RT-PCR技术在南方虫媒病毒流行病学调查中的应用
方美玉 蒋廉华 陈翠华 白志军 林立辉 刘建伟 赵文忠 陈唯军
摘 要 目的：调查南方地区虫媒病毒感染情况。方法：应用虫媒病毒的通用引物逆转录-聚合酶链反应技术(RT-PCR)。结果：检测110组骚扰阿蚊、90组白纹伊蚊和18组致倦库蚊标本，分别检出15组、9组和2组阳性标本，阳性率分别为13.63%、10%、11.11%；168份发烧病人待查标本中，28份疑似登革热血标本、11份疑似乙型脑炎血标本和3份“不明热”血标本，均扩增出413bp的特异带，证实为虫媒病毒感染。结论：①我国南方地区存在除登革病毒和乙型脑炎病毒外的其它黄病毒感染；②3种蚊虫标本检测出的阳性率表明，还可能存在新虫媒病毒疫源地。
关键词：虫媒病毒 逆转录-聚合酶链反应
虫媒病毒是指一些通过吸血的节肢动物叮咬敏感的脊椎动物而传播疾病的一类病毒。目前我国常见的虫媒病毒感染为登革热和乙型脑炎，主要由蚊虫传播。我国南方地区气候温暖、潮湿，为虫媒病毒病的多发地区，一些不明原因的发烧病人，可能与虫媒病毒感染有关。为加强对虫媒病毒的研究及其流行病学调查，笔者应用本室已建立的RT-PCR技术，检测南方不同地区一批蚊虫标本和发烧待查病人血标本，同时结合微量细胞培养病毒，进行分离鉴定。
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1 材料和方法
1.1 标本来源 1995～1998年4～10月，分别从海南省琼中县大丰农场、万宁县兴隆农场、乐东县尖峰农场、三亚市育才农场和广东省佛山市、番禺沙湾镇及乐昌市坪石镇等地采集蚊虫标本共3 560只，其中白纹伊蚊1 230只，骚扰阿蚊1 730只，致倦库蚊360只，微小按蚊240只。按采集地区和蚊种不同进行分组，-20℃冻死保存。在海南省和广东省不同地区采集发热待查病人血标本168份，于-70℃冻存备用。一方面用于RT-PCR检测，另一方面用于病原体微量培养分离。
1.2 标本RNA制备 将蚊虫标本用无菌生理盐水洗3次，每10或20只为一组研磨，然后加入细胞维持液(内含青霉素和链霉素)，置4℃作用4h，5 000r/min离心5min，取上清300μl加入等体积含异硫氰酸胍和碘化钠溶液，混匀后再加入异丙醇，置室温作用15min，再离心，乙醇洗沉淀物，最后TE缓冲液溶解〔1〕，冻存备用。取发热原因不明血标本300μl，加入等体积含异硫氰酸胍和碘化钠溶液，同样制备RNA。
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1.3 引物 根据文献资料，在虫媒病毒(主要为黄病毒)的NS1基因序列自行设计了一对通用引物，扩增基因序列长度为413bp，在DEN1～4型和JEV的NS1基因序列分别设计了5条内引物，它们分别与通用引物的下游引物配对形成5对内引物，扩增的基因序列长度分别为：DNE1型是262bp，DEN2型为189bp，DEN3型是392bp，DEN4型是97bp，JEV是323bp。上述引物基因序列参阅文献〔2〕。
1.4 病毒 DEN1～4型参考株，由日本Akira Igarashi教授赠送；JEV为日本中山株，本室保存；黄病毒中的黄热病毒(YF)、Powassan(Pow)和Langat(LGT)，为军事医学科学院赠送。各毒株感染C6/36细胞单层，细胞病变达时收毒。
1.5 试剂 异硫氰酸胍和PCR试剂盒，为华美生物工程公司产品，逆转录试剂盒，为Promega公司产品。
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1.6 RNA逆转录 按文献〔2〕操作。
1.7 PCR扩增及电泳分析 首先应用通用引物对标本进行第1次酶促扩增，扩增出特异条带后，应用内引物进行第2次扩增。两次PCR循环均为：93℃ 40s，55℃ 45s，72℃ 60s，分别为30次。PCR产物进行电泳分析，配制含溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶，取10μl PCR产物电泳，在透射式紫外发生仪上观察，并照相记录实验结果。
2 结果
2.1 蚊虫标本应用通用引物PCR扩增的结果 应用通用引物PCR扩增白纹伊蚊标本90组、骚扰阿蚊110组、致倦库蚊18组、微小按蚊10组，结果发现9组白纹伊蚊标本、15组骚扰阿蚊标本、2组致倦库蚊阳性，阳性率分别为10%、13.63%和11.11%。上述阳性标本均扩增出约413bp的特异条带(图1)，其余标本为阴性。
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图1 阳性蚊虫标本RT-PCR产物的琼脂糖电泳
M.标准分子量；1.海南岛尖峰岭白纹伊蚊；2.海南岛大丰农场致倦库蚊；3.海南岛鹿母湾林场致倦库蚊；4.海南岛大丰农场致倦库蚊
2.2 应用内引物扩增蚊虫标本的结果 应用黄病毒通用引物扩增的阳性蚊虫标本，分别应用DEN1～4型和JEV的内引物再进行PCR扩增，结果26组阳性标本均未扩增出特异条带，表明这些蚊虫的阳性标本不是DEN1～4型和JEV感染所致。
2.3 发热待查的标本应用通用引物扩增的结果 在收集的发烧待查标本中，有53份标本疑似登革热感染，应用通用引物PCR扩增后28份标本为阳性。有20份标本疑似乙型脑炎，应用通用引物扩增阳性11份。余“不明热”血标本95份，扩增阳性标本3份，均扩增出特异条带约413bp(图2)。这3份阳性标本均为海南岛琼中县收集，分别命名为HF4、HF7和HC6。
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图2 “不明热”阳性标本RT-PCR产物的琼脂糖电泳
1.vero-E6细胞阴性对照；M.标准分子量； 2.HF7； 3.HC6； 4.HF4
2.4 应用内引物扩增患者血标本的结果 通用引物PCR扩增登革热28份阳性标本，应用DEN1～4型和JEV的内引物扩增，结果表明：DEN1型阳性18份，DEN2型阳性10份，分别扩增出262bp和189bp的特异条带(图3)。
图3 登革热患者PCR产物的琼脂糖电泳
M.标准分子量； 1～5.DEN1型血清标本； A.通用引物PCR产物； B.内引物PCR产物
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乙型脑炎阳性的11份标本，应用JEV的内引物扩增后，有8份标本扩增出323bp的特异条带，3份标本未能扩增出阳性条带。
“不明热”的3份阳性标本中，应用DEN1～4型和JEV的内引物扩增，未见阳性特异带。
3 讨论
多种虫媒病毒都能感染人和动物，该类病毒感染的临床表现比较复杂，常常被误诊为其它疾病或冠以“不明热”。为了解虫媒病毒在南方地区的感染情况，我们应用自行设计的虫媒病毒通用引物(主要为黄病毒)和DEN1～4型及JEV的内引物，检测了一批南方不同地区采集的蚊虫标本和一批发烧待查病人血标本。上述通用引物和内引物的特异性和敏感性，在我们以前的研究中已证实过〔3-4〕。
应用RT-PCR扩增90组白纹伊蚊标本，有9组阳性；检测110组骚扰阿蚊标本，有15组阳性；18组致倦库蚊，有2组阳性。阳性率分别为10%、13.63%、11.11%。进一步应用DEN1～4型和JEV的内引物扩增，未发现DEN和JEV的特异条带。应用RT-PCR扩增53份疑似登革热血标本，28份标本为阳性；应用内引物扩增后DEN1型阳性18份，DEN2型阳性10份。疑似乙型脑炎标本中，应用通用引物扩增后阳性11份；“不明热”标本中扩增出3份阳性标本。上述结果与我们同时进行的病原分离结果基本一致。其中1株致倦库蚊阳性标本和2株“不明热”病人血阳性标本接种2d龄昆明种乳小白鼠后，可在3d左右发病，乳鼠表现拒奶、侧卧、抽搐至死亡。这两份标本(均为海南岛琼中县采集)已克隆到T载体上进行测序分析(另文发表)。
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上述结果表明：(1)南方一些地区的蚊虫带有除DEN和JEV以外的黄病毒感染；(2)从“不明热”血标本中检测到病毒基因，从细胞培养和乳鼠中也分离到新的虫媒病毒。提示：①我国南方一些地区存在除DEN和JEV外的其它黄病毒感染；②3种蚊虫标本检出阳性率表明，还可能存在新的虫媒病毒疫源地。
* 全军“九五”医学科研基金项目
作者简介：女，1945年出生，汉族，1970年毕业于中山医科大学，研究员，室主任
作者单位：方美玉(广州军区军事医学研究所(邮编 510507))
蒋廉华(广州军区军事医学研究所(邮编 510507))
陈翠华(广州军区军事医学研究所(邮编 510507))
白志军(广州军区军事医学研究所(邮编 510507))
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林立辉(广州军区军事医学研究所(邮编 510507))
刘建伟(广州军区军事医学研究所(邮编 510507))
参考文献
1 Lopatev VN,Cartas MA, Monken CE,et al. An efficient and simple method of DNA extraction from whole blood and cell lines to identify infectious agents. J virol Methods,1991,34∶105.
2 方美玉，陈火胜，陈翠华，等.逆转录-多聚酶链反应扩增黄病毒核酸的研究.中华传染病杂志，1994，12(3)∶145-148.
3 方美玉，陈翠华，陈火胜，等.黄病毒逆转录-聚合酶链反应检测技术的建立和应用.中华实验和临床病毒学杂志，1997，11(3)∶267-270.
4 Meiyu F,Huosheng C,Cuihua C,et al. Detection of flaviviruses by reverse transcriptase-polymerase chain reaction with the universal primer set. Microbiol. Immunol,1997,41(3)∶209-213., http://www.100md.com
摘 要 目的：调查南方地区虫媒病毒感染情况。方法：应用虫媒病毒的通用引物逆转录-聚合酶链反应技术(RT-PCR)。结果：检测110组骚扰阿蚊、90组白纹伊蚊和18组致倦库蚊标本，分别检出15组、9组和2组阳性标本，阳性率分别为13.63%、10%、11.11%；168份发烧病人待查标本中，28份疑似登革热血标本、11份疑似乙型脑炎血标本和3份“不明热”血标本，均扩增出413bp的特异带，证实为虫媒病毒感染。结论：①我国南方地区存在除登革病毒和乙型脑炎病毒外的其它黄病毒感染；②3种蚊虫标本检测出的阳性率表明，还可能存在新虫媒病毒疫源地。
关键词：虫媒病毒 逆转录-聚合酶链反应
虫媒病毒是指一些通过吸血的节肢动物叮咬敏感的脊椎动物而传播疾病的一类病毒。目前我国常见的虫媒病毒感染为登革热和乙型脑炎，主要由蚊虫传播。我国南方地区气候温暖、潮湿，为虫媒病毒病的多发地区，一些不明原因的发烧病人，可能与虫媒病毒感染有关。为加强对虫媒病毒的研究及其流行病学调查，笔者应用本室已建立的RT-PCR技术，检测南方不同地区一批蚊虫标本和发烧待查病人血标本，同时结合微量细胞培养病毒，进行分离鉴定。
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1 材料和方法
1.1 标本来源 1995～1998年4～10月，分别从海南省琼中县大丰农场、万宁县兴隆农场、乐东县尖峰农场、三亚市育才农场和广东省佛山市、番禺沙湾镇及乐昌市坪石镇等地采集蚊虫标本共3 560只，其中白纹伊蚊1 230只，骚扰阿蚊1 730只，致倦库蚊360只，微小按蚊240只。按采集地区和蚊种不同进行分组，-20℃冻死保存。在海南省和广东省不同地区采集发热待查病人血标本168份，于-70℃冻存备用。一方面用于RT-PCR检测，另一方面用于病原体微量培养分离。
1.2 标本RNA制备 将蚊虫标本用无菌生理盐水洗3次，每10或20只为一组研磨，然后加入细胞维持液(内含青霉素和链霉素)，置4℃作用4h，5 000r/min离心5min，取上清300μl加入等体积含异硫氰酸胍和碘化钠溶液，混匀后再加入异丙醇，置室温作用15min，再离心，乙醇洗沉淀物，最后TE缓冲液溶解〔1〕，冻存备用。取发热原因不明血标本300μl，加入等体积含异硫氰酸胍和碘化钠溶液，同样制备RNA。
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1.3 引物 根据文献资料，在虫媒病毒(主要为黄病毒)的NS1基因序列自行设计了一对通用引物，扩增基因序列长度为413bp，在DEN1～4型和JEV的NS1基因序列分别设计了5条内引物，它们分别与通用引物的下游引物配对形成5对内引物，扩增的基因序列长度分别为：DNE1型是262bp，DEN2型为189bp，DEN3型是392bp，DEN4型是97bp，JEV是323bp。上述引物基因序列参阅文献〔2〕。
1.4 病毒 DEN1～4型参考株，由日本Akira Igarashi教授赠送；JEV为日本中山株，本室保存；黄病毒中的黄热病毒(YF)、Powassan(Pow)和Langat(LGT)，为军事医学科学院赠送。各毒株感染C6/36细胞单层，细胞病变达时收毒。
1.5 试剂 异硫氰酸胍和PCR试剂盒，为华美生物工程公司产品，逆转录试剂盒，为Promega公司产品。
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1.6 RNA逆转录 按文献〔2〕操作。
1.7 PCR扩增及电泳分析 首先应用通用引物对标本进行第1次酶促扩增，扩增出特异条带后，应用内引物进行第2次扩增。两次PCR循环均为：93℃ 40s，55℃ 45s，72℃ 60s，分别为30次。PCR产物进行电泳分析，配制含溴化乙锭的1.5%琼脂糖凝胶，取10μl PCR产物电泳，在透射式紫外发生仪上观察，并照相记录实验结果。
2 结果
2.1 蚊虫标本应用通用引物PCR扩增的结果 应用通用引物PCR扩增白纹伊蚊标本90组、骚扰阿蚊110组、致倦库蚊18组、微小按蚊10组，结果发现9组白纹伊蚊标本、15组骚扰阿蚊标本、2组致倦库蚊阳性，阳性率分别为10%、13.63%和11.11%。上述阳性标本均扩增出约413bp的特异条带(图1)，其余标本为阴性。
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图1 阳性蚊虫标本RT-PCR产物的琼脂糖电泳
M.标准分子量；1.海南岛尖峰岭白纹伊蚊；2.海南岛大丰农场致倦库蚊；3.海南岛鹿母湾林场致倦库蚊；4.海南岛大丰农场致倦库蚊
2.2 应用内引物扩增蚊虫标本的结果 应用黄病毒通用引物扩增的阳性蚊虫标本，分别应用DEN1～4型和JEV的内引物再进行PCR扩增，结果26组阳性标本均未扩增出特异条带，表明这些蚊虫的阳性标本不是DEN1～4型和JEV感染所致。
2.3 发热待查的标本应用通用引物扩增的结果 在收集的发烧待查标本中，有53份标本疑似登革热感染，应用通用引物PCR扩增后28份标本为阳性。有20份标本疑似乙型脑炎，应用通用引物扩增阳性11份。余“不明热”血标本95份，扩增阳性标本3份，均扩增出特异条带约413bp(图2)。这3份阳性标本均为海南岛琼中县收集，分别命名为HF4、HF7和HC6。
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图2 “不明热”阳性标本RT-PCR产物的琼脂糖电泳
1.vero-E6细胞阴性对照；M.标准分子量； 2.HF7； 3.HC6； 4.HF4
2.4 应用内引物扩增患者血标本的结果 通用引物PCR扩增登革热28份阳性标本，应用DEN1～4型和JEV的内引物扩增，结果表明：DEN1型阳性18份，DEN2型阳性10份，分别扩增出262bp和189bp的特异条带(图3)。
图3 登革热患者PCR产物的琼脂糖电泳
M.标准分子量； 1～5.DEN1型血清标本； A.通用引物PCR产物； B.内引物PCR产物
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乙型脑炎阳性的11份标本，应用JEV的内引物扩增后，有8份标本扩增出323bp的特异条带，3份标本未能扩增出阳性条带。
“不明热”的3份阳性标本中，应用DEN1～4型和JEV的内引物扩增，未见阳性特异带。
3 讨论
多种虫媒病毒都能感染人和动物，该类病毒感染的临床表现比较复杂，常常被误诊为其它疾病或冠以“不明热”。为了解虫媒病毒在南方地区的感染情况，我们应用自行设计的虫媒病毒通用引物(主要为黄病毒)和DEN1～4型及JEV的内引物，检测了一批南方不同地区采集的蚊虫标本和一批发烧待查病人血标本。上述通用引物和内引物的特异性和敏感性，在我们以前的研究中已证实过〔3-4〕。
应用RT-PCR扩增90组白纹伊蚊标本，有9组阳性；检测110组骚扰阿蚊标本，有15组阳性；18组致倦库蚊，有2组阳性。阳性率分别为10%、13.63%、11.11%。进一步应用DEN1～4型和JEV的内引物扩增，未发现DEN和JEV的特异条带。应用RT-PCR扩增53份疑似登革热血标本，28份标本为阳性；应用内引物扩增后DEN1型阳性18份，DEN2型阳性10份。疑似乙型脑炎标本中，应用通用引物扩增后阳性11份；“不明热”标本中扩增出3份阳性标本。上述结果与我们同时进行的病原分离结果基本一致。其中1株致倦库蚊阳性标本和2株“不明热”病人血阳性标本接种2d龄昆明种乳小白鼠后，可在3d左右发病，乳鼠表现拒奶、侧卧、抽搐至死亡。这两份标本(均为海南岛琼中县采集)已克隆到T载体上进行测序分析(另文发表)。
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上述结果表明：(1)南方一些地区的蚊虫带有除DEN和JEV以外的黄病毒感染；(2)从“不明热”血标本中检测到病毒基因，从细胞培养和乳鼠中也分离到新的虫媒病毒。提示：①我国南方一些地区存在除DEN和JEV外的其它黄病毒感染；②3种蚊虫标本检出阳性率表明，还可能存在新的虫媒病毒疫源地。
* 全军“九五”医学科研基金项目
作者简介：女，1945年出生，汉族，1970年毕业于中山医科大学，研究员，室主任
作者单位：方美玉(广州军区军事医学研究所(邮编 510507))
蒋廉华(广州军区军事医学研究所(邮编 510507))
陈翠华(广州军区军事医学研究所(邮编 510507))
白志军(广州军区军事医学研究所(邮编 510507))
, 百拇医药
林立辉(广州军区军事医学研究所(邮编 510507))
刘建伟(广州军区军事医学研究所(邮编 510507))
参考文献
1 Lopatev VN,Cartas MA, Monken CE,et al. An efficient and simple method of DNA extraction from whole blood and cell lines to identify infectious agents. J virol Methods,1991,34∶105.
2 方美玉，陈火胜，陈翠华，等.逆转录-多聚酶链反应扩增黄病毒核酸的研究.中华传染病杂志，1994，12(3)∶145-148.
3 方美玉，陈翠华，陈火胜，等.黄病毒逆转录-聚合酶链反应检测技术的建立和应用.中华实验和临床病毒学杂志，1997，11(3)∶267-270.
4 Meiyu F,Huosheng C,Cuihua C,et al. Detection of flaviviruses by reverse transcriptase-polymerase chain reaction with the universal primer set. Microbiol. Immunol,1997,41(3)∶209-213., http://www.100md.com