Cell lysates;2,4,6:Cell supernatants;1,2:Vector control;3,4:H-sTNFm;5,6:H-mTNF-α.
3 讨论
TNF-α在体内以膜结合型(Mr为26000)和分泌型(Mr为17000)两种形式存在。两者虽都可介导广泛的生物学效应，但在受体结合、信号转导、介导的生物学效应，以及其作用机制等方面存在着的差异[1-5]。膜结合型分子主要在局部通过细胞间接触发挥作用；而分泌型分子除可通过自分泌和旁分泌在局部起作用外，还可通过内分泌作用于全身。由于两型TNF-α的同时存在，影响了对它们各自作用特点和生物学意义的研究及区分。为此，我们设计了用置换的办法构建sTNF-α，使之与其它分泌型蛋白一样分泌至细胞外,而勿需先表达跨膜蛋白,再酶切成分泌型分子。
, http://www.100md.com
大多数分泌型蛋白(如IL-2)在细胞内合成与分泌的过程中，常需依赖信号肽的参与，信号肽在完成其作用后，即被信号肽酶水解去除。研究表明，虽然不同分泌型蛋白的氨基酸序列存在很大差异，但其信号肽可互换，而并不影响其正确的分选信号功能，这是因为其信号肽序列在结构、功能及切割点上具有一定的相似性[6d]。由于TNF-α的分泌机制迥异于一般分泌型蛋白，须经过跨膜-酶切转换。为去除跨膜型TNF-α，得到单纯分泌型TNF-α，本研究通过突变方式将典型分泌型蛋白IL-2的信号肽置换掉TNF-α的前导序列，重构出sTNFm。通过表达实验证明，转染该重组体的真核细胞NIH3T3仅其上清具有胞毒活性，而其固定细胞则无胞毒活性，提示该种细胞仅表达分泌型TNF-α，为下一阶段研究比较两型TNF-α的生物学效应及其作用机制提供了体内外实验模型。
TNF-α属II型膜蛋白，系TNF配体家族的重要成员[1]。TNF配体家族成员(LT-α除外)和许多其他细胞表面蛋白及一些生长因子、细胞因子受体都可被酶解脱落其胞外部分，即存在着跨膜型分子和分泌型分子[9]。这种“脱落”(shedding)方式不仅在真核细胞中具有普遍性，而且细胞可以此来改变其对周围环境的反应性并释放可溶性的活性调节因子，故具有重要的生物学意义[10]。本研究为此提供了一种研究手段。
, 百拇医药
基金项目：国家自然科学基金资助项目，No.39270314
作者简介：黄家强，男，33岁，博士后.
现通讯地址：北京市学院路北京医科大学免疫系分子免疫室
Tel.(010)62091417；Email:hjq65@hotmail.com
参考文献:
[1] Bazzoni F, Beutler B. The tumor necrosis factor ligand and receptor families[J]. New Engl J Med, 1996; 334(26): 1717- 1725.
[2] Kriegler M, Perez C, DeFay K, et al. Novel form of TNF/cachectin is a cell surface cytotoxic transmembrane protein: ramifications for the complex physiology of TNF[J]. Cell, 1988;53:45- 53.
, 百拇医药
[3] Perez C, Albewt L, DeFay K, et al. A nonsecretable cell surface mutant of tumor necrosis factor(TNF), kill by cell-to-cell contact[J]. Cell, 1990;63:251- 258.
[4] Black RA, Rauch CT, Kozlsky CJ, et al. A metalloproteinase disintegrin that releases tumor-necrosis factor-α from cells[J]. Nature, 1997; 385:729- 733.
[5] Fishman M.Cytotoxic activities macrophages versus paraformldehyde-fixed macrophages; Soluble versus membrane-associated TNF[J]. Cell Immunol, 1991;137:164- 174.
, 百拇医药
[6]卢圣栋主编.现代分子生物学技术[M].北京:高等教育出版社,1993:241-297(a),399-401(b),403-406(c),376-377.
[7] Horton RM, Hunt HD, Ho SN, et al. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes:gene splicing by overlap extension[J]. Gene, 1989; 77:61- 68.
[8]李卓娅,GemsaD,冯新为.秋水仙碱对巨噬细胞分泌TNFα的影响[J].中国免疫学杂志,1995;11(2):70-73.
[9] Rose-John S, Heinrichpc PC. Soluble receptors for cytokines and growth factors: generation and biological function[J]. Biochem J, 1994; 300:281- 286.
[10]Mullberg J, Durie FH, Evans CO, et al. A metalloprotease inhibitor blocks shedding of the IL-6 receptor and the p60 TNF receptor[J]. J Immunol, 1995;155: 5198 5205.
收稿日期：1999-02-04
修回日期：1999-03-05, 百拇医药
单位：黄家强(同济医科大学免疫学教研室,湖北武汉430030)；卜夏(同济医科大学免疫学教研室,湖北武汉430030)；史须(同济医科大学免疫学教研室,湖北武汉430030)；李卓娅(同济医科大学免疫学教研室,湖北武汉430030)；龚非力(同济医科大学免疫学教研室,湖北武汉430030)
关键词：分泌型TNF-α；膜型TNF-α；信号肽；基因表达
细胞与分子免疫学杂志000102
摘要：目的揭示膜结合的TNF-α前体(mTNF-α)与分泌型TNF-α(sTNF-α)生物学活性的不同。方法在克隆出mTNF-α基因的基础上,我们采用IL-2信号肽编码序列置换m-TNF-α前导肽编码序列,构建出只产生分泌型TNF-α的真核表达质粒pBK-sTNFm,并转染至NIH3T3细胞中。结果筛选出的阳性克隆细胞经Westernblot分析及活性测定显示,pBK-sTNFm转染细胞裂解液及培养上清，均可检出相对分子质量(Mr)17000的TNF-α,且上清具有sTNF-α活性,但细胞固定后其活性丧失。结论成功地构建了在真核细胞中只产生sTNF-α的表达质粒,并建立相应的表达细胞株。为比较两种类型的TNF-α的生物学活性及其作用机制奠定了基础。
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中图号:Q78 文献标识码：A
文章编号:1007-8738(2000)01-0006-09
Construction of eukaryotic expression vector and establishment of cell line solely producing human TNF-α in secretory form
HUANG Jia-qiang,BU Xia, SHI Xu, LI Zhuo-ya, GONG Fei-li
Department of Immunology, Tongji Medical University, Wuhan 430030, Hubei Province, China
Abstract: Aim To reveal the differences between membrame-bound TNF-α precusor(mTNF-α ) and secretory TNF-α (sTNF-α)in the bioactivities. Methods A recombinant TNF with only secretory form(pBK-sTNFm) was constructed in which the leader sequence of TNF-α was replaced by the DNA sequence coding the human IL-2 signal peptide and then transfected into NIH3T3 cells. Results G418-resistant colonies and their expression products were identified by bioassay and Western blot. TNF with Mr 17 000 could be demonstrated both in cell lysate and culture supernatants of the pBK-sTNFm transfected cells and only the supernatant displayed cytotoxicity. Conclusion A cell line only producing sTNF-α is successfully established, which also provides the basis for studying the biologic activity and its mechanism.
, http://www.100md.com
Keywords:secretory TNF; membrane- bound TNF;signal peptide; gene transfer
TNF-α是一多效性细胞因子[1]。现已知,由233个氨基酸组成的TNF-α与典型的分泌型蛋白的合成及分泌机制不同[2,3]。TNF-αN端的含有由76个氨基酸组成的超常前导肽，在内质网中不被切除，而是首先通过其疏水氨基酸区将TNF-α前体“锚定”于胞膜表面,形成Mr为26000的膜结合型TNF-α(mTNF-α),进而通过TNF-α转换酶(TNF-α-converting enzyme,TACE)[4]裂解，产生由157个氨基酸组成的Mr17000的分泌型TNF(sTNF)，故TNF-α在体内可有两种形式存在。研究表明，两型TNF-α在生物学效应及其作用机制等方面各具特征[2-5]。为了能更好地分别研究两型TNF-α，我们构建了在真核细胞中只产生S-TNF-α的表达质粒，并建立相应的表达细胞株。
1材料和方法
, 百拇医药
1.1 材料 大肠杆菌XLI-BlueMEF和穿梭载体pBK-CMV，由翦必希博士惠赠。细胞株NIH3T3购自武汉大学中国典型物保藏中心;L929为本室保存。TRIzol试剂、Superscript逆转录试剂、T4DNA连接酶、限制性内切酶、G418、RPMI-1640和DMEM细胞培养基、小牛血清(Gibco)；质粒提取纯化试剂盒、DOTAP转染试剂(Boehringer Mannhe-in，BRM)；四甲基偶氮唑盐(MTT，Fluka)；抗hTNF-αmAbT4(北京邦定公司)。其它生化试剂均为进口或国产分析纯。
1.2 方法
1.2.1 M-TNFcDNA(mTNF)的克隆及测序〔6a〕 以LPS(100μg/L)刺激人外周血单核细胞4h后，提取总RNA，并逆转录合成cDNA第1条链。以此链为模板，进行PCR扩增mTNF-α，反应条件为:94℃ 1 min，64℃ 1 min，再72℃ 1 min，循环28次；再72℃ 10 min。PCR产物经沉淀、BamHI/HindIII双酶切、低溶点琼脂糖凝胶电泳回收纯化，再与相应酶切后的质粒pBK-CMV定向连接。经转化、筛选及鉴定后，命名为pBK-mTNF。用双脱氧核苷酸末端终止法，对插入片段用373A型DNA荧光测序仪(ABI公司)进行自动测序分析。
, 百拇医药
图1sTNFm的构建与序列分析
Fig 1 Construction and sequence analysis of sTNFm
1.2.2 单纯分泌型TNF-α基因(sTNFm)的构建及测序 采用基因重叠延伸拼接PCR法(gene splicing by overlapping extensionPCR，SOE-PCR)[7](图1)。提取ConA(20mg/L)刺激24h后的人外周血单个核细胞总RNA，以逆转录合成cDNA第1条链为模板。sTNFm扩增引物由一对外侧引物(P3和P2)和一对内重叠连接引物(P4和P5)组成。首先用P3和P4扩增基因片段A，PCR反应条件为：94℃30s，60℃50s，72℃30s，循环28次；再72℃5min。以测序验证后的pBK-mTNF为模板，以P5和P2扩增基因片段B，反应条件为:94℃4min，94℃1min，62℃1min，72℃1min，循环28次；再72℃10min。片段A，B经电泳回收纯化后，各取1μg混合作为模板，以上述一对外侧引物P3和P2进行PCR扩增，反应条件为:94℃1min，50℃2min，72℃3min，共25个循环。电泳回收纯化的PCR产物，按上述方法构建出sTNFm的真核表达质粒，命名为pBK-sTNFm并测序。
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1.2.3 细胞转染及筛选〔6b] 用DOTAP试剂将pBK-mTNF、pBK-sTNFm及其对照pBK-CMV转入NIH3T3细胞，继续培养48h后，分别取部分细胞培养于8孔玻片(BRM)进行间接免疫荧光检测。其余细胞按1×105个/孔接种于24孔培养板内，加选择培养基。3wk后选择培养基逐渐减量，4wk后减至一半，并用有限稀释法对阳性克隆进行亚克隆。
1.2.4 克隆细胞株表达产物的鉴定 表达产物生物活性的检测与筛选:采用MTT法。收集1×106转染细胞培养上清，检测上清(分泌型蛋白)对靶细胞L-929的细胞毒活性[8]。转染细胞用10mL/L多聚甲醛固定10min，PBS洗3次，按效：靶比例10∶1加入L-929细胞，参照文献[5]检测膜结合型蛋白对靶细胞L-929的细胞毒活性。表达产物的Westernblot分析[6c]:收集1×106传代培养24h后的转染细胞及其培养上清(用Amicon浓缩器离心透析浓缩)，进行Westernblot分析。
, 百拇医药 2 结果
2.1 pBK-sTNFm的构建 通过RT-PCR，从人单个核细胞中扩增出的片段A，含有IL-2和5′端添加的酶切位点及3′端连接的sTNF-α重叠序列，大小应为84bp，与电泳结果相符(图2)。片段B的电泳位置接近于515bp，与预计的长度(504bp)一致(图3)。以片段A和B为模板，进行SOE-PCR扩增sTNFm并构建pBK-sTNFm。酶切(图3)及测序分析(图1)证明，已成功地构建了s-TNF-α的真核表达质粒。
图2 片段A基因扩增产物的(20g/L琼脂糖凝胶)电泳
Fig2 20g/L agarose gel electrophoresis of the PCR
amplified products of fragment A gene
, 百拇医药
1:PCR marker(SABC);2,3:PCR producs of fragment
A gene(84bp);4:PGEM marker(Promega).
图3 重组质粒pBK-sTNFm的酶切鉴定
Fig3 Identification of recombinant plasmid pBK-sTNFm by
restriction endonuclease digestion
1:PCR marker(SABC);2:PCR producs of fragment Bgene(504bp);3:PCR products by using pBK-mTNF as the template(551bp);4:pBK-sTNF/BamHI+Hind Ⅲ(544bp,4494bp);5:(DNA/EcoR I+Hind Ⅲ(SABC).
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2.2 单纯分泌型TNF-α基因真核表达细胞株的建立 通过检测转染细胞阳性克隆的L-929细胞毒活性，筛选出活性较高的阳性克隆细胞各1株，分别命名为H-mTNF-α和H-sTNF-αm(图4)，并进行Westernblot分析(图5)。结果表明，①H-mTNF-α的培养上清可检出Mr17000的TNF-α，而裂解液可同时检出两种类型的TNF-α，且其固定细胞及培养上清均具有细胞毒效应；②H-sTNFm的细胞裂解液及培养上清均只可检出Mr17000的TNF-α，但只上清有细胞毒活性，细胞固定后其活性丧失，表明H-sTNF-α无mTNF-α活性而只具有sTNF-α活性。上述细胞毒效应均可被抗hTNF-αmAb所阻断(图4)。
图4 转染TNF-α重组体的NIH3T3细胞对L929细胞的杀伤效应
Fig4 Cytotoxic effect of TNF-α recombinants transfected NIH3T3 cells on L929 cell line
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图5 TNF-α重组体转染细胞表达产物的Westernblot分析
Fig5 Western blot analysis of cell lysates and supernatants
der-ived from the NIH3T3 cells transfected with TNF-αgene recombinant
M:Protein Mr marker;1,3,5:Cell lysates;2,4,6:Cell supernatants;1,2:Vector control;3,4:H-sTNFm;5,6:H-mTNF-α.
3 讨论
TNF-α在体内以膜结合型(Mr为26000)和分泌型(Mr为17000)两种形式存在。两者虽都可介导广泛的生物学效应，但在受体结合、信号转导、介导的生物学效应，以及其作用机制等方面存在着的差异[1-5]。膜结合型分子主要在局部通过细胞间接触发挥作用；而分泌型分子除可通过自分泌和旁分泌在局部起作用外，还可通过内分泌作用于全身。由于两型TNF-α的同时存在，影响了对它们各自作用特点和生物学意义的研究及区分。为此，我们设计了用置换的办法构建sTNF-α，使之与其它分泌型蛋白一样分泌至细胞外,而勿需先表达跨膜蛋白,再酶切成分泌型分子。
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大多数分泌型蛋白(如IL-2)在细胞内合成与分泌的过程中，常需依赖信号肽的参与，信号肽在完成其作用后，即被信号肽酶水解去除。研究表明，虽然不同分泌型蛋白的氨基酸序列存在很大差异，但其信号肽可互换，而并不影响其正确的分选信号功能，这是因为其信号肽序列在结构、功能及切割点上具有一定的相似性[6d]。由于TNF-α的分泌机制迥异于一般分泌型蛋白，须经过跨膜-酶切转换。为去除跨膜型TNF-α，得到单纯分泌型TNF-α，本研究通过突变方式将典型分泌型蛋白IL-2的信号肽置换掉TNF-α的前导序列，重构出sTNFm。通过表达实验证明，转染该重组体的真核细胞NIH3T3仅其上清具有胞毒活性，而其固定细胞则无胞毒活性，提示该种细胞仅表达分泌型TNF-α，为下一阶段研究比较两型TNF-α的生物学效应及其作用机制提供了体内外实验模型。
TNF-α属II型膜蛋白，系TNF配体家族的重要成员[1]。TNF配体家族成员(LT-α除外)和许多其他细胞表面蛋白及一些生长因子、细胞因子受体都可被酶解脱落其胞外部分，即存在着跨膜型分子和分泌型分子[9]。这种“脱落”(shedding)方式不仅在真核细胞中具有普遍性，而且细胞可以此来改变其对周围环境的反应性并释放可溶性的活性调节因子，故具有重要的生物学意义[10]。本研究为此提供了一种研究手段。
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基金项目：国家自然科学基金资助项目，No.39270314
作者简介：黄家强，男，33岁，博士后.
现通讯地址：北京市学院路北京医科大学免疫系分子免疫室
Tel.(010)62091417；Email:hjq65@hotmail.com
参考文献:
[1] Bazzoni F, Beutler B. The tumor necrosis factor ligand and receptor families[J]. New Engl J Med, 1996; 334(26): 1717- 1725.
[2] Kriegler M, Perez C, DeFay K, et al. Novel form of TNF/cachectin is a cell surface cytotoxic transmembrane protein: ramifications for the complex physiology of TNF[J]. Cell, 1988;53:45- 53.
, 百拇医药
[3] Perez C, Albewt L, DeFay K, et al. A nonsecretable cell surface mutant of tumor necrosis factor(TNF), kill by cell-to-cell contact[J]. Cell, 1990;63:251- 258.
[4] Black RA, Rauch CT, Kozlsky CJ, et al. A metalloproteinase disintegrin that releases tumor-necrosis factor-α from cells[J]. Nature, 1997; 385:729- 733.
[5] Fishman M.Cytotoxic activities macrophages versus paraformldehyde-fixed macrophages; Soluble versus membrane-associated TNF[J]. Cell Immunol, 1991;137:164- 174.
, 百拇医药
[6]卢圣栋主编.现代分子生物学技术[M].北京:高等教育出版社,1993:241-297(a),399-401(b),403-406(c),376-377.
[7] Horton RM, Hunt HD, Ho SN, et al. Engineering hybrid genes without the use of restriction enzymes:gene splicing by overlap extension[J]. Gene, 1989; 77:61- 68.
[8]李卓娅,GemsaD,冯新为.秋水仙碱对巨噬细胞分泌TNFα的影响[J].中国免疫学杂志,1995;11(2):70-73.
[9] Rose-John S, Heinrichpc PC. Soluble receptors for cytokines and growth factors: generation and biological function[J]. Biochem J, 1994; 300:281- 286.
[10]Mullberg J, Durie FH, Evans CO, et al. A metalloprotease inhibitor blocks shedding of the IL-6 receptor and the p60 TNF receptor[J]. J Immunol, 1995;155: 5198 5205.
收稿日期：1999-02-04
修回日期：1999-03-05, 百拇医药