丙烯腈对大、小鼠精子形成影响的研究
作者：范卫 周元陵 钟先玖
单位：上海医科大学金山医院职业病防治所，上海 200540
关键词：
卫生毒理学杂志000412 丙烯腈(acrylonitrile,ACN)是制造腈纶纤维、丁腈橡胶和合成树脂等的重要有机合成单体，用途极广。随着石油化工、化纤工业的迅猛发展，接触ACN的人群日益增多。关于ACN毒性研究已有一些报道，动物实验表明，ACN对大鼠具有致癌作用[1]；某些流行病学调查结果表明，长期接触ACN工人中肿瘤，特别是肺癌发生的危险度增高[2]。但生殖毒性的研究报道较少。我们就ACN对大、小鼠精子数、活精率、精子畸形率和睾丸组织病理学的影响进行了研究。
1 材料与方法
1.1 丙烯腈(ACN)，分析纯。
, 百拇医药
1.2 动物与分组
(1) 昆明种小鼠雄性230只，随机分为5组，ACN灌胃染毒，蒸馏水作溶剂，共染毒5 d，剂量分别为0、6、12、24 mg/kg，同时设阳性对照组。分别于染毒后1、2、3、4、5周处死动物，作精子畸形实验，阳性对照物选用环磷酰胺(CTX)，剂量为40 mg/kg，于第5周后1次腹腔注射。
ICR小鼠雄性60只，体重(20.8±1.52)g,随机分为4组，每组15只，蒸馏水作溶剂，ACN灌胃染毒，每天1次。每周5d，连续染毒13周，剂量分别为0、5、10、15 mg/kg。
(2) Wistar雄性大鼠由中国科学院上海实验动物中心提供，雄性58只。平均体重(189.2±15.3)g，随机分为4组，蒸馏水作溶剂，ACN灌胃染毒，每天1次，每周5天，连续染毒13周。剂量分别为0、5、10、20 mg/kg。
, 百拇医药
1.3 光、电镜检查 处死大鼠后，迅速取左侧睾丸称重，随即取少量睾丸组织，放入4 ℃戊二醛缓冲液中固定。余下的睾丸组织放入Bouin氏液中固定作常规病理检查。ICR小鼠处死后，迅速取左侧睾丸，剪一小口，放入Bouin氏液中固定作常规病理检查。
1.4 精子数、活精率及精子形态分析 昆明种小鼠及大鼠处死后立即用眼科剪刀于附睾尾端剪一小口，按June等[3]方法操作，计算活精率和精子数；按黄幸纾等[4]方法检查精子畸形率。
1.5 数据处理 精子畸形率用Wilcoxon秩和检验，活精率用χ2检验，其余数据用t检验进行处理。
2 结果
实验观察：昆明种小鼠染毒共5天，各组动物的健康状况未见明显不同；ICR小鼠染毒13周后，各组体重无统计学差异；大鼠染毒染毒13周后，各组体重无统计学差异。所有染毒动物在染毒期间均无明显中毒症状。
, http://www.100md.com
2.1 小鼠精子畸形率 结果表明，2周后，24 mg/kg组精子畸形率已明显高于对照组，3周后12 mg/kg组也有影响，5周后12 mg/kg与24 mg/kg组精子畸形率明显高于对照组，差异均有非常显著性(P<0.01)。畸形种类以头部畸形为主，主要有不定形、无钩和香蕉形。
2.2 大鼠附睾尾精子分析(表1)
表1 丙烯腈染毒13周后大鼠附睾尾精子分析 剂量
(mg/kg)
动物数
(只)
附睾尾精子数
(107/g)
, http://www.100md.com
活精率
(%)
附睾尾精子畸形率(%)
头部
尾部
0
14
84.2±14.1
79.33±2.11
0.94±0.17
0.66±0.11
5
15
, 百拇医药
89.8±24.3*
77.36±6.38
2.28±0.17* *
2.13±0.32* *
10
15
101.8±25.5*
76.33±3.74* *
2.56±0.31* *
2.68±0.38* *
, http://www.100md.com
20
15
72.3±13.0
75.10±3.19* * *
3.48±0.53* *
2.68±0.30* *
与对照组(剂量为0)比较，P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 结果表明，20 mg/kg时，附睾尾精子数明显低于对照组。剂量为10 mg/kg时活精率就明显低于对照组，且有剂量-效应关系。所有实验组精子头部畸形率与尾部畸形率均明显高于对照组，并呈上升趋势。
, http://www.100md.com
2.3 小鼠睾丸病理学检查 光镜结果表明，5 mg/kg组与正常组差异无显著性，10 mg/kg组睾丸病变较轻，15 mg/kg组睾丸曲细精管内生精细胞偶见空泡变性，成熟精子轻微减少，并偶见多核巨细胞，部分动物见间质轻度水肿。
2.4 大鼠睾丸病理学检查 光镜结果表明，5、10 mg/kg组睾丸病变不明显。20 mg/kg组局部曲细精管内生精细胞减少，并见细胞空泡和核内空泡变性，出现多核巨细胞，偶见核空泡变性的多核巨细胞，间质轻度增生。
电镜结果表明，5 mg/kg组未见异常，10 mg/kg组部分精子细胞内出现空泡；20 mg/kg组，生精管内出现大量空泡，细胞数减少，部分精原细胞内有脂质物质，许多早期精子细胞中心粒畸形，部分精子细胞内有较多空泡，有顶体，但出现核畸形，部分精子头部米粒状核内出现空泡。
3 讨论
, http://www.100md.com ACN及其代谢物2-氰环氧乙烷(cyanoethylene oxide, CEO)均为可溶性小分子化学物，与GSH结合是ACN与CEO在动物体内分布的主要方式[5]，且大鼠体内分布呈快速分布并在体内广泛结合，无特异的选择性[6]，故易通过血-睾屏障而直接作用于生殖细胞。此外，ACN与CEO还能与蛋白质和核酸发生共价结合[7]，由于它们具有一定的烷基化特性，结合为不可逆性的[8]。本研究结果显示，小鼠24 mg/kg组于第2周畸形率已明显升高，12 mg/kg组第3周畸形率明显升高，表明ACN对睾丸有毒性，对精子发育的各阶段均有不同程度的影响，尤以精子细胞变态发育成精子这一阶段对ACN毒性最敏感。原因可能是ACN和CEO对生精细胞中遗传物质有烷化作用，而精子细胞与成熟精子无DNA修复能力，即使轻度损伤，亦易表现出来。大鼠经ACN染毒后，低，中剂量(5、10 mg/kg)的附睾尾精子数有升高现象，这可能是由于ACN刺激睾丸的代偿性机能而引起的结果；但随剂量增加，毒作用增强，精子数在高剂量(20 mg/kg)时已明显低于对照组，而活精率随剂量增加明显降低，各组精子畸形率均明显高于对照组，且头部畸形率有上升趋势。表明精子质量随剂量增加明显降低。大、小鼠光镜和电镜观察结果亦表明，ACN对睾丸有毒性，对精子形成各阶段有不同程度的影响，尤其是精子细胞受累最严重，病理结果与精子分析的结果一致。
, 百拇医药
综上所述，ACN染毒对大，小鼠睾丸有损伤，使附睾尾精子数减少，活精率降低，精子畸形率升高，表明ACN影响精子发生，其中以精子细胞变态发育成精子这一阶段对ACN毒性最敏感。本研究结果提示，附睾尾精子质量能反映ACN对生精过程的影响，在对接触ACN的男工进行流行病学调查，评价其生殖毒性时，有一定的价值。
参考文献
[1] Page NP, Cook B. Assessment of risk exposure to acrylonitrile: The general approach used by a consultant. Sci Total Environ, 1990, 99:307-316.
[2] Ward CE, Starr TB. Comparison of cancer risk projected from animai bioassays to epidemiologic studies of acrylonitrile exposed workers. Regul Toxicol Pharmacol, 1993, 18:214-232.
, http://www.100md.com
[3] Dunnick JK, Gupta BN, Harris MW,et al. Reproductive toxicity of dimetlyl methyl phosponate(DMMP) in the male Fischer 344 rats.Toxicol，1984, 72:379-387.
[4] 黄幸纾，陈星若，主编.环境化学物质致突变、致畸、致癌试验方法，杭州：浙江科学技术出版社，1985.264-272.
[5] Kedderis GL, Sumner SC, Held SD, et al. Dose-dependent urinary excretion of acrylonitrile metabolites by rats and mice. Toxicol Appl Pharmacol, 1993, 120:288-297.
[6] Ahmed AE Jacob S, Ghanayem BI. Comparative disposition of acrylonitrile and methacrylonitrile: Quantitative whole-body autoradiographic studies in rats. Fundam APP Toxicol, 1996, 33:49-59.
, http://www.100md.com
[7] Peter H, Bolt HM. Irreversible protein binding of acrylonitrile. Xenobiotica, 1981, 11:51-56.
[8] Guengerich FP, Geiger LE, Hogy LL, et al. In vitro metabolism of acylonitrile to 2-cyanoethylene oxide, reaction with glutathlone and irreversible binding to proteins and nucleic acids. Cancer Res, 1981, 41:4925-4934.
(收稿日期：1999-09-24), http://www.100md.com
单位：上海医科大学金山医院职业病防治所，上海 200540
关键词：
卫生毒理学杂志000412 丙烯腈(acrylonitrile,ACN)是制造腈纶纤维、丁腈橡胶和合成树脂等的重要有机合成单体，用途极广。随着石油化工、化纤工业的迅猛发展，接触ACN的人群日益增多。关于ACN毒性研究已有一些报道，动物实验表明，ACN对大鼠具有致癌作用[1]；某些流行病学调查结果表明，长期接触ACN工人中肿瘤，特别是肺癌发生的危险度增高[2]。但生殖毒性的研究报道较少。我们就ACN对大、小鼠精子数、活精率、精子畸形率和睾丸组织病理学的影响进行了研究。
1 材料与方法
1.1 丙烯腈(ACN)，分析纯。
, 百拇医药
1.2 动物与分组
(1) 昆明种小鼠雄性230只，随机分为5组，ACN灌胃染毒，蒸馏水作溶剂，共染毒5 d，剂量分别为0、6、12、24 mg/kg，同时设阳性对照组。分别于染毒后1、2、3、4、5周处死动物，作精子畸形实验，阳性对照物选用环磷酰胺(CTX)，剂量为40 mg/kg，于第5周后1次腹腔注射。
ICR小鼠雄性60只，体重(20.8±1.52)g,随机分为4组，每组15只，蒸馏水作溶剂，ACN灌胃染毒，每天1次。每周5d，连续染毒13周，剂量分别为0、5、10、15 mg/kg。
(2) Wistar雄性大鼠由中国科学院上海实验动物中心提供，雄性58只。平均体重(189.2±15.3)g，随机分为4组，蒸馏水作溶剂，ACN灌胃染毒，每天1次，每周5天，连续染毒13周。剂量分别为0、5、10、20 mg/kg。
, 百拇医药
1.3 光、电镜检查 处死大鼠后，迅速取左侧睾丸称重，随即取少量睾丸组织，放入4 ℃戊二醛缓冲液中固定。余下的睾丸组织放入Bouin氏液中固定作常规病理检查。ICR小鼠处死后，迅速取左侧睾丸，剪一小口，放入Bouin氏液中固定作常规病理检查。
1.4 精子数、活精率及精子形态分析 昆明种小鼠及大鼠处死后立即用眼科剪刀于附睾尾端剪一小口，按June等[3]方法操作，计算活精率和精子数；按黄幸纾等[4]方法检查精子畸形率。
1.5 数据处理 精子畸形率用Wilcoxon秩和检验，活精率用χ2检验，其余数据用t检验进行处理。
2 结果
实验观察：昆明种小鼠染毒共5天，各组动物的健康状况未见明显不同；ICR小鼠染毒13周后，各组体重无统计学差异；大鼠染毒染毒13周后，各组体重无统计学差异。所有染毒动物在染毒期间均无明显中毒症状。
, http://www.100md.com
2.1 小鼠精子畸形率 结果表明，2周后，24 mg/kg组精子畸形率已明显高于对照组，3周后12 mg/kg组也有影响，5周后12 mg/kg与24 mg/kg组精子畸形率明显高于对照组，差异均有非常显著性(P<0.01)。畸形种类以头部畸形为主，主要有不定形、无钩和香蕉形。
2.2 大鼠附睾尾精子分析(表1)
表1 丙烯腈染毒13周后大鼠附睾尾精子分析 剂量
(mg/kg)
动物数
(只)
附睾尾精子数
(107/g)
, http://www.100md.com
活精率
(%)
附睾尾精子畸形率(%)
头部
尾部
0
14
84.2±14.1
79.33±2.11
0.94±0.17
0.66±0.11
5
15
, 百拇医药
89.8±24.3*
77.36±6.38
2.28±0.17* *
2.13±0.32* *
10
15
101.8±25.5*
76.33±3.74* *
2.56±0.31* *
2.68±0.38* *
, http://www.100md.com
20
15
72.3±13.0
75.10±3.19* * *
3.48±0.53* *
2.68±0.30* *
与对照组(剂量为0)比较，P<0.05,**P<0.01,***P<0.001 结果表明，20 mg/kg时，附睾尾精子数明显低于对照组。剂量为10 mg/kg时活精率就明显低于对照组，且有剂量-效应关系。所有实验组精子头部畸形率与尾部畸形率均明显高于对照组，并呈上升趋势。
, http://www.100md.com
2.3 小鼠睾丸病理学检查 光镜结果表明，5 mg/kg组与正常组差异无显著性，10 mg/kg组睾丸病变较轻，15 mg/kg组睾丸曲细精管内生精细胞偶见空泡变性，成熟精子轻微减少，并偶见多核巨细胞，部分动物见间质轻度水肿。
2.4 大鼠睾丸病理学检查 光镜结果表明，5、10 mg/kg组睾丸病变不明显。20 mg/kg组局部曲细精管内生精细胞减少，并见细胞空泡和核内空泡变性，出现多核巨细胞，偶见核空泡变性的多核巨细胞，间质轻度增生。
电镜结果表明，5 mg/kg组未见异常，10 mg/kg组部分精子细胞内出现空泡；20 mg/kg组，生精管内出现大量空泡，细胞数减少，部分精原细胞内有脂质物质，许多早期精子细胞中心粒畸形，部分精子细胞内有较多空泡，有顶体，但出现核畸形，部分精子头部米粒状核内出现空泡。
3 讨论
, http://www.100md.com ACN及其代谢物2-氰环氧乙烷(cyanoethylene oxide, CEO)均为可溶性小分子化学物，与GSH结合是ACN与CEO在动物体内分布的主要方式[5]，且大鼠体内分布呈快速分布并在体内广泛结合，无特异的选择性[6]，故易通过血-睾屏障而直接作用于生殖细胞。此外，ACN与CEO还能与蛋白质和核酸发生共价结合[7]，由于它们具有一定的烷基化特性，结合为不可逆性的[8]。本研究结果显示，小鼠24 mg/kg组于第2周畸形率已明显升高，12 mg/kg组第3周畸形率明显升高，表明ACN对睾丸有毒性，对精子发育的各阶段均有不同程度的影响，尤以精子细胞变态发育成精子这一阶段对ACN毒性最敏感。原因可能是ACN和CEO对生精细胞中遗传物质有烷化作用，而精子细胞与成熟精子无DNA修复能力，即使轻度损伤，亦易表现出来。大鼠经ACN染毒后，低，中剂量(5、10 mg/kg)的附睾尾精子数有升高现象，这可能是由于ACN刺激睾丸的代偿性机能而引起的结果；但随剂量增加，毒作用增强，精子数在高剂量(20 mg/kg)时已明显低于对照组，而活精率随剂量增加明显降低，各组精子畸形率均明显高于对照组，且头部畸形率有上升趋势。表明精子质量随剂量增加明显降低。大、小鼠光镜和电镜观察结果亦表明，ACN对睾丸有毒性，对精子形成各阶段有不同程度的影响，尤其是精子细胞受累最严重，病理结果与精子分析的结果一致。
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综上所述，ACN染毒对大，小鼠睾丸有损伤，使附睾尾精子数减少，活精率降低，精子畸形率升高，表明ACN影响精子发生，其中以精子细胞变态发育成精子这一阶段对ACN毒性最敏感。本研究结果提示，附睾尾精子质量能反映ACN对生精过程的影响，在对接触ACN的男工进行流行病学调查，评价其生殖毒性时，有一定的价值。
参考文献
[1] Page NP, Cook B. Assessment of risk exposure to acrylonitrile: The general approach used by a consultant. Sci Total Environ, 1990, 99:307-316.
[2] Ward CE, Starr TB. Comparison of cancer risk projected from animai bioassays to epidemiologic studies of acrylonitrile exposed workers. Regul Toxicol Pharmacol, 1993, 18:214-232.
, http://www.100md.com
[3] Dunnick JK, Gupta BN, Harris MW,et al. Reproductive toxicity of dimetlyl methyl phosponate(DMMP) in the male Fischer 344 rats.Toxicol，1984, 72:379-387.
[4] 黄幸纾，陈星若，主编.环境化学物质致突变、致畸、致癌试验方法，杭州：浙江科学技术出版社，1985.264-272.
[5] Kedderis GL, Sumner SC, Held SD, et al. Dose-dependent urinary excretion of acrylonitrile metabolites by rats and mice. Toxicol Appl Pharmacol, 1993, 120:288-297.
[6] Ahmed AE Jacob S, Ghanayem BI. Comparative disposition of acrylonitrile and methacrylonitrile: Quantitative whole-body autoradiographic studies in rats. Fundam APP Toxicol, 1996, 33:49-59.
, http://www.100md.com
[7] Peter H, Bolt HM. Irreversible protein binding of acrylonitrile. Xenobiotica, 1981, 11:51-56.
[8] Guengerich FP, Geiger LE, Hogy LL, et al. In vitro metabolism of acylonitrile to 2-cyanoethylene oxide, reaction with glutathlone and irreversible binding to proteins and nucleic acids. Cancer Res, 1981, 41:4925-4934.
(收稿日期：1999-09-24), http://www.100md.com