肝脏靶向性基因转移的研究进展
http://www.100md.com
中华肝胆外科杂志
1999年第5卷第1期No.1Vol.5 1999
肝脏靶向性基因转移的研究进展
杨连粤 杨建青
关键词：靶向性转基因技术 肝脏
随着DNA重组技术和转基因方法的不断完善，基因治疗研究发展迅猛，并在某些疾病的治疗中取得了令人鼓舞的疗效。肝脏是人体重要的代谢器官，与人类许多遗传性、代谢性、感染性疾病及肿瘤密切相关。而且肝脏体积大，能分泌大量蛋白入血和完成某些特定基因产物活性所必需的翻译后修饰。因此，以肝脏为直接靶器官或作为生物效应靶器官的基因治疗更是倍受关注，一直是临床基因治疗研究领域的一大热点。肝脏基因治疗方法在有些疾病如家族性高胆固醇血症、血友病等的治疗中已取得了肯定的疗效〔1，2〕。尽管如此，但现今仍有很多限制其应用的因素。其中最主要的就是目前缺乏能使目的基因表达只局限在肝脏的转基因方法和途径。而且这又恰是肝脏基因治疗有效和安全的保障。因此，肝脏靶向性转基因近年来越来越受到研究者们的重视，并开展了大量的工作。本文现就这一方面研究所取得的进展及存在的问题作一扼要综述。
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一、受体介导的肝脏靶向性转基因
肝细胞表面有很丰富的蛋白受体，将目的DNA和其相应的配体构成复合物，借助受体与配体特异性结合介导的细胞内吞能使DNA有效地导入肝细胞。目前常用的蛋白配体有去唾液酸糖蛋白、转铁蛋白和单克隆抗体等。这些配体需进行修饰如和多聚赖氨酸结合使其带上正电荷，才能和带负电荷的DNA组成紧密的复合物。很多体内外实验证明利用该复合物确能有效实施靶向性转基因。Wanger等〔3〕依据这一原理构建了一个由转铁蛋白、多聚阳离子(多聚赖氨酸和鱼精蛋白)及含有荧光素酶基因的质粒DNA组成的复合物，将该复合物和处于分化状态的鸡成红细胞一起孵育，过后对其提取液进行检测，发现有很高的荧光素酶基因表达。Wu等〔4〕用去唾液酸糖蛋白、多聚赖氨酸和包含人血清白蛋白结构基因(由鼠白蛋白启动子原件调控)的质粒DNA组成复合物，并将该复合物经尾静脉注入一组先天性缺乏白蛋白的鼠体内，15分钟后切除鼠66%肝脏以刺激肝细胞复制再生。实验结果表明，复合物注射后24小时内血清中测不到人白蛋白，但过后其浓度逐渐增加，48小时其水平为0.05μg/ml，二周时浓度达到最大值34μg/ml，这一水平一直稳定维持到第四周。但现今仍存在某些制约其发展的问题，包括由于复合物体积大而限制了外源DNA的长度，导入的DNA大部分在细胞内很快被溶酶体降解，因此外源基因表达时间极短等。为了克服这些缺陷，Ledley等〔5〕选用和DNA有天然亲和力的配体Lactoferrin，此配体无需改造就可和DNA紧密结合，这就使得DNA复合物体积缩小，不仅可增加导入的DNA长度，还可降低复合物的抗原性。Lactoferrin/DNA和Asisalolactoferrin/DNA复合物的体外实验结果表明，它们能很有效地把外源基因导入肝细胞。病毒具有进入宿主细胞后能破坏溶酶体的特性，将DNA复合物和复制缺陷型病毒同时使用，或将其和病毒或它的某些破膜蛋白连接起来应用〔6，7〕，可克服单纯复合物导入后DNA在细胞内的不稳定性，使外源基因的表达明显增加，目前该方法正在进一步完善之中。
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二、AFP启动子用于肝癌的靶向性转基因
理想的肿瘤基因治疗方法应能做到特异性地导入自杀基因至肝癌细胞，而正常组织或细胞不受任何影响。胸苷激酶(TK)基因为最常用的一种自杀基因，它通常参与细胞S期进展的调控，促进前体核苷酸整合入DNA。另外，TK亦能将核苷如药物ganiclovir (GCV)转化成有毒的二磷酸形式，当后者整合入细胞DNA可致DNA链合成终止和细胞死亡。以往使用普通的病毒(如单纯疱疹病毒或巨细胞病毒)启动子来调控TK基因，就很有可能使多种正常细胞表达该基因，当给予GCV治疗后就可导致它们遭受毒性损害。为了减少这种风险，可选择一种使TK基因只在肝癌细胞中表达的启动子。大多数肝癌患者AFP水平都有升高，而且这种表达增高是由AFP基因的5’-旁侧序列(5’-flanking sequence)在转录水平上调控的。Kaneko等〔8〕用该旁侧序列作为调控TK基因的启动子，构建重组腺病毒载体AV1 AFP TK用以转染产生和不产生AFP的两株肝癌细胞(HuH7、SK-Hep-1)，只有产生AFP的HuH7细胞有TK活性，GCV处理后出现死亡。而用Rous肉瘤病毒启动子代替AFP启动子构建的病毒载体进行相同实验，则两株细胞均有TK活性，并且都能被GCV杀死。可见使用由AFP启动子调控TK基因的腺病毒载体，可达到靶向性转基因的目的。后来Kanai等〔9〕在体外实验中进一步证实使用Ad AFP TK重组腺病毒载体能有效地使TK基因特异性地导入产生AFP的肝癌细胞中，并发现只要有占总体10%的细胞感染重组病毒，给予GCV处理后可引起80%的细胞发生毒性损伤，这种现象被称为“旁观者效应”(bystander effect)，机理可能为GCV产物渗漏至邻近肿瘤细胞或使肿瘤抗原暴露而激活了宿主的免疫反应所致。但上述方法用于人体基因仍有很多需解决的问题，包括如何使正常胚干细胞(如精细胞、卵细胞等)逃逸自杀基因的损害及怎样才能清除每一个肝癌细胞以达根治等。
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三、病毒载体介导的靶向性转基因
重组缺陷型病毒载体在人体基因治疗中的应用日益受到重视，和以往的转基因方法相比，具有明显的高效、稳定等优势。目前除了发现重组腺病毒Ⅴ型(AdⅤ)有一定的亲肝细胞性以外，尚未见其它病毒包括逆转录病毒、腺病毒及腺病毒相关病毒等有肝组织特异性。许多研究者为了使病毒具有组织特异性，对病毒进行了些改造尝试。Neda等〔10〕将乳糖连接在一嗜啮齿类、复制缺陷型白血病病毒上，该病毒原先只能感染啮齿类细胞，经改造后可特异性地感染具有去唾液酸糖蛋白受体的人肝细胞。Richard等〔11〕发现DNA-蛋白复合物与复制缺陷型腺病毒的结合不仅能克服单纯DNA-蛋白复合物易被溶酶体降解的缺点，使转基因效率增加，而且可减少所用病毒颗粒的数量，避免因病毒数目过大导致的肝脏损害，并获得肝细胞特异性。肝炎病毒为天然的嗜肝细胞载体，研究者正在努力对其进行改良，但结果不尽人意。阻碍肝炎病毒载体开发利用的两大主要障碍是：1.缺乏合适的病毒颗粒体扩增方法；2.病毒基因组对其基因结构的改变极其敏感，故很难对其实施基因重组。
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四、脂质体用于靶向性转基因
脂质体可用来包裹DNA，肝内、门静脉或外周静脉内注射含有质粒表达载体的脂质体可致肝组织内多种外源基因表达。脂质体复合物构成方式和成分的不同与转基因效率及特异性密切相关。普通构成的脂质体易被枯否和内皮细胞吞噬，以致肝细胞内重组基因的表达有限。Kaneda等〔12〕将脂质体和神经节苷脂相连，内装上人胰岛素基因，然后和日本凝血病毒(HVJ)及分别包含染色体非组蛋白高移动组-1(HGM-1)与牛血清白蛋白(BSA)的红细胞膜一同孵育，形成一囊状复合物。将该复合物经门静脉注入鼠肝后发现，和HGM-1一起导入的胰岛素基因同BSA一起导入的基因比较，能更有效地转入肝细胞核，且而胰岛素基因转录水平前者高于后者10倍以上。其原因可能是HGM-1为一种核蛋白，能更有效地将质粒DAN转入核内，并提高它的表达。但实验结果亦表明使用该方法导入的外源基因表达时间很短，7～8天后迅速下降。Kato等〔13〕通过搅拌和声处理把β-半乳糖苷酶基因和HMG-1蛋白同时包裹在HVJ-脂质体复合物中。该复合物在体内外转基因实验中均表明HMG-1能有效地提高脂质体导入外源基因的效率，使其表达增加。研究者亦发现含有卵磷脂或酰基鞘氨醇乳糖苷的脂质体复合物可与肝细胞表面去唾液酸糖蛋白受体发生作用，并被肝细胞特异性地内吞〔14〕。
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五、前景与展望
靶向性转基因技术和方法是人体基因治疗成功的前提和保障，特别对于肿瘤的基因治疗更是十分重要。目前这方面的研究日益受到重视，并取得了许多进展。但至今尚未找到一种较完善的方法或途径，许多方面都有待于进一步改进和完善。但随着工作的逐渐深入和分子生物学理论技术的不断进步，相信在不久的将来，人体肝脏靶向性转基因这一目标是完全可以实现的，从而开创一个肝脏靶向性基因治疗的新时代。
作者单位：杨连粤 杨建青(410078 长沙，湖南医科大学湘雅医院普外科)
参考文献
[1]Wilson JM, Grossman M, Raper SE, et al. Ex vivo gene therapy of familial hypercholesterolemia. Hum Gene Ther, 1992, 3: 179-222.
, 百拇医药
[2]薛京伦，卢大儒，周洁民，等.成纤维细胞基因治疗血友病B的临床Ⅰ期试验.中国科学B辑，1993，23：53.
[3]Wanger E, Zenke M, Cotten M, et al. Transferrin-polycation conjugates as carriers for DNA uptake into cells. Proc Natl Acad Sci USA, 1990, 87: 3410-3414.
[4]Wu GY, Wilson JM, Shalaby F, et al. Receptor-mediated gene dilvery in vivo: partial corrction of genetic analbuminemia in Negase rats. J Biol Chem, 1991, 266: 14338-14342.
[5]Ledley FD. Hepatic gene theraphy: recent and future. Hepatology, 1993, 18: 1263-1273.
, 百拇医药
[6]Cristiano RJ, Smith LC, Kay MA, et al. Hepatic gene therapy: efficient gene delivery and exprssion in primary hepatocytes utilizing a conjugated adenovirus-DNA complex. Proc Natl Acad Sci USA, 1993, 90: 11548-11552.
[7]Plank C, Oberhauser B, Mechtler K, et al. The influence of endosome-disruptive peptides on gene transfer using synthetic virus-like gne transfer system. J Biol Chem, 1994, 269: 12918-12924.
[8]Knneko S, Hallenbeck P, Kotani T, et al. Adenovirus-mediated gene therapy of hepatocellular carcinoma using cancer-specific gene expression. Cancer Res, 1995, 5: 5283-5287.
, 百拇医药
[9]Kanai F, Shiratori Y, Yoshida Y, et al. Gene therapy for α-fetoprotein-producing human hepatoma cells by adenovirus-mediated transfer of the herpes simplex virus thymidine kinase gene. Hepatology, 1996, 23:1359-1368.
[10]Nada H, Wu CH, Wu GY. Chemical modification of an ecotropic murine leukemia virus results in redirection of its target cell specificity. J Biol Chem, 1991, 266:14143-14146.
[11]Cristiano RJ, Smith LC, Woo SL. Hepatic gene therapy: adenovirus enhancement of receptormediated gene delivery and expression in primary hepatocytes. Proc Natl Acad Sci USA, 1993, 90: 2122-2126.
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[12]Kaneda Y, Iwai K, Uchida T. Intrduction and expression of the human insulin gene in adult rat liver. J Biol Chem, 1989, 64: 12126-12129.
[13]Kato K, Nakanishi M, Kaneda Y, et al. Expression of hepatitis B virus surface antigen in adult rat liver: cointrduction of DNA and nuclear protein by a simplified liposome method. J Biol Chem, 1991, 266:3361-3364.
[14]Nandi PK, Legrand A, Nicoau C. Biologically active, recombinant DNA in clathrin-coated vesicles isolated from rat livers after in vivo injection of liposome-encapsulated DNA. J Biol Chem, 1986, 261: 16722-16726.
(收稿：1998-05-12), http://www.100md.com
肝脏靶向性基因转移的研究进展
杨连粤 杨建青
关键词：靶向性转基因技术 肝脏
随着DNA重组技术和转基因方法的不断完善，基因治疗研究发展迅猛，并在某些疾病的治疗中取得了令人鼓舞的疗效。肝脏是人体重要的代谢器官，与人类许多遗传性、代谢性、感染性疾病及肿瘤密切相关。而且肝脏体积大，能分泌大量蛋白入血和完成某些特定基因产物活性所必需的翻译后修饰。因此，以肝脏为直接靶器官或作为生物效应靶器官的基因治疗更是倍受关注，一直是临床基因治疗研究领域的一大热点。肝脏基因治疗方法在有些疾病如家族性高胆固醇血症、血友病等的治疗中已取得了肯定的疗效〔1，2〕。尽管如此，但现今仍有很多限制其应用的因素。其中最主要的就是目前缺乏能使目的基因表达只局限在肝脏的转基因方法和途径。而且这又恰是肝脏基因治疗有效和安全的保障。因此，肝脏靶向性转基因近年来越来越受到研究者们的重视，并开展了大量的工作。本文现就这一方面研究所取得的进展及存在的问题作一扼要综述。
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一、受体介导的肝脏靶向性转基因
肝细胞表面有很丰富的蛋白受体，将目的DNA和其相应的配体构成复合物，借助受体与配体特异性结合介导的细胞内吞能使DNA有效地导入肝细胞。目前常用的蛋白配体有去唾液酸糖蛋白、转铁蛋白和单克隆抗体等。这些配体需进行修饰如和多聚赖氨酸结合使其带上正电荷，才能和带负电荷的DNA组成紧密的复合物。很多体内外实验证明利用该复合物确能有效实施靶向性转基因。Wanger等〔3〕依据这一原理构建了一个由转铁蛋白、多聚阳离子(多聚赖氨酸和鱼精蛋白)及含有荧光素酶基因的质粒DNA组成的复合物，将该复合物和处于分化状态的鸡成红细胞一起孵育，过后对其提取液进行检测，发现有很高的荧光素酶基因表达。Wu等〔4〕用去唾液酸糖蛋白、多聚赖氨酸和包含人血清白蛋白结构基因(由鼠白蛋白启动子原件调控)的质粒DNA组成复合物，并将该复合物经尾静脉注入一组先天性缺乏白蛋白的鼠体内，15分钟后切除鼠66%肝脏以刺激肝细胞复制再生。实验结果表明，复合物注射后24小时内血清中测不到人白蛋白，但过后其浓度逐渐增加，48小时其水平为0.05μg/ml，二周时浓度达到最大值34μg/ml，这一水平一直稳定维持到第四周。但现今仍存在某些制约其发展的问题，包括由于复合物体积大而限制了外源DNA的长度，导入的DNA大部分在细胞内很快被溶酶体降解，因此外源基因表达时间极短等。为了克服这些缺陷，Ledley等〔5〕选用和DNA有天然亲和力的配体Lactoferrin，此配体无需改造就可和DNA紧密结合，这就使得DNA复合物体积缩小，不仅可增加导入的DNA长度，还可降低复合物的抗原性。Lactoferrin/DNA和Asisalolactoferrin/DNA复合物的体外实验结果表明，它们能很有效地把外源基因导入肝细胞。病毒具有进入宿主细胞后能破坏溶酶体的特性，将DNA复合物和复制缺陷型病毒同时使用，或将其和病毒或它的某些破膜蛋白连接起来应用〔6，7〕，可克服单纯复合物导入后DNA在细胞内的不稳定性，使外源基因的表达明显增加，目前该方法正在进一步完善之中。
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二、AFP启动子用于肝癌的靶向性转基因
理想的肿瘤基因治疗方法应能做到特异性地导入自杀基因至肝癌细胞，而正常组织或细胞不受任何影响。胸苷激酶(TK)基因为最常用的一种自杀基因，它通常参与细胞S期进展的调控，促进前体核苷酸整合入DNA。另外，TK亦能将核苷如药物ganiclovir (GCV)转化成有毒的二磷酸形式，当后者整合入细胞DNA可致DNA链合成终止和细胞死亡。以往使用普通的病毒(如单纯疱疹病毒或巨细胞病毒)启动子来调控TK基因，就很有可能使多种正常细胞表达该基因，当给予GCV治疗后就可导致它们遭受毒性损害。为了减少这种风险，可选择一种使TK基因只在肝癌细胞中表达的启动子。大多数肝癌患者AFP水平都有升高，而且这种表达增高是由AFP基因的5’-旁侧序列(5’-flanking sequence)在转录水平上调控的。Kaneko等〔8〕用该旁侧序列作为调控TK基因的启动子，构建重组腺病毒载体AV1 AFP TK用以转染产生和不产生AFP的两株肝癌细胞(HuH7、SK-Hep-1)，只有产生AFP的HuH7细胞有TK活性，GCV处理后出现死亡。而用Rous肉瘤病毒启动子代替AFP启动子构建的病毒载体进行相同实验，则两株细胞均有TK活性，并且都能被GCV杀死。可见使用由AFP启动子调控TK基因的腺病毒载体，可达到靶向性转基因的目的。后来Kanai等〔9〕在体外实验中进一步证实使用Ad AFP TK重组腺病毒载体能有效地使TK基因特异性地导入产生AFP的肝癌细胞中，并发现只要有占总体10%的细胞感染重组病毒，给予GCV处理后可引起80%的细胞发生毒性损伤，这种现象被称为“旁观者效应”(bystander effect)，机理可能为GCV产物渗漏至邻近肿瘤细胞或使肿瘤抗原暴露而激活了宿主的免疫反应所致。但上述方法用于人体基因仍有很多需解决的问题，包括如何使正常胚干细胞(如精细胞、卵细胞等)逃逸自杀基因的损害及怎样才能清除每一个肝癌细胞以达根治等。
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三、病毒载体介导的靶向性转基因
重组缺陷型病毒载体在人体基因治疗中的应用日益受到重视，和以往的转基因方法相比，具有明显的高效、稳定等优势。目前除了发现重组腺病毒Ⅴ型(AdⅤ)有一定的亲肝细胞性以外，尚未见其它病毒包括逆转录病毒、腺病毒及腺病毒相关病毒等有肝组织特异性。许多研究者为了使病毒具有组织特异性，对病毒进行了些改造尝试。Neda等〔10〕将乳糖连接在一嗜啮齿类、复制缺陷型白血病病毒上，该病毒原先只能感染啮齿类细胞，经改造后可特异性地感染具有去唾液酸糖蛋白受体的人肝细胞。Richard等〔11〕发现DNA-蛋白复合物与复制缺陷型腺病毒的结合不仅能克服单纯DNA-蛋白复合物易被溶酶体降解的缺点，使转基因效率增加，而且可减少所用病毒颗粒的数量，避免因病毒数目过大导致的肝脏损害，并获得肝细胞特异性。肝炎病毒为天然的嗜肝细胞载体，研究者正在努力对其进行改良，但结果不尽人意。阻碍肝炎病毒载体开发利用的两大主要障碍是：1.缺乏合适的病毒颗粒体扩增方法；2.病毒基因组对其基因结构的改变极其敏感，故很难对其实施基因重组。
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四、脂质体用于靶向性转基因
脂质体可用来包裹DNA，肝内、门静脉或外周静脉内注射含有质粒表达载体的脂质体可致肝组织内多种外源基因表达。脂质体复合物构成方式和成分的不同与转基因效率及特异性密切相关。普通构成的脂质体易被枯否和内皮细胞吞噬，以致肝细胞内重组基因的表达有限。Kaneda等〔12〕将脂质体和神经节苷脂相连，内装上人胰岛素基因，然后和日本凝血病毒(HVJ)及分别包含染色体非组蛋白高移动组-1(HGM-1)与牛血清白蛋白(BSA)的红细胞膜一同孵育，形成一囊状复合物。将该复合物经门静脉注入鼠肝后发现，和HGM-1一起导入的胰岛素基因同BSA一起导入的基因比较，能更有效地转入肝细胞核，且而胰岛素基因转录水平前者高于后者10倍以上。其原因可能是HGM-1为一种核蛋白，能更有效地将质粒DAN转入核内，并提高它的表达。但实验结果亦表明使用该方法导入的外源基因表达时间很短，7～8天后迅速下降。Kato等〔13〕通过搅拌和声处理把β-半乳糖苷酶基因和HMG-1蛋白同时包裹在HVJ-脂质体复合物中。该复合物在体内外转基因实验中均表明HMG-1能有效地提高脂质体导入外源基因的效率，使其表达增加。研究者亦发现含有卵磷脂或酰基鞘氨醇乳糖苷的脂质体复合物可与肝细胞表面去唾液酸糖蛋白受体发生作用，并被肝细胞特异性地内吞〔14〕。
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五、前景与展望
靶向性转基因技术和方法是人体基因治疗成功的前提和保障，特别对于肿瘤的基因治疗更是十分重要。目前这方面的研究日益受到重视，并取得了许多进展。但至今尚未找到一种较完善的方法或途径，许多方面都有待于进一步改进和完善。但随着工作的逐渐深入和分子生物学理论技术的不断进步，相信在不久的将来，人体肝脏靶向性转基因这一目标是完全可以实现的，从而开创一个肝脏靶向性基因治疗的新时代。
作者单位：杨连粤 杨建青(410078 长沙，湖南医科大学湘雅医院普外科)
参考文献
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