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编号:10502668
应用噬菌体随机肽库研究艾滋病病人血清中特异抗原表位
http://www.100md.com 《中华实验和临床病毒学杂志》 2000年第4期
     作者:杜勇 侯利华 李敬云 徐静 王海涛

    单位:军事医学科院微生物流行病研究所应用分子生物学研究室 北京 100071

    关键词:获得性免疫缺陷综合征;病毒蛋白质类;免疫显性表位;附着位点

    中华实验和临床病毒学杂志000409 【摘要】 目的 运用噬菌体随机肽库,进行人类免疫缺陷病毒(HIV)蛋白质的B细胞抗原表位研究。方法 制备HIV病人血清总IgG抗体,用噬菌体递呈随机十二肽库进行生物淘洗,反向吸附非特异噬菌体,进行阳性噬菌体克隆的ELISA矢鉴定、DNA测序及计算机模拟分析。结果 成功地筛选出了位于HIV-1 GP41蛋白上的优势抗原表位(GCSGKLICTINV)。结论 运用噬菌体随机肽库可以有较地进行HIV蛋白质的B细胞抗原表位研究。由此推论,此方法也可移植于其他病原微生物抗原或自身抗原的表位研究,继而为基于表位水平的特异诊断试剂的研制、疫苗的设计提供依据。
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    Epitope mapping of HIV-1 using phage-display random peptide library and the purified IgG from HIV patient

    DU Yong, HOU Lihua, LI Jingyun

    (Department of Applied Molecular Biology, Institute of Microbiology and Epidemiology, Academy of Military Medicine, Beijing 100071, China)

    【Abstract】 Objective By using phage-display random peptide library, the B cell epitope of HIV protein was studied. Methods The library displaying random dodecamers was biopanned first with human total IgG antibodies against HIV-1, and then non-specific phages were subtracted by purifed IgG from non-HIV sera. After three rounds of screening, the positive phages were tested by ELISA for their reactivity with HIV(+)-IgG and HIV(-)-IgG antibodies. Phage that showed positive reactivity with HIV(+)-IgG, but negative to HIV(-)-IgG, were selected and their displayed peptides were determined by DNA sequencing. Results All the 13 positive clones sequenced displayed five kinds of peptides ( SPKCLGKLLCAF, THQCLGKLQCGV, SCSAKFTCTTQI, KSDCSARFMCSV, DCLKQWACEWSR) that have homology to the HIV-I gp41 (602GCSGKLICTINV613). Conclusion This method demonstrated there is a dominant epitope in the region of HIV-1 gp41 and can be used in the research of the B cell epitope of HIV protein.
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    【Key words】 Acquired immunodeficiency syndrome; Viral proteins; Immunodominant epitopes; Attachment sites

    近年来,因广泛用于蛋白质分子间相互作用研究而被称为“万能”库(All purpose)的噬菌体递呈随机肽库(Phage-displayed random peptide library),也被用在蛋白质抗原B细胞表位的分析上。噬菌体递呈的寡肽虽然不一定和天然抗原的结构完全相同,但可以模拟其结合抗体的特性。理论上,从病人血清中直接确定的特异抗原表位可作为新型的诊断试剂,而对体液免疫能产生保护作用的疾病来说,噬菌体递呈的肽表位则是研究非细胞性疫苗的基础。但在实验中,因血清中抗体种类繁多、各种抗体的滴度、亲和力高低不同,单纯用复杂的混合抗体来筛选特异的抗原表位,往往由于非特异的“富集”(richment)现象,而使筛选工作失败〔1〕。为克服上述原因和非特异富集的影响,我们设计了不须使用抗原,而通过交替用病人血清IgG抗体“淘洗”(Biopanning)随机肽库和用正常人血清IgG抗体淘洗噬菌体递呈随机十二肽库,再以正常人IgG抗体吸附,筛选到了能和HIV病人血清发生特异反应的噬菌体克隆,经ELISA、DNA测序等分析,表明在HIV gp41外膜蛋白上,存在着高亲和力、构型特异的B细胞抗表位。
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    1 材料和方法

    1.1 主要试剂 噬菌体递呈随机十二肽库试剂盒(PH.D-12TMPhage Display Peptide Library Kit)购自美国New England BioLabs公司,受体菌为E.coli ER2537;35S-dATP、Sequenanase Version 2.0 DNA Sequencing Kit购自美国Amersham公司;QLAprep Spin Miniprep Kit 购自德国QLAGEN公司;HRP-兔抗M13抗体为军事医学科学院微生物流行病研究所应用分子生物学研究室标记(效价1∶1 000);测序引物为28 g Ⅲ测序引物:5′-GTATGGGATTT

    TGCTAAACAA-3′。

    1.2 血清IgG抗体的制备 采用饱和硫酸铵沉淀法。血清经等量PBS缓冲液稀释,加人等体积的饱和硫酸铵,4℃静置过夜,12 000 r/min离心15 min沉淀球蛋白。用原体积的PB缓冲液溶解沉淀,加入1/2体积饱和硫酸铵,室温沉淀1 h,离心去上清。重复用PBS沉淀3次,最后用PBS溶解并透析。
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    1.3 随机肽库淘洗与吸附 ①将制备的HIV病人血清IgG多克隆抗体稀释至150 μg/ml,每孔150 μl包被微孔,3% BSA封闭。用300 μl稀释10 μl肽库原液,按100 μl/孔加到微孔内,室温缓慢摇荡1 h。TBST洗涤10次。每孔加入100 μl 0.2 mol/L甘氨酸-盐酸(pH2.2),室温10 min洗脱结合噬菌体。加入20 μl 2 mol/L Tris中和洗脱液。测定洗脱液中的噬菌体滴度。②将上述噬菌体洗脱液加到用正常人IgG(150 μg/ml)包被的孔内,室温慢摇1 h以吸附非特异噬菌体。每轮淘洗后均吸附3次,最后将洗脱液加到20 ml E.col ER2537培养液中(A600 nm=0.5~1.0),37℃250 r/min培养5 h。制备繁殖后的噬菌体,并测定滴度。计算噬菌体产量:百分产率=洗脱噬菌体数/淘洗用噬菌体数×100%。③按上述步骤再淘洗/吸附2次。第3次淘洗的噬菌体分别吸附3次、6次和10次。并分别感染E.coli ER2537,铺制平板。挑取单个噬斑,制备原种。经ELISA鉴定阳性克隆。对阳性克隆提取单链DNA,测序。
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    1.4 噬菌体的ELISA检测 HIV病人血清IgG抗体与正常人IgG抗体分别包被酶联板,3% BSA封闭后,加人稀释液和噬菌体原种各50 μl,37℃孵育1 h,洗涤缓冲液洗板3次。加入1∶1 000稀释的酶标兔抗M13噬菌体抗体,37℃反应1 h。OPD显色,测定吸光度A值(490 nm)。

    1.5 序列测定 采取Sanger双脱氧链未端终止法测序。提取噬菌体单链DNA,测定程序按试剂盒说明书操作。

    1.6 计算机模拟分析 用军事医学院吴加金编制的Goldkey软件,分析递呈肽氨基酸序列的亲水性、可接近性、抗原性、电荷分布、二级结构等指标,并模拟其抗原表位。

    2 结果

    2.1 噬菌体递呈随机十二肽库的特点 本实验所用的随机肽库为M13单链噬菌体递呈的组合文库,其随机十二肽融合在噬菌体小膜蛋白(pⅢ)的氨基端,即成熟蛋白的第1个氨基酸残基就是递呈肽的第1个随机位置。递呈的十二肽与野生型pⅢ蛋白间由一个4肽(GGGS)短臂连接。肽库的滴度为4×1012 PFU/ml,随机多样性为1.9×109。原始库递呈肽序列明显位置偏倚。
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    2.2 HIV病人血清抗体滴度测定 为保证淘洗吸附过程的特异性,首先用双抗原夹心法检测了所制备的HIV(+)和HIV(-)血清抗体(图1),结果显示,高稀释度的HIV(+)抗体仍可以和HIV抗原发生反应,即使总抗体浓度稀释至1 μl/ml,其A值还远高于临界值(0.152),说明总抗体中存在着高滴度的抗-HIV抗体,这确保了淘洗的敏感性;HIV(-)抗体和HIV抗原之间无明显反应,这保证了吸附过程中不至于吸附掉目的噬菌体克隆。

    图1 艾滋病人和正常人IgG抗体的ELISA检测

    Fig.1 IgG detection of HIV infected patients and

    normal persons by ELISA

, 百拇医药     2.3 肽库淘洗的富集现象 3轮淘洗中,每次加入4×1010噬菌体,随着淘洗次数的增加,洗脱的噬菌体数也随之增加,第3轮洗脱数比第1轮高出近200倍(表1),说明在淘洗过程中出现了显著的富集效应。

    2.4 筛选噬菌体的ELISA鉴定 第3轮淘洗的噬菌体经用HIV(-)抗体分别吸附3、6、10次后,各挑取噬菌斑制备原种经ELISA检测其和HIV(+)、HIV(-)抗体的反应。吸附3次的噬菌斑中未检出阳性噬菌体(0/96),吸附6次和10次后的噬菌斑中,其阳性率分别为6.3%(6/96)和10.4(20/96),说明吸附次数对筛选特异噬菌体克隆起着重要作用。阳性噬菌体对HIV(+)和HIV(-)抗体吸光度的差别可高达5~12倍(图2),说明这些噬菌体递呈肽可以特异地和V(+)抗体反应,即是HIV蛋白的特异抗原表位。

    表1 噬菌体肽库淘洗产量比较

    Tab.1 Comparison of the elutes by biopanning 淘洗次数
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    Round

    加入数(A)

    Phages added

    洗脱数(B)

    Phages eluted

    产量(B/A)

    Yield

    1

    2×1010

    3.2×106

    8.0×10-5
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    2

    2×1010

    1.3×107

    3.3×10-4

    3

    2×1010

    6.0×108

    1.5×10-2

    图2 阳性噬菌体与HIV(+)/HIV(-)IgG的免疫反应
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    Fig.2 Immunoreactivity of positive clones with HIV(+)/HIV(-)IgG by ELISA

    M13:Negative control

    2.5 阳性噬菌体递呈肽的DNA序列测定 对上述ELISA检测阳性的13个克隆进行DNA序列测定,递呈十二肽的相应碱基序列见图3。其编码氨基酸的密码子均为NNK(N=GA或TC;K=G或T),这和构建随机肽库所用的寡核苷酸序列特征一致,说明所测序列确为随机肽库的递呈片段。在这13个序列中,出现了完全相同的序列(P3/P22/P74/P86;P13/P17/P44;P14/P91;P16/P29),这迸一步证实了淘洗过程中的富集现象。

    2.6 阳性噬菌体递呈肽的氨基酸序列特征 推导上述DNA序列所编码的氨基酸,即为阳性噬菌体递呈肽的氨基酸序列(图4)。将相同的序列归为一组。13个阳性噬菌体可分为五组,分析这五组氨基酸序列,可以发现每组序列都有间隔5个氨基酸基的2个半胱氨酸,经用CLUSTALW软件比较五组递呈肽与HIV-1所编码的氨基酸序列,在HIV-1 gp41蛋白上找到了位于602-613aa的同源序列(GCSGKLICTTNV ),说明在此处有一个优势抗原表位。比较这五组阳性噬菌体克隆与HIV(+)IgG的ELISA反应,可以看出,阳性噬体克隆所递呈的氨基酸序列与HIV gp41(602aa-613aa)同源性的高低,影响着反应的强度,第3组(P3/P22/P74/P86)的同源性最高(6/12),其ELISA反应也最强,A值平均为0.71;第1、2组(P4/P16/P29)同源性次之(5/12),萁A值平均为0.69;第4组的同源性为3/12,则其平均A值降至0.64;第5组的同源性最低(2/12),其A值也最低,仅为0.32(图2,4)。
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    图3 阳性噬菌体递呈肽的编码序列

    Fig.3 DNA sequences of positive clones

    图4 阳性噬菌体递呈肽氨基酸序列比较

    Fig.4 Comparison of amino acid sequences of positive clones

    2.7 线性递呈模拟表位分析 利用Goldkey软件分析,上述5组阳性递呈肽都具有较高的亲水性、相似的二级结构。模拟表位显示,递呈肽都能形成一个很强的B细胞表位,而且图形相近(图5)。这些资料进一步印证了实验结果。

    3 讨论
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    对大多数传染性疾病、过敏性疾病及自身免疫性疾病而言,分析其病人血清中特异多克隆抗体的相应抗原表位,是基于表位水平的疫苗研制、特异血清学方法建立的重要基础工作。但在具体研究中,由于很多抗原性质不清,或实验中缺少可资利用的高纯度抗原,而常使表位分析难以进行。近年来,一些学者尝试利用抗血清作为筛选分子,直接淘筛蛋白质的抗原表位,取得了成功〔2-5〕,但是他们建立的方法近似于cDNA文库的免疫学筛选技术,其方法难度大,费时,烦琐,效率低。本研究中,我们设计了无须使用抗原,而直接用混合IgG抗体和噬菌体随机肽库筛选病毒蛋白质B细胞抗原表位的技术路线,并成功地筛选出了HIV-1 gp41蛋白上的抗原表位。此技术的特点是简单、省时,结果可靠,同时提高了实验的敏感性和特异性。从实验结果3可以看出,即通过吸附,去除大量非特异的噬菌体,而使目的噬菌体出现的机率大大提高。

    图5 模拟抗原表位计算机分析
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    Fig.5 Mimotope pattems of positive displayed peptides

    by computer analysis

    Joseph等〔6〕利用HIV-1感染者的外周血单核细胞制备了具有中和病毒活性的人单克隆抗体,经重叠肽分析,这株单抗的相应表位恰位于gp41的602-611aa(GCSGKICTT),序列的两个半胱氨酸可以通过二硫键而形成一个环状结构,从而成为强抗原表位,这和我们的实验结果和结论相符。HIV-1 gp41是病毒的跨膜蛋白,序列相对保守,含有多个B细胞抗原表位〔7〕,抗gp41的抗体出现早,可在较长时间内保持较高水平,检测HIV抗体的初筛试剂大多数是根据人体对gp41的抗体反应而设计的,因此,gp41可用作免疫诊断或免疫预防/治疔的靶标,我们的实验结果支持这一结论,并可能为设计表位水平的高度特异、敏感诊断试剂提供有益的线索。
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    参 考 文 献

    1,Daniels DA. Phage peptide libraries. Methods Enzymol, 1996, 9:494-507.

    2,Folgori A, Tafi R, Meola A, et al. A general strategy to identify mimotopes of pathological antigens using only random peptide libraries and human sera. EMBOJ, 1994,13:2236-2243.

    3,Dybwad A, Bogen B, Natvig JB, et al. Peptide phage libraries can be an efficient tool for identifying antibody ligands for polyclonal antisera.Clin Exp Immunol, 1995,102:438-442.
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    4,Gemmaschewski V, Murray K, Identification of polyclonal serum specificities with phage display libraries. J Virol Methods, 1996,58:21-32.

    5,Prezzi C, Nuzzo M, Meola A, et al. Selection of antigenic and immunogenic mimics of HCV using sera from patiens. J Immunol, 1996, 156:4504-4513.

    6,Cotropia J, Ugen KE, Kliks S, et al. A human monoclonal antibody to HIV-1 gp41 with neutralizing activity against diverse laboratory isolates.J Acquired Immune Dificiency Syndiomes and Human Retrovirology,1996,12:221-232.

    7,D′Souza MP, Geyer SJ, Hanson CV, et al. Evaluaticn of monoclonal antibodies to HIV-1 enevlope by neutralization and binding assays: an intemational collaboration. AIDS, 1994,8:169-181.

    (收稿日期:1999-12-24)

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