神经细胞迁移导向的分子机制
作者：饶毅 吴瑛
单位：美国华盛顿大学解剖和神经生物学系、儿科系及分子生物学和药理学系，中国科学院神经科学研究所，上海200031
关键词：神经元；细胞迁移；轴突导向；分子浓度梯度
生理科学进展000303 摘要 自19世纪以来的研究表明，在胚胎发育期间和出生后，包括人在内的哺乳动物神经系统的大部分神经细胞(也许是所有神经细胞)都要经过一定距离的迁移运动才能抵达它们发挥功能的部位。这些细胞如何知道往哪个方向迁移呢？我们在分子水平对这个问题进行了研究。1999年发表的结果给出这样一个答案：脑内存在导向性分子，可以指导神经细胞的迁移方向；具体的发现是，一个叫Slit的分泌性蛋白质，对神经细胞有排斥性作用，它的浓度梯度指导神经细胞迁移的方向。
学科分类号 R338
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The Molecular Mechanism of Neuronal Migration
RAO Yi WU Ying
(University of Washington, USA and Institute of Neuroscience, Chinese Academy of Sciences, Shanghai 200031)
Abstract A large amount of work since the late 1800 have shown that, during embrynoic and postnatal development, the majority, if not all, neurons in mammalian nervous system have to migrate a certain distance to reach their final destination. An interesting question is how neurons are guided for their migration. We are interested in the molecular mechanisms underlying neuronal migration and our work published in 1999 indicates that there are diffusible molecules in the brain which can guide the direction of migrating neurons; specifically, a secreted protein called Slit is repulsive to neurons and its concentration gradient guides neuronal migration.
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Key words Neuronal migration; Axon guidance; Molecular gradients
近15年左右，神经发育的分子生物学原理是神经生物学进展较快的领域。神经细胞迁移的分子机制是位于神经生物学、发育生物学、细胞生物学和分子生物学等学科的交叉点上的一个有趣的问题，这方面的研究有较好的学科综合和交叉的特点。这里我们概述最近一些研究的背景、结果、和前景。详细结果见参考文献中的[1～3]。
一、简要历史回顾
哺乳动物最早期的神经系统起源于胚胎的神经外胚层。神经外胚层卷曲形成神经管。神经管开始只有一层细胞，而成熟的大脑皮层有多层细胞。上一世纪和本世纪初的胚胎学家包括Vignal (1888)、Cajal (1891, 1911)、Kolliker (1896)、His (1904) 和 Hadesty (1904)等通过对胚胎的形态观察到细胞层数变化而提出中枢神经系统中细胞需要迁移[4～6]。有很长一段时间，人们不能断定神经细胞是进行主动的迁移运动，还是只有被动的位置改变。因为，如果在发育过程中细胞不断产生，新形成的细胞是不是会把早形成的细胞挤出去？在这种被动位变情况下，细胞也不需要有导向机制。
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主动迁移和被动位变两个假说争论较久，如1933年，Tilney还在支持被动位变假说[7]。1950年，当时在华盛顿大学的意大利裔女神经生物学家Rita Levi-Montalcini发现在脊髓内有一群细胞，其移动方向与被动位变预计的相反[8]。对被动位变假说的强烈否定来自于哈佛医学院的Richard Sidman实验室从50年代末开始用同位素跟踪进行的研究。1961年，Angevine和Sidman报道[9]，大脑皮层中细胞的迁移方向与被动位变假说预计的完全相反，从而支持主动迁移学说。
Sidman以后，有很多对于神经细胞迁移的研究，有些细胞是在胚胎期进行，有些细胞是在新生期进行迁移运动。90年代的研究表明，在成年的动物，包括人，都有新的神经细胞形成和迁移。所以，中枢神经系统的细胞迁移的普遍性已经确定。
外周神经系统中，细胞迁移同样重要。它们向外周迁移，形成外周神经系统，和一些非神经组织的细胞。
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二、神经细胞迁移研究的意义
因为神经细胞运动的普遍性，研究神经细胞迁移对于我们了解正常发育是必不可少的。同时，神经细胞迁移不能正常进行时，会导致神经发育异常，有多种疾病可以产生[10]。一部分癫痫就是因为神经细胞迁移异常而造成[11]。
在神经系统发生肿瘤时，癌细胞的迁移是病变过程的重要一步。如果能使癌细胞不迁移或迁移程度较小，造成的损害会较小。对神经细胞迁移的研究，有助于探索控制癌细胞迁移的途径和方法。
在一些神经系统疾病时，需要移植细胞。比如，有些神经退行性病变，可以采用细胞移植。一是移植正常的神经细胞来替代病变而死亡的神经细胞，二是移植一些产生神经营养性因子的细胞来救活原有的神经细胞。当不能直接把这些移植的细胞放到需要的部位时，如果我们知道细胞迁移的导向机制，也有可能帮助我们设计怎么把这些细胞引导到所需部位。
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三、神经细胞迁移机制的研究
神经细胞迁移的机制是人们长期感兴趣的问题。从1971年起，Pasko Rakic 在哈佛医学院、耶鲁大学进行了一系列研究，对发育过程的大脑和小脑切片进行电子显微镜的观察[6]。他发现：在大脑和小脑皮层，有辐射状分布的胶质细胞(radial glia)，其纤维的排列正好与皮层内一些神经细胞迁移轨道一样，而且在不同发育时期，神经细胞好象附着在胶质细胞纤维的不同部位。Rakic总结这些结果，提出了一个神经细胞迁移运动的细胞水平的机理：神经细胞是沿着胶质细胞的纤维而迁移。
Rakic的观察是在固定了的脑组织上进行的，但他推论了细胞是如何在活体内进行迁移。以后用活体组织和细胞进行的实验证实了Rakic的推论。M.E.Hatten在80年代进行了一系列工作[12]，把皮层的神经细胞和胶质细胞共同在体外培养，可以实时跟踪神经细胞的迁移。她们确实看到神经细胞沿着辐射状的胶质细胞进行迁移。
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Rakic的理论成为经典的神经细胞迁移模型。但是，这个模型没有解决神经细胞迁移方向的问题，有两个主要原因。第一，在辐射状胶质细胞上迁移的神经细胞，虽然不会在三维空间随机迁移，但胶质细胞的纤维一条线上仍然有两个方向，神经细胞如何知道往哪个方向迁移呢？一个可能是辐射状胶质细胞的纤维有极性能指导神经细胞迁移的方向，但这与Hatten的观察不一致。她们发现，体外培养的神经细胞可以在胶质细胞上作双向的迁移：一个神经细胞可以从胶质细胞的一端走向另外一端，然后又往回走，甚至在同一胶质细胞纤维上，同时可以有两个神经细胞作相反方向的迁移。所以胶质细胞本身不足以指导神经细胞的迁移方向。
Rakic理论不能解决导向问题的第二个原因是，八十年代末以来的研究表明，除了沿着胶质细胞的辐射状迁移(radial migration)以外，还有一大类是作正切方向迁移的(tangential migration)，而这一类的神经细胞迁移并不依赖于胶质细胞。依据不同实验室在不同脑区进行的研究，正切迁移占了所有迁移的10%到70%。因为正切迁移与胶质细胞的排列方向不一致，如何指导正切迁移的方向就更成了问题。
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一个正切迁移模型是Luskin在1993年发现的[13]。鼠前脑的嗅球有中间神经元，其前体细胞是出生后两周内产生的。它们生于前脑亚室管膜层(anterior subventricular zone, SVZa)，而要沿着头端迁移渠道(rostral migratory stream, RMS)向前迁移几个毫米才能到达嗅球(这些细胞本身直径只有约10微米)。洛克菲勒大学的Alvarez-Buylla实验室认为这些神经细胞是沿着同样的神经细胞迁移的，但这并没有解决导向的问题。如果没有神经细胞知道方向，其它神经细胞又怎样能够靠沿着它们而知道迁移方向呢？1996年，当时在西储大学的H.Hu和U.Rutishauser发现[14]，前脑中线的结构隔区(septum)对SVZa的神经细胞有排斥性作用，从而提出SVZa细胞导向的一个细胞机制。1997年，Alvarez-Buylla实验室发表文章，其中指出隔区导向的两个问题：一是他们不能重复Hu和Rutishauser的结果，二是隔区不是正好在SVZa的后面，也就是说，即使隔区有排斥性作用，也难以它的作用来解释SVZa的细胞为什么会向前迁移到嗅球去。1999年我们的实验证实了Hu和Rutishauser的结果：隔区在体外对SVZa细胞确实有排斥性作用。但是，对Alvarez-Buylla的另一个问题迄今没有人能够回答，也就是说，目前还不清楚隔区在体内是否有指导SVZa迁移的作用。
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因此，对神经细胞迁移，不管是辐射状迁移，还是正切型迁移，在细胞水平上都有了相当的工作。但是，另一方面，对导向的分子机制却不清楚。
四、神经纤维生长的分子生物学机制
我们近年的工作最初是研究分子信号在神经发育中的功能，特别是眼睛和神经管形态发生的分子原理。我们对一个叫Slit的分子的研究，使我们意识到可以理解神经细胞中两个与运动和导向有关的生物学过程：神经纤维生长(轴突导向)和神经细胞迁移。我们对Slit的功能研究首先在轴突导向方面取得进展。
1984年，德国女发育生物学家C.Nusslein-Volhard等在筛选影响果蝇型式发生的基因时[15]，证明Slit基因的存在。耶鲁大学S. Artavanis-Tsakonas实验室的一位研究生J.Rothberg于1988年克隆了果蝇的Slit基因。他们发现Slit基因编码的是一个比较大的分泌性蛋白质[16]。他们和伯克利加州大学的C.S.Goodman合作研究的结果认为：Slit的功能是决定果蝇神经索正中线的胶质细胞形成，没有Slit时，这些胶质细胞不能正常形成和分化。
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我们实验室对脊椎动物中线形成感兴趣。从1994年到1997年的研究中，我们发现中线结构是眼睛早期发育的重要信号来源。于是，我们即寻找脊椎动物中线产生的分子信号。1995、1996年我们从非洲爪蟾、鸡、和鼠中找到了Slit基因。用原位杂交观察到Slit的mRNA表达在神经管的腹侧中线结构(floor plate，底板)、背侧中线结构(roof plate，顶板)和运动神经元前体区域(motor column)。我们花了好一段时间试图研究Slit对眼睛和神经管内细胞命运和型式发生的影响，结果未见到这些方面的作用。
神经管的腹侧中线结构另外还有一个重要的功能是指导神经纤维的生长方向(axon guidance)。这由好些实验室的研究已经表明，在果蝇内，以Goodman的工作为主；在脊椎动物内，以旧金山加州大学的M.Tessier-Lavigne为代表。对神经纤维连接的大量研究主要集中于轴突生长和导向。80年代的研究揭示了几个家族的细胞粘结分子对轴突生长和导向的重要性。1993年，当时在宾州大学的罗玉林和J.Raper发现一个叫collapsin的分子，对轴突末端的生长锥运动十分重要。Goodman实验室发现果蝇里也有类似分子，这个家族现称为semaphorin (Sema), 迄今已经发现二十多个成员，遍布于低等和高等动物。Sema一般是对轴突导向起排斥性作用。1994年Tessier-Lavigne实验室发现Netrin家族对轴突生长有吸引性作用，以后发现Netrin对有些轴突可以有排斥作用。1995年，德国马普研究所的F.Bonhoeffer和美国哈佛医学院的J.Flanagan两个实验室发现Ephrin家族的分子对视觉系统内轴突有排斥性作用。这个家族在哺乳类已知有八个成员，其作用并不限于视觉系统。1997年，当时在圣迭格加州大学的蒲慕明实验室发现，轴突导向分子是排斥性还是吸引性，不仅取决于导向分子本身，而且取决于轴突内的第二信使的浓度。
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我们对轴突导向的研究是在鼠的嗅觉系统进行的。嗅觉信号传递有三级：鼻粘膜上的感觉神经细胞先感受气味分子，这些细胞受刺激后会把信号传到前脑的嗅球；嗅球里的神经细胞收到信号后，再通过嗅球的神经细胞的轴突又把信号传递到大脑的嗅皮层等更高的功能区域。嗅球的轴突怎么知道如何投射呢？解剖学上，西班牙的卡哈尔(Ramon y Cajal)在1911年以前就知道，嗅球的轴突往嗅皮层投射时，开始一段是贴着大脑的最外侧，好象离大脑的中线越远越好似的。1993年，英国的A. Pini报道，胚胎前脑的隔区对嗅球的轴突有排斥性作用，从而提出嗅球轴突导向的细胞机理。我们的研究发现：在胚胎时期，有两个Slit基因在隔区有表达。而我们用生物化学实验证明[1]：Slit蛋白的受体是一个叫Roundabout (Robo)的跨膜蛋白。Robo本身在嗅球神经细胞上有表达[1]。我们进一步用体外培养的嗅球做的功能研究证实，Slit对嗅球的轴突有排斥性作用[1]。所以Slit是指导轴突长向的分子。Robo最初是Goodman实验室在1998年发现的。1999年，Goodman、Tessier-Lavigne和我们一同发表文章，证明Robo是Slit的受体。在果蝇里，Goodman实验室证明以前Rothberg、Artavanis-Tsakonas和他们认为Slit影响中线细胞形成和分化的结论是错的[17]。Tessier-Lavigne实验室在鼠的脊髓中发现Slit可以排斥运动神经元的轴突[18]、还可以促进感觉神经细胞的神经纤维的分支形成[19]。所以，Slit是与Sema、Netrin、Ephrin并列的第四类调节轴突生长方向的分子。在哺乳类，迄今找到了三个Slit成员。
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五、神经细胞迁移导向的分子生物学机制
神经细胞迁移的分子水平机制是现代发育神经生物学的一个重要课题。从80年代起，有多个实验室从不同角度对神经细胞迁移进行了分子水平的研究。但这些工作没有解决细胞迁移时的一个关键问题：导向性机制。我们近年用Slit进行的研究终于在这方面有了进展。
如前所述，新生鼠嗅球的中间神经元是由SVZa来源的前体细胞经过正切型迁移而来，而新生鼠的前脑隔区对SVZa神经元有排斥作用。我们克隆到Slit基因后，知道不仅在胚胎期，而且在新生期的隔区，也有Slit的表达[2]。为了做功能检测，我们把Slit基因转导到常用的HEK细胞系里，使HEK细胞能产生和分泌Slit蛋白质。然后，我们在体外培养SVZa的细胞。当一边放有对照组的HEK细胞时，SVZa细胞迁移没有方向性。而当我们在SVZa细胞的一边放产生Slit的HEK细胞时，SVZa细胞就向离开这种HEK细胞的方向迁移[2]。更多的实验表明[2]：Slit对SVZa神经细胞是有排斥性的导向作用，而不是对细胞迁移起抑制作用。我们还看到[2]：当SVZa细胞被放在两组产生Slit蛋白的HEK中间时，如果SVZa与这两组Slit来源是等距离时，SVZa细胞没有方向性；而如果SVZa与这两组Slit来源其中之一的距离小于另外一个时，那么，SVZa在开始时是跑开近的Slit来源。这组实验结果的最好解释是[2]：Slit蛋白从细胞分泌出来后，形成一定的浓度梯度，而SVZa细胞是从Slit浓度高处往Slit浓度低处迁移。这是在没有纯化蛋白质条件下，证明浓度梯度重要性的一个比较巧妙的实验。我们进一步分离了脑片，建立了观察SVZa细胞在脑组织中的迁移的模型，我们发现在脑组织中迁移的SVZa细胞也是被Slit所排斥的。
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Slit的导向作用是否只是在SVZa是一个特例呢？我们用另外一个正切型迁移模型研究了Slit作用的普遍意义[3]。长期以来人们以为大脑皮层中所有神经细胞都是来源于大脑皮层内部的室管膜层，然后再迁移到皮层内的不同层面。近10年的研究表明，皮层最主要的抑制性神经元(GABA神经元)大多数或全部是来源于皮层外的一个结构，这个结构是胚胎期的外侧节隆起(lateral ganglionic eminence, LGE)，它是纹状体(striatum)的前体结构。LGE的细胞通过正切迁移而进入大脑皮层。LGE的细胞是如何知道要离开LGE，而迁移向大脑皮层的呢？我们先进行了细胞水平的研究[3]。LGE的几层细胞中，其亚室管膜层(subventricular zone)是可以迁移到大脑皮层的。这层细胞夹在两层细胞之间。我们发现，LGE的室管膜层(ventricular zone)对亚室管膜层细胞有排斥性，而另一层(mantle layer)对亚室管膜层细胞没有任何方向性指导[3]。原位杂交表明，有一个Slit表达在LGE的室管膜层。功能研究表明，Slit蛋白质对LGE来源的GABA神经元是排斥性的[3]。在脑片上，我们可以把分泌Slit的HEK细胞人为地放在LGE-大脑皮层迁移通道上，LGE的细胞就不能进入大脑皮层。这些结果说明[3]：Slit的作用不是局限于单个系统，它至少在两个正切型迁移系统有用。我们尚未发表的结果还表明，Slit对于大脑皮层内部辐射状迁移的神经细胞也可能有排斥性作用。
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六、发现神经细胞迁移导向分子的意义
发现Slit对神经细胞迁移有导向性作用，不仅是研究了一个分子或者是发现了一个分子的功能。我们的研究目的首先是为了推进对于生物学的根本问题的基本理解，同时也注意到基础研究的可能应用。
我们用Slit做的实验结果，第一次证明了一个分子可以直接指导神经细胞迁移的方向[2]。我们还发现导向蛋白是通过浓度梯度来指导神经细胞的迁移，而不是靠绝对浓度来导向的[2]。这个结论，以前在细胞水平未曾有过实验研究。
发育神经生物学中一个有争议的问题是：神经纤维的导向机制与神经细胞的导向机制是否相同？我们发现Slit既可以导向轴突、又可以导向神经细胞胞体迁移的事实，说明轴突导向和神经细胞迁移在分子机制上是有共同性的[2]。
同时，我们的结论也提示人们应该研究其它轴突导向的分子是否指导神经细胞的迁移。实际上，以往在线虫(C. elegans)和果蝇里面曾经观察到：一些影响轴突导向的分子(包括Netrin和Slit)也影响中胚层细胞(如肌肉细胞)的位置，当然那时不能肯定地将位置差异直接归于细胞迁移，因为位置变化可以是其它差异后间接影响的结果；但有了Slit直接指导神经细胞的证据后，现在可以比较容易地推论轴突导向分子可能导向中胚层细胞的迁移。最近，Salk研究所的D.O'Leary和Tessier-Lavigne合作，发现对轴突有吸引性的Netrin也对小脑内一些神经细胞有吸引性。这也说明，将会发现更多的对神经细胞迁移有导向性的分子，对神经细胞迁移的分子生物学研究的速度将会加快。
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我们的文章比较淡地提到了神经细胞迁移导向分子的应用可能[2，3]。Rakic在对我们文章的评论中[20]认为，这些发现刺激人们产生关于治疗途径的新思想。例如可以设想：脑内肿瘤细胞扩散时是否能用排斥性导向分子去控制，使肿瘤细胞不扩散到危害大的脑内部位或由血管、淋巴管转移到身体其它部位。也可以设想在神经退行性病变时可以用导向分子把有治疗作用的细胞导入所需部位。我们认为要实现这些应用还有待进一步实验研究。细胞迁移的导向分子的发现，为探讨其应用前景提供了必要的思想和物质基础。
七、神经细胞迁移有待研究的问题
我们在1999年发表的文章中得出了一些有益的结论[2，3]，同时我们在这几年的研究中又发现了新的问题。这里举例简介几个方面。
一是长程导向问题。我们已有的研究，只能说Slit可以指导神经细胞迁移方向，在体外我们看到Slit的作用范围可达1毫米[2]。但在体内从SVZa到嗅球有几毫米[13]，导向是靠什么？一个极端的可能是体内Slit的浓度梯度可以铺的较远，这样整个全程的迁移都可以由Slit单个分子来导向。另一个可能是Slit只在小部分距离作用，而其它部分由其它分子来导向。当然，也可以是Slit和其它分子一起协同作用。当细胞长程迁移后，是否有信号告诉它们应该在什么地方停下来？最简单(但很可能不正确)的猜测是：当Slit的浓度梯度的尾段梯度太小时，细胞就停下。而一个更有趣的可能是在细胞要到达的靶区，局部有迁移终止信号。
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二是细胞内机制。我们迄今的研究是集中于细胞外的导向分子。那么，细胞是怎样感受导向分子的呢？一个神经细胞的直径约10微米，细胞要有方向性的迁移就要知道各个方向的差别。在Slit的浓度梯度里，细胞需要有能力知道哪一边的Slit浓度高，哪一边的浓度低，而且要把细胞外分子浓度梯度转化成变成细胞内运动在方向性上的差别。和其它信号转导一样，这当然也要知道细胞外分子结合细胞表面受体以后有哪些细胞内分子被激活，哪些细胞内分子要参与信号转导。但是与一般信号转导不同的是，细胞有方向的迁移意味着仅仅知道参与的细胞内分子是不够的；可能更有意义的是要知道：这些分子，或它们活化了的形式，如何在细胞内有极性地分布。
三是Slit-Robo通路与其它分子的关系。有一些其它分子被认为可能参与或影响神经细胞的迁移。在鼠和人类，已经知道一些遗传性疾病有神经细胞迁移的异常。通过克隆这些疾病的致病基因，也找到了一些参与或者影响神经细胞迁移的分子。
四是神经细胞迁移与其它细胞迁移的关系。发现神经细胞迁移的导向分子提示人们可以探讨神经细胞迁移和其它系统的细胞迁移有没有共同性。很多系统都有细胞迁移的现象，不仅在发育阶段，在成人也有细胞迁移。很久以来，人们已经知道血液里的白细胞有迁移，比如各种炎症时白细胞的迁移就起重要作用；白细胞也有导向分子，但是与神经细胞的导向分子看起来很不一样。在明确了神经细胞的导向分子后，我们可以再重新问这个“不一样”是表面的还是根本的。
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自然，已经解答一些问题可以令人高兴，但更多的问题有待回答更使人兴奋；因为在思想和技术上有积累的基础上，可以进一步扩展和加深我们的理解。
(参与研究的来自我们在美国的两个实验室和饶毅在中国科学院的实验室，包括：研究生李华顺、朱岩、K.Wong、T.Fagaly；博士后陈锦辉、江志红；技术员吴伟、周丽鹃、S.Dupuis、C.Tierney、W.Nash等。我们在美国的实验室分别得到NIH、NSF、Merck基金、白血病学会等支持，在中国的实验室得到中国国家自然科学基金、上海市科学技术委员会、教育部春晖计划等支持，特此致谢。因为杂志惯例，引文限于20篇)
参考文献
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关键词：神经元；细胞迁移；轴突导向；分子浓度梯度
生理科学进展000303 摘要 自19世纪以来的研究表明，在胚胎发育期间和出生后，包括人在内的哺乳动物神经系统的大部分神经细胞(也许是所有神经细胞)都要经过一定距离的迁移运动才能抵达它们发挥功能的部位。这些细胞如何知道往哪个方向迁移呢？我们在分子水平对这个问题进行了研究。1999年发表的结果给出这样一个答案：脑内存在导向性分子，可以指导神经细胞的迁移方向；具体的发现是，一个叫Slit的分泌性蛋白质，对神经细胞有排斥性作用，它的浓度梯度指导神经细胞迁移的方向。
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The Molecular Mechanism of Neuronal Migration
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Abstract A large amount of work since the late 1800 have shown that, during embrynoic and postnatal development, the majority, if not all, neurons in mammalian nervous system have to migrate a certain distance to reach their final destination. An interesting question is how neurons are guided for their migration. We are interested in the molecular mechanisms underlying neuronal migration and our work published in 1999 indicates that there are diffusible molecules in the brain which can guide the direction of migrating neurons; specifically, a secreted protein called Slit is repulsive to neurons and its concentration gradient guides neuronal migration.
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Key words Neuronal migration; Axon guidance; Molecular gradients
近15年左右，神经发育的分子生物学原理是神经生物学进展较快的领域。神经细胞迁移的分子机制是位于神经生物学、发育生物学、细胞生物学和分子生物学等学科的交叉点上的一个有趣的问题，这方面的研究有较好的学科综合和交叉的特点。这里我们概述最近一些研究的背景、结果、和前景。详细结果见参考文献中的[1～3]。
一、简要历史回顾
哺乳动物最早期的神经系统起源于胚胎的神经外胚层。神经外胚层卷曲形成神经管。神经管开始只有一层细胞，而成熟的大脑皮层有多层细胞。上一世纪和本世纪初的胚胎学家包括Vignal (1888)、Cajal (1891, 1911)、Kolliker (1896)、His (1904) 和 Hadesty (1904)等通过对胚胎的形态观察到细胞层数变化而提出中枢神经系统中细胞需要迁移[4～6]。有很长一段时间，人们不能断定神经细胞是进行主动的迁移运动，还是只有被动的位置改变。因为，如果在发育过程中细胞不断产生，新形成的细胞是不是会把早形成的细胞挤出去？在这种被动位变情况下，细胞也不需要有导向机制。
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主动迁移和被动位变两个假说争论较久，如1933年，Tilney还在支持被动位变假说[7]。1950年，当时在华盛顿大学的意大利裔女神经生物学家Rita Levi-Montalcini发现在脊髓内有一群细胞，其移动方向与被动位变预计的相反[8]。对被动位变假说的强烈否定来自于哈佛医学院的Richard Sidman实验室从50年代末开始用同位素跟踪进行的研究。1961年，Angevine和Sidman报道[9]，大脑皮层中细胞的迁移方向与被动位变假说预计的完全相反，从而支持主动迁移学说。
Sidman以后，有很多对于神经细胞迁移的研究，有些细胞是在胚胎期进行，有些细胞是在新生期进行迁移运动。90年代的研究表明，在成年的动物，包括人，都有新的神经细胞形成和迁移。所以，中枢神经系统的细胞迁移的普遍性已经确定。
外周神经系统中，细胞迁移同样重要。它们向外周迁移，形成外周神经系统，和一些非神经组织的细胞。
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二、神经细胞迁移研究的意义
因为神经细胞运动的普遍性，研究神经细胞迁移对于我们了解正常发育是必不可少的。同时，神经细胞迁移不能正常进行时，会导致神经发育异常，有多种疾病可以产生[10]。一部分癫痫就是因为神经细胞迁移异常而造成[11]。
在神经系统发生肿瘤时，癌细胞的迁移是病变过程的重要一步。如果能使癌细胞不迁移或迁移程度较小，造成的损害会较小。对神经细胞迁移的研究，有助于探索控制癌细胞迁移的途径和方法。
在一些神经系统疾病时，需要移植细胞。比如，有些神经退行性病变，可以采用细胞移植。一是移植正常的神经细胞来替代病变而死亡的神经细胞，二是移植一些产生神经营养性因子的细胞来救活原有的神经细胞。当不能直接把这些移植的细胞放到需要的部位时，如果我们知道细胞迁移的导向机制，也有可能帮助我们设计怎么把这些细胞引导到所需部位。
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三、神经细胞迁移机制的研究
神经细胞迁移的机制是人们长期感兴趣的问题。从1971年起，Pasko Rakic 在哈佛医学院、耶鲁大学进行了一系列研究，对发育过程的大脑和小脑切片进行电子显微镜的观察[6]。他发现：在大脑和小脑皮层，有辐射状分布的胶质细胞(radial glia)，其纤维的排列正好与皮层内一些神经细胞迁移轨道一样，而且在不同发育时期，神经细胞好象附着在胶质细胞纤维的不同部位。Rakic总结这些结果，提出了一个神经细胞迁移运动的细胞水平的机理：神经细胞是沿着胶质细胞的纤维而迁移。
Rakic的观察是在固定了的脑组织上进行的，但他推论了细胞是如何在活体内进行迁移。以后用活体组织和细胞进行的实验证实了Rakic的推论。M.E.Hatten在80年代进行了一系列工作[12]，把皮层的神经细胞和胶质细胞共同在体外培养，可以实时跟踪神经细胞的迁移。她们确实看到神经细胞沿着辐射状的胶质细胞进行迁移。
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Rakic的理论成为经典的神经细胞迁移模型。但是，这个模型没有解决神经细胞迁移方向的问题，有两个主要原因。第一，在辐射状胶质细胞上迁移的神经细胞，虽然不会在三维空间随机迁移，但胶质细胞的纤维一条线上仍然有两个方向，神经细胞如何知道往哪个方向迁移呢？一个可能是辐射状胶质细胞的纤维有极性能指导神经细胞迁移的方向，但这与Hatten的观察不一致。她们发现，体外培养的神经细胞可以在胶质细胞上作双向的迁移：一个神经细胞可以从胶质细胞的一端走向另外一端，然后又往回走，甚至在同一胶质细胞纤维上，同时可以有两个神经细胞作相反方向的迁移。所以胶质细胞本身不足以指导神经细胞的迁移方向。
Rakic理论不能解决导向问题的第二个原因是，八十年代末以来的研究表明，除了沿着胶质细胞的辐射状迁移(radial migration)以外，还有一大类是作正切方向迁移的(tangential migration)，而这一类的神经细胞迁移并不依赖于胶质细胞。依据不同实验室在不同脑区进行的研究，正切迁移占了所有迁移的10%到70%。因为正切迁移与胶质细胞的排列方向不一致，如何指导正切迁移的方向就更成了问题。
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一个正切迁移模型是Luskin在1993年发现的[13]。鼠前脑的嗅球有中间神经元，其前体细胞是出生后两周内产生的。它们生于前脑亚室管膜层(anterior subventricular zone, SVZa)，而要沿着头端迁移渠道(rostral migratory stream, RMS)向前迁移几个毫米才能到达嗅球(这些细胞本身直径只有约10微米)。洛克菲勒大学的Alvarez-Buylla实验室认为这些神经细胞是沿着同样的神经细胞迁移的，但这并没有解决导向的问题。如果没有神经细胞知道方向，其它神经细胞又怎样能够靠沿着它们而知道迁移方向呢？1996年，当时在西储大学的H.Hu和U.Rutishauser发现[14]，前脑中线的结构隔区(septum)对SVZa的神经细胞有排斥性作用，从而提出SVZa细胞导向的一个细胞机制。1997年，Alvarez-Buylla实验室发表文章，其中指出隔区导向的两个问题：一是他们不能重复Hu和Rutishauser的结果，二是隔区不是正好在SVZa的后面，也就是说，即使隔区有排斥性作用，也难以它的作用来解释SVZa的细胞为什么会向前迁移到嗅球去。1999年我们的实验证实了Hu和Rutishauser的结果：隔区在体外对SVZa细胞确实有排斥性作用。但是，对Alvarez-Buylla的另一个问题迄今没有人能够回答，也就是说，目前还不清楚隔区在体内是否有指导SVZa迁移的作用。
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因此，对神经细胞迁移，不管是辐射状迁移，还是正切型迁移，在细胞水平上都有了相当的工作。但是，另一方面，对导向的分子机制却不清楚。
四、神经纤维生长的分子生物学机制
我们近年的工作最初是研究分子信号在神经发育中的功能，特别是眼睛和神经管形态发生的分子原理。我们对一个叫Slit的分子的研究，使我们意识到可以理解神经细胞中两个与运动和导向有关的生物学过程：神经纤维生长(轴突导向)和神经细胞迁移。我们对Slit的功能研究首先在轴突导向方面取得进展。
1984年，德国女发育生物学家C.Nusslein-Volhard等在筛选影响果蝇型式发生的基因时[15]，证明Slit基因的存在。耶鲁大学S. Artavanis-Tsakonas实验室的一位研究生J.Rothberg于1988年克隆了果蝇的Slit基因。他们发现Slit基因编码的是一个比较大的分泌性蛋白质[16]。他们和伯克利加州大学的C.S.Goodman合作研究的结果认为：Slit的功能是决定果蝇神经索正中线的胶质细胞形成，没有Slit时，这些胶质细胞不能正常形成和分化。
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我们实验室对脊椎动物中线形成感兴趣。从1994年到1997年的研究中，我们发现中线结构是眼睛早期发育的重要信号来源。于是，我们即寻找脊椎动物中线产生的分子信号。1995、1996年我们从非洲爪蟾、鸡、和鼠中找到了Slit基因。用原位杂交观察到Slit的mRNA表达在神经管的腹侧中线结构(floor plate，底板)、背侧中线结构(roof plate，顶板)和运动神经元前体区域(motor column)。我们花了好一段时间试图研究Slit对眼睛和神经管内细胞命运和型式发生的影响，结果未见到这些方面的作用。
神经管的腹侧中线结构另外还有一个重要的功能是指导神经纤维的生长方向(axon guidance)。这由好些实验室的研究已经表明，在果蝇内，以Goodman的工作为主；在脊椎动物内，以旧金山加州大学的M.Tessier-Lavigne为代表。对神经纤维连接的大量研究主要集中于轴突生长和导向。80年代的研究揭示了几个家族的细胞粘结分子对轴突生长和导向的重要性。1993年，当时在宾州大学的罗玉林和J.Raper发现一个叫collapsin的分子，对轴突末端的生长锥运动十分重要。Goodman实验室发现果蝇里也有类似分子，这个家族现称为semaphorin (Sema), 迄今已经发现二十多个成员，遍布于低等和高等动物。Sema一般是对轴突导向起排斥性作用。1994年Tessier-Lavigne实验室发现Netrin家族对轴突生长有吸引性作用，以后发现Netrin对有些轴突可以有排斥作用。1995年，德国马普研究所的F.Bonhoeffer和美国哈佛医学院的J.Flanagan两个实验室发现Ephrin家族的分子对视觉系统内轴突有排斥性作用。这个家族在哺乳类已知有八个成员，其作用并不限于视觉系统。1997年，当时在圣迭格加州大学的蒲慕明实验室发现，轴突导向分子是排斥性还是吸引性，不仅取决于导向分子本身，而且取决于轴突内的第二信使的浓度。
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我们对轴突导向的研究是在鼠的嗅觉系统进行的。嗅觉信号传递有三级：鼻粘膜上的感觉神经细胞先感受气味分子，这些细胞受刺激后会把信号传到前脑的嗅球；嗅球里的神经细胞收到信号后，再通过嗅球的神经细胞的轴突又把信号传递到大脑的嗅皮层等更高的功能区域。嗅球的轴突怎么知道如何投射呢？解剖学上，西班牙的卡哈尔(Ramon y Cajal)在1911年以前就知道，嗅球的轴突往嗅皮层投射时，开始一段是贴着大脑的最外侧，好象离大脑的中线越远越好似的。1993年，英国的A. Pini报道，胚胎前脑的隔区对嗅球的轴突有排斥性作用，从而提出嗅球轴突导向的细胞机理。我们的研究发现：在胚胎时期，有两个Slit基因在隔区有表达。而我们用生物化学实验证明[1]：Slit蛋白的受体是一个叫Roundabout (Robo)的跨膜蛋白。Robo本身在嗅球神经细胞上有表达[1]。我们进一步用体外培养的嗅球做的功能研究证实，Slit对嗅球的轴突有排斥性作用[1]。所以Slit是指导轴突长向的分子。Robo最初是Goodman实验室在1998年发现的。1999年，Goodman、Tessier-Lavigne和我们一同发表文章，证明Robo是Slit的受体。在果蝇里，Goodman实验室证明以前Rothberg、Artavanis-Tsakonas和他们认为Slit影响中线细胞形成和分化的结论是错的[17]。Tessier-Lavigne实验室在鼠的脊髓中发现Slit可以排斥运动神经元的轴突[18]、还可以促进感觉神经细胞的神经纤维的分支形成[19]。所以，Slit是与Sema、Netrin、Ephrin并列的第四类调节轴突生长方向的分子。在哺乳类，迄今找到了三个Slit成员。
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五、神经细胞迁移导向的分子生物学机制
神经细胞迁移的分子水平机制是现代发育神经生物学的一个重要课题。从80年代起，有多个实验室从不同角度对神经细胞迁移进行了分子水平的研究。但这些工作没有解决细胞迁移时的一个关键问题：导向性机制。我们近年用Slit进行的研究终于在这方面有了进展。
如前所述，新生鼠嗅球的中间神经元是由SVZa来源的前体细胞经过正切型迁移而来，而新生鼠的前脑隔区对SVZa神经元有排斥作用。我们克隆到Slit基因后，知道不仅在胚胎期，而且在新生期的隔区，也有Slit的表达[2]。为了做功能检测，我们把Slit基因转导到常用的HEK细胞系里，使HEK细胞能产生和分泌Slit蛋白质。然后，我们在体外培养SVZa的细胞。当一边放有对照组的HEK细胞时，SVZa细胞迁移没有方向性。而当我们在SVZa细胞的一边放产生Slit的HEK细胞时，SVZa细胞就向离开这种HEK细胞的方向迁移[2]。更多的实验表明[2]：Slit对SVZa神经细胞是有排斥性的导向作用，而不是对细胞迁移起抑制作用。我们还看到[2]：当SVZa细胞被放在两组产生Slit蛋白的HEK中间时，如果SVZa与这两组Slit来源是等距离时，SVZa细胞没有方向性；而如果SVZa与这两组Slit来源其中之一的距离小于另外一个时，那么，SVZa在开始时是跑开近的Slit来源。这组实验结果的最好解释是[2]：Slit蛋白从细胞分泌出来后，形成一定的浓度梯度，而SVZa细胞是从Slit浓度高处往Slit浓度低处迁移。这是在没有纯化蛋白质条件下，证明浓度梯度重要性的一个比较巧妙的实验。我们进一步分离了脑片，建立了观察SVZa细胞在脑组织中的迁移的模型，我们发现在脑组织中迁移的SVZa细胞也是被Slit所排斥的。
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Slit的导向作用是否只是在SVZa是一个特例呢？我们用另外一个正切型迁移模型研究了Slit作用的普遍意义[3]。长期以来人们以为大脑皮层中所有神经细胞都是来源于大脑皮层内部的室管膜层，然后再迁移到皮层内的不同层面。近10年的研究表明，皮层最主要的抑制性神经元(GABA神经元)大多数或全部是来源于皮层外的一个结构，这个结构是胚胎期的外侧节隆起(lateral ganglionic eminence, LGE)，它是纹状体(striatum)的前体结构。LGE的细胞通过正切迁移而进入大脑皮层。LGE的细胞是如何知道要离开LGE，而迁移向大脑皮层的呢？我们先进行了细胞水平的研究[3]。LGE的几层细胞中，其亚室管膜层(subventricular zone)是可以迁移到大脑皮层的。这层细胞夹在两层细胞之间。我们发现，LGE的室管膜层(ventricular zone)对亚室管膜层细胞有排斥性，而另一层(mantle layer)对亚室管膜层细胞没有任何方向性指导[3]。原位杂交表明，有一个Slit表达在LGE的室管膜层。功能研究表明，Slit蛋白质对LGE来源的GABA神经元是排斥性的[3]。在脑片上，我们可以把分泌Slit的HEK细胞人为地放在LGE-大脑皮层迁移通道上，LGE的细胞就不能进入大脑皮层。这些结果说明[3]：Slit的作用不是局限于单个系统，它至少在两个正切型迁移系统有用。我们尚未发表的结果还表明，Slit对于大脑皮层内部辐射状迁移的神经细胞也可能有排斥性作用。
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六、发现神经细胞迁移导向分子的意义
发现Slit对神经细胞迁移有导向性作用，不仅是研究了一个分子或者是发现了一个分子的功能。我们的研究目的首先是为了推进对于生物学的根本问题的基本理解，同时也注意到基础研究的可能应用。
我们用Slit做的实验结果，第一次证明了一个分子可以直接指导神经细胞迁移的方向[2]。我们还发现导向蛋白是通过浓度梯度来指导神经细胞的迁移，而不是靠绝对浓度来导向的[2]。这个结论，以前在细胞水平未曾有过实验研究。
发育神经生物学中一个有争议的问题是：神经纤维的导向机制与神经细胞的导向机制是否相同？我们发现Slit既可以导向轴突、又可以导向神经细胞胞体迁移的事实，说明轴突导向和神经细胞迁移在分子机制上是有共同性的[2]。
同时，我们的结论也提示人们应该研究其它轴突导向的分子是否指导神经细胞的迁移。实际上，以往在线虫(C. elegans)和果蝇里面曾经观察到：一些影响轴突导向的分子(包括Netrin和Slit)也影响中胚层细胞(如肌肉细胞)的位置，当然那时不能肯定地将位置差异直接归于细胞迁移，因为位置变化可以是其它差异后间接影响的结果；但有了Slit直接指导神经细胞的证据后，现在可以比较容易地推论轴突导向分子可能导向中胚层细胞的迁移。最近，Salk研究所的D.O'Leary和Tessier-Lavigne合作，发现对轴突有吸引性的Netrin也对小脑内一些神经细胞有吸引性。这也说明，将会发现更多的对神经细胞迁移有导向性的分子，对神经细胞迁移的分子生物学研究的速度将会加快。
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我们的文章比较淡地提到了神经细胞迁移导向分子的应用可能[2，3]。Rakic在对我们文章的评论中[20]认为，这些发现刺激人们产生关于治疗途径的新思想。例如可以设想：脑内肿瘤细胞扩散时是否能用排斥性导向分子去控制，使肿瘤细胞不扩散到危害大的脑内部位或由血管、淋巴管转移到身体其它部位。也可以设想在神经退行性病变时可以用导向分子把有治疗作用的细胞导入所需部位。我们认为要实现这些应用还有待进一步实验研究。细胞迁移的导向分子的发现，为探讨其应用前景提供了必要的思想和物质基础。
七、神经细胞迁移有待研究的问题
我们在1999年发表的文章中得出了一些有益的结论[2，3]，同时我们在这几年的研究中又发现了新的问题。这里举例简介几个方面。
一是长程导向问题。我们已有的研究，只能说Slit可以指导神经细胞迁移方向，在体外我们看到Slit的作用范围可达1毫米[2]。但在体内从SVZa到嗅球有几毫米[13]，导向是靠什么？一个极端的可能是体内Slit的浓度梯度可以铺的较远，这样整个全程的迁移都可以由Slit单个分子来导向。另一个可能是Slit只在小部分距离作用，而其它部分由其它分子来导向。当然，也可以是Slit和其它分子一起协同作用。当细胞长程迁移后，是否有信号告诉它们应该在什么地方停下来？最简单(但很可能不正确)的猜测是：当Slit的浓度梯度的尾段梯度太小时，细胞就停下。而一个更有趣的可能是在细胞要到达的靶区，局部有迁移终止信号。
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二是细胞内机制。我们迄今的研究是集中于细胞外的导向分子。那么，细胞是怎样感受导向分子的呢？一个神经细胞的直径约10微米，细胞要有方向性的迁移就要知道各个方向的差别。在Slit的浓度梯度里，细胞需要有能力知道哪一边的Slit浓度高，哪一边的浓度低，而且要把细胞外分子浓度梯度转化成变成细胞内运动在方向性上的差别。和其它信号转导一样，这当然也要知道细胞外分子结合细胞表面受体以后有哪些细胞内分子被激活，哪些细胞内分子要参与信号转导。但是与一般信号转导不同的是，细胞有方向的迁移意味着仅仅知道参与的细胞内分子是不够的；可能更有意义的是要知道：这些分子，或它们活化了的形式，如何在细胞内有极性地分布。
三是Slit-Robo通路与其它分子的关系。有一些其它分子被认为可能参与或影响神经细胞的迁移。在鼠和人类，已经知道一些遗传性疾病有神经细胞迁移的异常。通过克隆这些疾病的致病基因，也找到了一些参与或者影响神经细胞迁移的分子。
四是神经细胞迁移与其它细胞迁移的关系。发现神经细胞迁移的导向分子提示人们可以探讨神经细胞迁移和其它系统的细胞迁移有没有共同性。很多系统都有细胞迁移的现象，不仅在发育阶段，在成人也有细胞迁移。很久以来，人们已经知道血液里的白细胞有迁移，比如各种炎症时白细胞的迁移就起重要作用；白细胞也有导向分子，但是与神经细胞的导向分子看起来很不一样。在明确了神经细胞的导向分子后，我们可以再重新问这个“不一样”是表面的还是根本的。
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自然，已经解答一些问题可以令人高兴，但更多的问题有待回答更使人兴奋；因为在思想和技术上有积累的基础上，可以进一步扩展和加深我们的理解。
(参与研究的来自我们在美国的两个实验室和饶毅在中国科学院的实验室，包括：研究生李华顺、朱岩、K.Wong、T.Fagaly；博士后陈锦辉、江志红；技术员吴伟、周丽鹃、S.Dupuis、C.Tierney、W.Nash等。我们在美国的实验室分别得到NIH、NSF、Merck基金、白血病学会等支持，在中国的实验室得到中国国家自然科学基金、上海市科学技术委员会、教育部春晖计划等支持，特此致谢。因为杂志惯例，引文限于20篇)
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