离断海绵体神经诱导大鼠阴茎细胞凋亡的研究
张新华 胡礼泉 郑新民 李世文
摘 要 目的：探讨海绵体神经损伤与阴茎细胞凋亡的关系。方法：实验组大鼠离断双侧海绵体神经，于术后1、2、3、6、9天分别处死动物并取阴茎海绵体，2天组加取阴茎头；对照组仅游离海绵体神经而不损伤，术后两天取材。用ISEL法检测细胞凋亡，2天组进行DNA片段分析。结果：DNA片段分析出现凋亡特征性“梯带”。凋亡率在神经损伤后迅速上升，2天达到高峰，3天后开始下降，9天后基本接近对照组水平。此外，2天组阴茎头与海绵体的凋亡率差异无显著性(P>0.05)。结论：海绵体神经损伤可诱导阴茎细胞发生凋亡，阴茎因细胞凋亡而变小。
关键词：阳萎 动物，实验 凋亡
阳萎是前列腺癌根治术后常见并发症，多由于损伤支配阴茎的神经血管所致[1]。我们通过动物实验来探讨海绵体神经损伤与细胞凋亡的关系，研究阴茎体积变小的分子生物学机制。
, 百拇医药
材料与方法
一、动物分组
SD成年雄性大白鼠(150～200g)30只，随机分为6组，每组5只，分别为1天组、2天组、3天组、6天组、9天组及假手术对照组。实验组动物麻醉后取下腹正中切口，在外科显微镜下于前列腺后外侧叶表面找到海绵体神经[2]，在近端离断，切除5mm左右。对照组仅游离出海绵体神经而不损伤。实验组大鼠于术后1、2、3、6及9天相继处死，对照组于假手术后2天处死。各组取中段阴茎海绵体组织，2天组加取阴茎头。
二、DNA片段分析
取部分2天组及假手术组的海绵体组织，用酚/氯仿法提取DNA，1.5%的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色，紫外灯观察并照相。
三、原位末端标记法(ISEL)检测细胞凋亡
, 百拇医药
各组所取组织用10%中性缓冲福尔马林固定，常规石蜡切片。ISEL具体操作步骤按说明书(德国宝灵曼公司)进行。光学显微镜观察任意10个视野(400倍)并计算凋亡率。阴性对照仅省略T天T步骤。
四、统计方法
实验数据经平方根反正弦变换后用方差分析处理，两两比较用q检验。
结 果
一、DNA片段分析结果
如图1所示，对照组只有一条高相对分子质量的DNA带，2天组出现典型的细胞凋亡梯带，同标准相对分子质量DNA比较，相邻两条带相差约180bp。
图1 2天组海绵体组织DNA片段分析(从右至左依次是实验组，参照组，标样)
, 百拇医药 二、显微照相结果
荧光显微镜下观察凋亡细胞，可见核浓缩、核碎裂及凋亡小体等凋亡细胞的形态特征。光学显微镜下可见2天组海绵体组织中散在的单个凋亡细胞，且数量较多，对照组光学显微镜下偶见1～2个凋亡细胞。
三、各组平均凋亡率
海绵体平均凋亡率1天组为7.26%，2天组为10.10%、阴茎头为9.82%，3天组为4.07%，6天组为3.75%，9天组为0.20%，对照组为0.15%。方差分析示组间差异有显著性(P<0.01)，组间两两比较除3天组与6天组、9天组与对照组、2天组海绵体与阴茎头之间差异无显著性外(P>0.05)，其它任何两组差异均有显著性(P<0.01)。表明海绵体神经损伤诱导阴茎细胞凋亡发生在损伤后的早期，在2天后达到高峰，3天后开始下降，9天后基本停止，且海绵体、阴茎头均发生凋亡。
另外，实验中发现对照组与实验组血管内皮均有少数阳性细胞，认为可能与血管内皮细胞生理降解与再生有关，与神经损伤无关，计数凋亡细胞时避开血管区域。
, 百拇医药
讨 论
细胞凋亡是调节组织器官大小及形态结构的一个基本生物学过程，与临床上许多疾病的发生密切相关[3]。许多病人在前列腺癌根治、膀胱全切、腹会阴联合径路直肠癌根治等手术后，阴茎体积变小，通常认为是损伤支配阴茎的神经引起。本研究结果证实其与细胞凋亡有关。
细胞凋亡时，胞浆内Ca2+增多，激活核酸内切酶，使染色质DNA在核小体接头区发生双链断裂，形成单个和寡核苷酸片段，其碱基数为180～200bp的整数倍，从而在琼脂糖凝胶电泳中呈现梯形分布，这是鉴定是否有凋亡发生最有力的证据。我们对损伤神经2天组的海绵体组织进行了DNA片段分析，出现凋亡特征性梯带。
观察形态学变化是分析细胞凋亡的另一重要方法。我们在荧光显微镜下观察到实验组凋亡细胞核的变化，包括核浓缩、核碎裂、核致密及凋亡小体。而对照组很少有这些变化。
, 百拇医药
我们采用传统的灵敏度比较高的ISEL法对凋亡进行定量分析，采用TdT将荧光素-dUTP标记到凋亡细胞DNA断裂点3’-OH末端，然后经过显色在光学显微镜下计数并计算凋亡率。离断海绵体神经后，阴茎细胞凋亡率迅速上升，2天达到高峰，以后逐渐下降，9天后接近对照组水平。比较2天组海绵体和阴茎头的凋亡率差异无显著性，说明凋亡发生在神经损伤后的早期，并且阴茎发生细胞凋亡。
有关离断海绵体神经诱导细胞凋亡发生的可能机制为影响海绵体神经对阴茎细胞生长因子的调节作用。Tuttle等[4]发现损伤支配大鼠的膀胱神经后，膀胱组织内调节组织生长的神经生长因子(NGF)水平下降，类似现象可发生于阴茎。另一可能机制是海绵体神经切断导致阴茎血供的改变，缺血引起细胞死亡，以及由此而致阴茎变小及性功能障碍。
对于如何防治海绵体神经损伤及其诱导的凋亡，值得进一步探讨。Quinlan等[5]对离断的海绵体神经用显微外科进行吻合并获得成功。凋亡发生时，细胞内Ca2+浓度增加，Ca2+通道阻滞剂可减少凋亡发生[6]。
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作者单位：张新华(武汉，湖北医科大学泌尿男科研究中心 430071)
胡礼泉(武汉，湖北医科大学泌尿男科研究中心 430071)
郑新民(武汉，湖北医科大学泌尿男科研究中心 430071)
李世文(武汉，湖北医科大学泌尿男科研究中心 430071)
参考文献
[1]Walsh PC,Ponker PJ.Impotence following radical prostatectomy:Insight into etiology and prevention.J Urol,1982,128∶492-497.
[2]Quinlan DM,Nelson RJ,Partin AW,et al.The rat as a model for the study of penile erection.J Urol,1989,141∶656-661.
, 百拇医药
[3]Thompson CB.Apoptosis in the pathogenesis and treatment of di-sease.Science,1995,267∶1456-1462.
[4]Tuttle JB,Stears WD,Albo M,et al.Neural input regulates MEF and growth in the adult urinary bladder.J Autonomic Nervous System,1994,49∶2-7.
[5]Quinlan DM,Nelson RJ,Walsh PC.Cavernous nerve grafts restore erectile function in denervated rats.J Urol,1991,145∶380-383.
[6]Peter ME,Heufelder AE,Hengartner MO.Advances in apoptosis research.Proc Natl Acad Sci USA,1997,94∶2736-2737., 百拇医药
摘 要 目的：探讨海绵体神经损伤与阴茎细胞凋亡的关系。方法：实验组大鼠离断双侧海绵体神经，于术后1、2、3、6、9天分别处死动物并取阴茎海绵体，2天组加取阴茎头；对照组仅游离海绵体神经而不损伤，术后两天取材。用ISEL法检测细胞凋亡，2天组进行DNA片段分析。结果：DNA片段分析出现凋亡特征性“梯带”。凋亡率在神经损伤后迅速上升，2天达到高峰，3天后开始下降，9天后基本接近对照组水平。此外，2天组阴茎头与海绵体的凋亡率差异无显著性(P>0.05)。结论：海绵体神经损伤可诱导阴茎细胞发生凋亡，阴茎因细胞凋亡而变小。
关键词：阳萎 动物，实验 凋亡
阳萎是前列腺癌根治术后常见并发症，多由于损伤支配阴茎的神经血管所致[1]。我们通过动物实验来探讨海绵体神经损伤与细胞凋亡的关系，研究阴茎体积变小的分子生物学机制。
, 百拇医药
材料与方法
一、动物分组
SD成年雄性大白鼠(150～200g)30只，随机分为6组，每组5只，分别为1天组、2天组、3天组、6天组、9天组及假手术对照组。实验组动物麻醉后取下腹正中切口，在外科显微镜下于前列腺后外侧叶表面找到海绵体神经[2]，在近端离断，切除5mm左右。对照组仅游离出海绵体神经而不损伤。实验组大鼠于术后1、2、3、6及9天相继处死，对照组于假手术后2天处死。各组取中段阴茎海绵体组织，2天组加取阴茎头。
二、DNA片段分析
取部分2天组及假手术组的海绵体组织，用酚/氯仿法提取DNA，1.5%的琼脂糖凝胶电泳，溴化乙啶染色，紫外灯观察并照相。
三、原位末端标记法(ISEL)检测细胞凋亡
, 百拇医药
各组所取组织用10%中性缓冲福尔马林固定，常规石蜡切片。ISEL具体操作步骤按说明书(德国宝灵曼公司)进行。光学显微镜观察任意10个视野(400倍)并计算凋亡率。阴性对照仅省略T天T步骤。
四、统计方法
实验数据经平方根反正弦变换后用方差分析处理，两两比较用q检验。
结 果
一、DNA片段分析结果
如图1所示，对照组只有一条高相对分子质量的DNA带，2天组出现典型的细胞凋亡梯带，同标准相对分子质量DNA比较，相邻两条带相差约180bp。
图1 2天组海绵体组织DNA片段分析(从右至左依次是实验组，参照组，标样)
, 百拇医药 二、显微照相结果
荧光显微镜下观察凋亡细胞，可见核浓缩、核碎裂及凋亡小体等凋亡细胞的形态特征。光学显微镜下可见2天组海绵体组织中散在的单个凋亡细胞，且数量较多，对照组光学显微镜下偶见1～2个凋亡细胞。
三、各组平均凋亡率
海绵体平均凋亡率1天组为7.26%，2天组为10.10%、阴茎头为9.82%，3天组为4.07%，6天组为3.75%，9天组为0.20%，对照组为0.15%。方差分析示组间差异有显著性(P<0.01)，组间两两比较除3天组与6天组、9天组与对照组、2天组海绵体与阴茎头之间差异无显著性外(P>0.05)，其它任何两组差异均有显著性(P<0.01)。表明海绵体神经损伤诱导阴茎细胞凋亡发生在损伤后的早期，在2天后达到高峰，3天后开始下降，9天后基本停止，且海绵体、阴茎头均发生凋亡。
另外，实验中发现对照组与实验组血管内皮均有少数阳性细胞，认为可能与血管内皮细胞生理降解与再生有关，与神经损伤无关，计数凋亡细胞时避开血管区域。
, 百拇医药
讨 论
细胞凋亡是调节组织器官大小及形态结构的一个基本生物学过程，与临床上许多疾病的发生密切相关[3]。许多病人在前列腺癌根治、膀胱全切、腹会阴联合径路直肠癌根治等手术后，阴茎体积变小，通常认为是损伤支配阴茎的神经引起。本研究结果证实其与细胞凋亡有关。
细胞凋亡时，胞浆内Ca2+增多，激活核酸内切酶，使染色质DNA在核小体接头区发生双链断裂，形成单个和寡核苷酸片段，其碱基数为180～200bp的整数倍，从而在琼脂糖凝胶电泳中呈现梯形分布，这是鉴定是否有凋亡发生最有力的证据。我们对损伤神经2天组的海绵体组织进行了DNA片段分析，出现凋亡特征性梯带。
观察形态学变化是分析细胞凋亡的另一重要方法。我们在荧光显微镜下观察到实验组凋亡细胞核的变化，包括核浓缩、核碎裂、核致密及凋亡小体。而对照组很少有这些变化。
, 百拇医药
我们采用传统的灵敏度比较高的ISEL法对凋亡进行定量分析，采用TdT将荧光素-dUTP标记到凋亡细胞DNA断裂点3’-OH末端，然后经过显色在光学显微镜下计数并计算凋亡率。离断海绵体神经后，阴茎细胞凋亡率迅速上升，2天达到高峰，以后逐渐下降，9天后接近对照组水平。比较2天组海绵体和阴茎头的凋亡率差异无显著性，说明凋亡发生在神经损伤后的早期，并且阴茎发生细胞凋亡。
有关离断海绵体神经诱导细胞凋亡发生的可能机制为影响海绵体神经对阴茎细胞生长因子的调节作用。Tuttle等[4]发现损伤支配大鼠的膀胱神经后，膀胱组织内调节组织生长的神经生长因子(NGF)水平下降，类似现象可发生于阴茎。另一可能机制是海绵体神经切断导致阴茎血供的改变，缺血引起细胞死亡，以及由此而致阴茎变小及性功能障碍。
对于如何防治海绵体神经损伤及其诱导的凋亡，值得进一步探讨。Quinlan等[5]对离断的海绵体神经用显微外科进行吻合并获得成功。凋亡发生时，细胞内Ca2+浓度增加，Ca2+通道阻滞剂可减少凋亡发生[6]。
, 百拇医药
作者单位：张新华(武汉，湖北医科大学泌尿男科研究中心 430071)
胡礼泉(武汉，湖北医科大学泌尿男科研究中心 430071)
郑新民(武汉，湖北医科大学泌尿男科研究中心 430071)
李世文(武汉，湖北医科大学泌尿男科研究中心 430071)
参考文献
[1]Walsh PC,Ponker PJ.Impotence following radical prostatectomy:Insight into etiology and prevention.J Urol,1982,128∶492-497.
[2]Quinlan DM,Nelson RJ,Partin AW,et al.The rat as a model for the study of penile erection.J Urol,1989,141∶656-661.
, 百拇医药
[3]Thompson CB.Apoptosis in the pathogenesis and treatment of di-sease.Science,1995,267∶1456-1462.
[4]Tuttle JB,Stears WD,Albo M,et al.Neural input regulates MEF and growth in the adult urinary bladder.J Autonomic Nervous System,1994,49∶2-7.
[5]Quinlan DM,Nelson RJ,Walsh PC.Cavernous nerve grafts restore erectile function in denervated rats.J Urol,1991,145∶380-383.
[6]Peter ME,Heufelder AE,Hengartner MO.Advances in apoptosis research.Proc Natl Acad Sci USA,1997,94∶2736-2737., 百拇医药