可注射性藻酸钙凝胶载体组织工程性软骨的实验研究
作者：徐虎 胡蕴玉 刘松波 劳克诚
单位：710032西安，第四军医大学西京医院全军骨科研究所
关键词：组织学；生物医学工程；软骨细胞；细胞培养；藻酸盐；钙；水凝胶类对于软骨组
中华骨科杂志000906 【摘要】目的对经体外培养的软骨细胞与藻酸钙凝胶载体复合形成的组织工程性软骨进行组织形态学观察。方法取2周龄新西兰白兔的膝关节软骨细胞，经体外培养两次传代后与藻酸钠溶液复合，使细胞密度为5×106/ml、NaCl0.135mol/L、K2HPO40.1mol/L、藻酸钠的质量分数为1%，然后注入葡萄糖酸钙使终浓度为40mmol/L。在实验组(A、B组)兔的背部皮下注入复合藻酸钙载体的软骨细胞悬液，对照组(C、D组)动物或注入无载体的软骨细胞悬液或注入无细胞的藻酸钙载体，分别于注射后第2周、第4周取材，进行HE和甲苯胺蓝染色。结果实验组，于注射复合软骨细胞的藻酸钙凝胶载体第2周时，HE染色结果显示皮下注射点出现大量软骨细胞增殖，第4周时有软骨组织形成；甲苯胺蓝染色见有软骨细胞和软骨基质形成。在注入无载体的软骨细胞悬液组(C组)，部分动物的皮下注射点有少量软骨组织形成，而在注入无细胞的藻酸钙载体组(D组)则未见软骨形成。结论应用可注射性藻酸钙凝胶载体复合软骨细胞可在同种异体动物体内形成新生软骨组织。
, http://www.100md.com
织缺损的修复，由于所涉及的学科多、方法复杂，故而至今尚无一种满意的修复方法。虽然曾有人应用骨膜组织或骨膜下混合软骨细胞等方法修复关节软骨缺损，但均因远期效果欠佳而影响了其研究价值。近10年来，随着组织工程学研究的发展，出现了在多种新型载体中复合软骨细胞，然后植入体内修复软骨缺损[1-3]，但这些方法均需施行外科手术方可完成。笔者根据水凝胶载体液态、固态可互变的性质，尝试以可注射性藻酸钙凝胶作为软骨细胞载体，注射于同种异体动物的体内，并对所形成的组织工程性软骨进行形态学观察，初步研究结果报告如下。
Experimental study of in vitro culture of chondrocytes combined with injectable calcium alginate gel for neo- cartilage tissue engineering
XU Hu, HU Yunyu, LIU Songbo, et al.
, 百拇医药
(Institute of Orthopaedics, Xijing Hospital, the Fourth Military Medical University,Xi＇an 710032, China)
【Abstract】Objective To observe histomorphology of neo- cartilage obtained with tissue- engineering by combining calcium alginate gel and in vitro cultrue of chondrocytes. Methods Articular chondrocytes from the knee joints of 2- week- old New Zealand white rabbits were harvested, expanded in cell culture, and following the second generation of the culture, the chondrocyte suspension was mixed with calcium alginate gel resulting in a cell density of 5× 10 6/ml. Finally the mixture, which contained 1% sodium alginate, 40 mmol/L calcium gluconate, 0.135 mol/L NaCl, 0.1 mol/L K 2HPO 4 and 5× 10 6 chondrocytes per milliliter, were injected into the dorsal subcutaneous tissue in rabbits of experimental groups (A and B). Animals of the control groups (C and D) were injected with calcium alginate without chondrocytes or chondrocytes without calcium alginate. Specimens were harvested at the 2nd and 4th week after injection, and stained with HE and toluidine blue. Results In the HE stained specimens in the experimental groups, proliferation of chondrocytes was demonstrated at the 2nd week and the formation of neo- cartilage at the 4th week after injection of calcium alginate chondrocyte- composite. Toluidine blue stained specimens showed positive staining of chondrocytes and cartilage matrix of neo- cartilage. In some animals injected with chondrocytes without calcium alginate, relative small amount of neo- cartilage was also formed and no neo- cartilage was observed in animals injected with calcium alginate without chondrocytes. Conclusion Injectable calcium alginate- chondrocyte- composite can induce tissue engineered neo- cartilage in allogenic animal.
, http://www.100md.com
【Key words】Histology; Biomedical engineering; Chondrocytes; Cell culture; Alginates; Calcium; Hydrogels
对于软骨组织缺损的修复，由于所涉及的学科多、方法复杂，故而至今尚无一种满意的修复方法。虽然曾有人应用骨膜组织或骨膜下混合软骨细胞等方法修复关节软骨缺损，但均因远期效果欠佳而影响了其研究价值。近10年来，随着组织工程学研究的发展，出现了在多种新型载体中复合软骨细胞，然后植入体内修复软骨缺损[1-3]，但这些方法均需施行外科手术方可完成。笔者根据水凝胶载体液态、固态可互变的性质，尝试以可注射性藻酸钙凝胶作为软骨细胞载体，注射于同种异体动物的体内，并对所形成的组织工程性软骨进行形态学观察，初步研究结果报告如下。
材料与方法
一、软骨细胞的获取与培养
, 百拇医药
于无菌手术条件下，取约2周龄新西兰大白兔的双侧膝关节软骨，用锐剪剪切成0.5mm见方的碎块，D-Hank液冲洗2次，以质量分数为0.25%的胰蛋白酶(华美公司，西安)37℃消化30min，用D-Hank液冲洗2次，再用质量分数为0.2%的胶原酶(华美公司，西安)冲洗1次，37℃下胶原酶消化2h，取上清液，800r/min离心10min收集细胞。经无血清DMEM培养液(Gibco公司)冲洗后，置入培养瓶，在37℃、体积分数为5%的CO2条件下，用含体积分数为10%的小牛血清(fetal cow serum,FCS)DMEM培养液培养，经胶原酶消化的残渣添加胶原酶后继续消化，每2h收集细胞1次，共3次，培养的软骨细胞3d后换液，2周后铺满，连续传2代。
二、藻酸钠水凝胶的制备
将藻酸钠干粉(分析纯，粘度60%，Fluka公司)溶于含有0.135mol/LNaCl和0.1mol/LK2HPO4的水溶液中，使藻酸钠的质量分数为1%，pH值调至7.4。于121℃高压消毒灭菌30min后，4℃保存备用。
, http://www.100md.com
三、软骨细胞与藻酸钙载体的复合
培养的软骨细胞经质量分数为0.25%的胰蛋白酶消化后，800r/min离心10min浓集，进行细胞计数。然后加入已配制好的藻酸钠溶液使细胞密度为5×106/ml，于无菌条件下注入葡萄糖酸钙使终浓度为40mmol/L,藻酸钠溶液中的藻酸钠分子呈线形，在交联剂钙离子的作用下发生侧向交联形成藻酸钙凝胶，经旋涡振荡器混匀后4℃保存备用。
四、动物实验
3月龄雄性新西兰大白兔24只，体重2～3kg，随机分为A、B、C、D4组，每组6只。分别在A、B两组兔的背部皮下注入复合藻酸钙载体的软骨细胞悬液(实验组)；C组注入无载体的软骨细胞悬液(对照组);D组注入无细胞的藻酸钙载体(对照组)。注射物体积均为200μl，细胞悬液中的细胞密度为5×106/ml。A组于注射后第2周，B、C、D3组均于注射后第4周处死动物。
, http://www.100md.com
五、标本制作和组织学观察
动物处死后，取背部皮下的增殖物及周围粘连组织固定于体积分数为10%的中性甲醛溶液中24h,脱钙24h,漂洗24h,然后脱水、浸蜡、石蜡包埋，制成5μm厚切片,进行HE及甲苯胺蓝染色。
结果
一、软骨细胞的形态学观察
经消化法培养的原代软骨细胞大多呈多角形，细胞核圆形清晰可见(图1)，第1次传代后4d，细胞进入对数生长期，在此期间细胞呈长棱状多角形，细胞外可见一些具有折光性的细胞外基质。
图1 经消化法培养的原代软骨细胞呈多角形 ×200
二、软骨细胞的组织学观察
, 百拇医药
(一)A、B两组动物在注射复合藻酸钙软骨细胞后1周，于注射部位皮下可触及约1cm×1cm大小的圆形包块，质地较软,以后逐渐变硬。
(二)第2或第4周时，A、B两组标本经HE染色可见软骨细胞增殖或软骨组织形成(图2～6)；第4周时，C组有2只动物也见少量软骨组织形成，而D组未见软骨组织形成。
图2 A组，第2周时动物皮下组织中出现大量的增生细胞对注入物形成包裹，该层面以下是大量增殖的软骨细胞，注入物中心为无细胞结构的均质物 HE染色×100
图3 A组，第2周时增殖的软骨细胞排列密集、核圆形、着色深，软骨陷窝不明显，新生软骨组织中有丰富的新生毛细血管，管腔中可见红细胞 HE染色×400
, 百拇医药
图4 A组，第2周时甲苯胺蓝染色显示新生组织中
阳性着色的软骨细胞和软骨基质 甲苯胺蓝染色×400
图5 B组，第4周时新生软骨组织，细胞呈圆形，核圆，着色深，软骨陷窝明显 HE染色×400
图6 B组，第4周可见新生的软骨组织，甲苯胺蓝染色显示新生软骨中
阳性着色的软骨细胞和软骨基质 甲苯胺蓝染色×400
(三)第2周时，A组动物皮下组织中可见大量的增生细胞对注入物形成包裹，在增生组织层面以下是大量增殖的软骨细胞(图2)，细胞排列密集，核圆形，着色深，软骨陷窝不明显，但有少量的软骨细胞已有明显的软骨陷窝，周围有软骨基质形成。新生的软骨组织中有丰富的新生毛细血管，管腔中见红细胞(图3)，甲苯胺蓝染色可见软骨细胞和软骨基质(图4)。新生软骨组织层面下是注射物的中心部分，为无细胞结构的均质样物质。第4周时，在B组标本中可见皮下包块中形成的软骨组织，软骨细胞呈圆形，核圆，着色深，软骨陷窝明显(图5,6)。
, 百拇医药
讨论
对骨与软骨缺损的修复问题一直是矫形外科及其他一些相关学科关注的焦点。骨缺损一般可应用自体骨、同种异体骨甚至异种骨材料进行直接充填，而且充填后缺损部位的功能恢复比较满意。而软骨组织因多处于人体骨骼的重要功能部位，缺损后很难通过简单的软骨组织移植而实现恢复功能之目的。
近年来，由于细胞培养技术的进步，出现了应用组织工程性组织修复或替代如皮肤、胰岛、神经、软骨[4-6]等多种人体组织的方法。美国Vacanti等[7]首先应用细胞培养技术及可降解的生物合成材料细胞外基质(extrocellular matrix,ECM)研制成新的组织工程性软骨组织。在ECM应用之后，组织工程载体的材料学研究迅速发展，人们开始应用聚乳酸(poly-lacticacid,PLA)[2，8]和聚羟基乙酸(polyglycolic acid,PGA)[1]等材料作为细胞支架，这些载体材料大多为固态，应用时需实施外科手术植入体内。但关于液态或凝胶态载体的研究则鲜有报道。我们尝试将液态或凝胶态的生物载体材料复合细胞后注入动物体内，结果表明操作方法简便易行、手术创伤小，具有较好的研究价值和临床应用前景。
, 百拇医药
在以往的体外培养实验中[9]，藻酸钠溶液可以作为软骨细胞的培养液，Paige等[10]的实验研究也已证实，藻酸钙凝胶在体内可作为良好的软骨细胞载体，具有较好的细胞界面关系。在对鼠的体内实验研究中发现，不复合细胞的藻酸钙凝胶可通过酶解方式逐渐降解，但尚不清楚其明确的半衰期。
在实验过程中，我们发现软骨细胞复合于藻酸钙凝胶后，在体内可以透过凝胶形成的网状结构获取营养，维持生存并增殖。在同种异体动物皮下注射复合于藻酸钙凝胶的软骨细胞后，第2周即可出现软骨细胞增殖，而且细胞密度高，软骨基质较少，但多数软骨陷窝尚不明显，软骨组织中并有丰富的新生毛细血管，说明软骨细胞复合于藻酸钙载体植入动物体内后，可逐渐在动物自身血供中获取营养。然而新生的血管可致新生软骨发生软骨内骨化，至第4周时，软骨组织中则少见新生毛细血管(图5)。
在本研究的预实验中，我们取2周龄幼兔的软骨进行原代培养，发现细胞增殖迅速并且经多代传代细胞生长状态仍然稳定。我们亦曾对在下述实验条件下所获得的培养结果进行比较:质量分数为0.5%～2.0%的藻酸钠、钙交联剂含量在20～200mmol/L、软骨细胞密度为1×106/ml～1×107/ml，发现1%的藻酸钠、40mmol/L钙离子是交联的最佳浓度，而细胞密度在1×106/ml～1×107/ml皆可有新生软骨生成。
, http://www.100md.com
本实验结果提示，软骨细胞复合于凝胶状态的生物载体材料可通过注射方式进入动物体内直达缺损部位，并增殖成为软骨组织。说明采用以藻酸钙凝胶为载体的软骨细胞组织修复软骨组织缺损，具有可避免外科手术而直接修复体内软骨缺损的优点，作为液态藻酸钠可更灵活地使藻酸钙载体凝结为不同形状，以适应不同临床需求。在实验中，异体来源的软骨细胞在动物体免疫系统正常的情况下，仍可由异体动物得到血液供应并增殖，说明异体软骨细胞并未引起明显的免疫排斥反应，为今后临床采用同种异体来源的软骨细胞修复软骨缺损提供了可能性。本研究只是一个很初步的起动实验，对于藻酸钙载体在机体中代谢的半衰期以及复合物对关节软骨缺损的修复能力如何、组织工程性软骨在体内的长期转归等问题，还有待于进一步的实验研究。
参考文献
1，Kim WS, Vacanti CA, Upton J, et al. Bone defect repair with tissue-engineered cartilage. Plast Reconstr Surg,1994,94:580-584.
, 百拇医药
2，Cao Y, Vacanti JP, Paige KT, et al. Transplantation of chondrocytes utilizing a polymer-cell construct to produce tissue-engineered cartilage in the shape of a human ear. Plast Reconstr Surg, 1997, 100:297-302.
3，Butnariu-Ephrat M, Robinson D, Mendes DG, et al. Resurfacing of goat articular cartilage by chondrocytes derived from bone marrow. Clin Orthop,1996,(330):234-243.
4，Lacy PE, Hegre OD, Gerasimidi-Vazeou A, et al. Maintenance of normoglycemia in diabetic mice by subcutaneous xenografts of encapsulated islets. Science, 1991, 254:1782-1794.
, 百拇医药
5，Aebischer P, Tressco PA, Winn SR, et al. Long-term cross-species brain transplantation of a polymer-encapsulated dopamine-secreting cell line. Exp Neurol, 1991, 11:269-275.
6，Brittberg M, Lindahl A, Nilsson A, et al. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N Engl J Med, 1994, 331:889-895.
7，Vacanti CA, Langer R, Schloo B, et al. Synthetic polymers seeded with chondrocytes provide a template for new cartilage formation. Plast Reconstr Surg, 1991, 88:753-759.
, 百拇医药
8，Chu CR, Coutts RD, Yoshioka M, et al. Articular cartilage repair using allogeneic perichondrocyte-seeded biodegradable porous polylactic acid(PLA): a tissue- engineering study. J Biomed Mater Res, 1995, 29:1147-1154.
9，Aydelotte MB, Thonar EJ, Mollenhauer J, et al. Culture of chondrocytes in alginate gel: variations in conditions of gelation influence the structure of the alginate gel, and the arrangement and morphology of proliferating chondrocytes. In Vitro Cell Dev Biol Anim, 1998, 34:123-130.
10，Paige KT, Cima LG, Yaremchuk MJ, et al. Injectable cartilage. Plast Reconstr Surg, 1995, 96:1390-1398.
(收稿日期:1999-11-16), 百拇医药
单位：710032西安，第四军医大学西京医院全军骨科研究所
关键词：组织学；生物医学工程；软骨细胞；细胞培养；藻酸盐；钙；水凝胶类对于软骨组
中华骨科杂志000906 【摘要】目的对经体外培养的软骨细胞与藻酸钙凝胶载体复合形成的组织工程性软骨进行组织形态学观察。方法取2周龄新西兰白兔的膝关节软骨细胞，经体外培养两次传代后与藻酸钠溶液复合，使细胞密度为5×106/ml、NaCl0.135mol/L、K2HPO40.1mol/L、藻酸钠的质量分数为1%，然后注入葡萄糖酸钙使终浓度为40mmol/L。在实验组(A、B组)兔的背部皮下注入复合藻酸钙载体的软骨细胞悬液，对照组(C、D组)动物或注入无载体的软骨细胞悬液或注入无细胞的藻酸钙载体，分别于注射后第2周、第4周取材，进行HE和甲苯胺蓝染色。结果实验组，于注射复合软骨细胞的藻酸钙凝胶载体第2周时，HE染色结果显示皮下注射点出现大量软骨细胞增殖，第4周时有软骨组织形成；甲苯胺蓝染色见有软骨细胞和软骨基质形成。在注入无载体的软骨细胞悬液组(C组)，部分动物的皮下注射点有少量软骨组织形成，而在注入无细胞的藻酸钙载体组(D组)则未见软骨形成。结论应用可注射性藻酸钙凝胶载体复合软骨细胞可在同种异体动物体内形成新生软骨组织。
, http://www.100md.com
织缺损的修复，由于所涉及的学科多、方法复杂，故而至今尚无一种满意的修复方法。虽然曾有人应用骨膜组织或骨膜下混合软骨细胞等方法修复关节软骨缺损，但均因远期效果欠佳而影响了其研究价值。近10年来，随着组织工程学研究的发展，出现了在多种新型载体中复合软骨细胞，然后植入体内修复软骨缺损[1-3]，但这些方法均需施行外科手术方可完成。笔者根据水凝胶载体液态、固态可互变的性质，尝试以可注射性藻酸钙凝胶作为软骨细胞载体，注射于同种异体动物的体内，并对所形成的组织工程性软骨进行形态学观察，初步研究结果报告如下。
Experimental study of in vitro culture of chondrocytes combined with injectable calcium alginate gel for neo- cartilage tissue engineering
XU Hu, HU Yunyu, LIU Songbo, et al.
, 百拇医药
(Institute of Orthopaedics, Xijing Hospital, the Fourth Military Medical University,Xi＇an 710032, China)
【Abstract】Objective To observe histomorphology of neo- cartilage obtained with tissue- engineering by combining calcium alginate gel and in vitro cultrue of chondrocytes. Methods Articular chondrocytes from the knee joints of 2- week- old New Zealand white rabbits were harvested, expanded in cell culture, and following the second generation of the culture, the chondrocyte suspension was mixed with calcium alginate gel resulting in a cell density of 5× 10 6/ml. Finally the mixture, which contained 1% sodium alginate, 40 mmol/L calcium gluconate, 0.135 mol/L NaCl, 0.1 mol/L K 2HPO 4 and 5× 10 6 chondrocytes per milliliter, were injected into the dorsal subcutaneous tissue in rabbits of experimental groups (A and B). Animals of the control groups (C and D) were injected with calcium alginate without chondrocytes or chondrocytes without calcium alginate. Specimens were harvested at the 2nd and 4th week after injection, and stained with HE and toluidine blue. Results In the HE stained specimens in the experimental groups, proliferation of chondrocytes was demonstrated at the 2nd week and the formation of neo- cartilage at the 4th week after injection of calcium alginate chondrocyte- composite. Toluidine blue stained specimens showed positive staining of chondrocytes and cartilage matrix of neo- cartilage. In some animals injected with chondrocytes without calcium alginate, relative small amount of neo- cartilage was also formed and no neo- cartilage was observed in animals injected with calcium alginate without chondrocytes. Conclusion Injectable calcium alginate- chondrocyte- composite can induce tissue engineered neo- cartilage in allogenic animal.
, http://www.100md.com
【Key words】Histology; Biomedical engineering; Chondrocytes; Cell culture; Alginates; Calcium; Hydrogels
对于软骨组织缺损的修复，由于所涉及的学科多、方法复杂，故而至今尚无一种满意的修复方法。虽然曾有人应用骨膜组织或骨膜下混合软骨细胞等方法修复关节软骨缺损，但均因远期效果欠佳而影响了其研究价值。近10年来，随着组织工程学研究的发展，出现了在多种新型载体中复合软骨细胞，然后植入体内修复软骨缺损[1-3]，但这些方法均需施行外科手术方可完成。笔者根据水凝胶载体液态、固态可互变的性质，尝试以可注射性藻酸钙凝胶作为软骨细胞载体，注射于同种异体动物的体内，并对所形成的组织工程性软骨进行形态学观察，初步研究结果报告如下。
材料与方法
一、软骨细胞的获取与培养
, 百拇医药
于无菌手术条件下，取约2周龄新西兰大白兔的双侧膝关节软骨，用锐剪剪切成0.5mm见方的碎块，D-Hank液冲洗2次，以质量分数为0.25%的胰蛋白酶(华美公司，西安)37℃消化30min，用D-Hank液冲洗2次，再用质量分数为0.2%的胶原酶(华美公司，西安)冲洗1次，37℃下胶原酶消化2h，取上清液，800r/min离心10min收集细胞。经无血清DMEM培养液(Gibco公司)冲洗后，置入培养瓶，在37℃、体积分数为5%的CO2条件下，用含体积分数为10%的小牛血清(fetal cow serum,FCS)DMEM培养液培养，经胶原酶消化的残渣添加胶原酶后继续消化，每2h收集细胞1次，共3次，培养的软骨细胞3d后换液，2周后铺满，连续传2代。
二、藻酸钠水凝胶的制备
将藻酸钠干粉(分析纯，粘度60%，Fluka公司)溶于含有0.135mol/LNaCl和0.1mol/LK2HPO4的水溶液中，使藻酸钠的质量分数为1%，pH值调至7.4。于121℃高压消毒灭菌30min后，4℃保存备用。
, http://www.100md.com
三、软骨细胞与藻酸钙载体的复合
培养的软骨细胞经质量分数为0.25%的胰蛋白酶消化后，800r/min离心10min浓集，进行细胞计数。然后加入已配制好的藻酸钠溶液使细胞密度为5×106/ml，于无菌条件下注入葡萄糖酸钙使终浓度为40mmol/L,藻酸钠溶液中的藻酸钠分子呈线形，在交联剂钙离子的作用下发生侧向交联形成藻酸钙凝胶，经旋涡振荡器混匀后4℃保存备用。
四、动物实验
3月龄雄性新西兰大白兔24只，体重2～3kg，随机分为A、B、C、D4组，每组6只。分别在A、B两组兔的背部皮下注入复合藻酸钙载体的软骨细胞悬液(实验组)；C组注入无载体的软骨细胞悬液(对照组);D组注入无细胞的藻酸钙载体(对照组)。注射物体积均为200μl，细胞悬液中的细胞密度为5×106/ml。A组于注射后第2周，B、C、D3组均于注射后第4周处死动物。
, http://www.100md.com
五、标本制作和组织学观察
动物处死后，取背部皮下的增殖物及周围粘连组织固定于体积分数为10%的中性甲醛溶液中24h,脱钙24h,漂洗24h,然后脱水、浸蜡、石蜡包埋，制成5μm厚切片,进行HE及甲苯胺蓝染色。
结果
一、软骨细胞的形态学观察
经消化法培养的原代软骨细胞大多呈多角形，细胞核圆形清晰可见(图1)，第1次传代后4d，细胞进入对数生长期，在此期间细胞呈长棱状多角形，细胞外可见一些具有折光性的细胞外基质。
图1 经消化法培养的原代软骨细胞呈多角形 ×200
二、软骨细胞的组织学观察
, 百拇医药
(一)A、B两组动物在注射复合藻酸钙软骨细胞后1周，于注射部位皮下可触及约1cm×1cm大小的圆形包块，质地较软,以后逐渐变硬。
(二)第2或第4周时，A、B两组标本经HE染色可见软骨细胞增殖或软骨组织形成(图2～6)；第4周时，C组有2只动物也见少量软骨组织形成，而D组未见软骨组织形成。
图2 A组，第2周时动物皮下组织中出现大量的增生细胞对注入物形成包裹，该层面以下是大量增殖的软骨细胞，注入物中心为无细胞结构的均质物 HE染色×100
图3 A组，第2周时增殖的软骨细胞排列密集、核圆形、着色深，软骨陷窝不明显，新生软骨组织中有丰富的新生毛细血管，管腔中可见红细胞 HE染色×400
, 百拇医药
图4 A组，第2周时甲苯胺蓝染色显示新生组织中
阳性着色的软骨细胞和软骨基质 甲苯胺蓝染色×400
图5 B组，第4周时新生软骨组织，细胞呈圆形，核圆，着色深，软骨陷窝明显 HE染色×400
图6 B组，第4周可见新生的软骨组织，甲苯胺蓝染色显示新生软骨中
阳性着色的软骨细胞和软骨基质 甲苯胺蓝染色×400
(三)第2周时，A组动物皮下组织中可见大量的增生细胞对注入物形成包裹，在增生组织层面以下是大量增殖的软骨细胞(图2)，细胞排列密集，核圆形，着色深，软骨陷窝不明显，但有少量的软骨细胞已有明显的软骨陷窝，周围有软骨基质形成。新生的软骨组织中有丰富的新生毛细血管，管腔中见红细胞(图3)，甲苯胺蓝染色可见软骨细胞和软骨基质(图4)。新生软骨组织层面下是注射物的中心部分，为无细胞结构的均质样物质。第4周时，在B组标本中可见皮下包块中形成的软骨组织，软骨细胞呈圆形，核圆，着色深，软骨陷窝明显(图5,6)。
, 百拇医药
讨论
对骨与软骨缺损的修复问题一直是矫形外科及其他一些相关学科关注的焦点。骨缺损一般可应用自体骨、同种异体骨甚至异种骨材料进行直接充填，而且充填后缺损部位的功能恢复比较满意。而软骨组织因多处于人体骨骼的重要功能部位，缺损后很难通过简单的软骨组织移植而实现恢复功能之目的。
近年来，由于细胞培养技术的进步，出现了应用组织工程性组织修复或替代如皮肤、胰岛、神经、软骨[4-6]等多种人体组织的方法。美国Vacanti等[7]首先应用细胞培养技术及可降解的生物合成材料细胞外基质(extrocellular matrix,ECM)研制成新的组织工程性软骨组织。在ECM应用之后，组织工程载体的材料学研究迅速发展，人们开始应用聚乳酸(poly-lacticacid,PLA)[2，8]和聚羟基乙酸(polyglycolic acid,PGA)[1]等材料作为细胞支架，这些载体材料大多为固态，应用时需实施外科手术植入体内。但关于液态或凝胶态载体的研究则鲜有报道。我们尝试将液态或凝胶态的生物载体材料复合细胞后注入动物体内，结果表明操作方法简便易行、手术创伤小，具有较好的研究价值和临床应用前景。
, 百拇医药
在以往的体外培养实验中[9]，藻酸钠溶液可以作为软骨细胞的培养液，Paige等[10]的实验研究也已证实，藻酸钙凝胶在体内可作为良好的软骨细胞载体，具有较好的细胞界面关系。在对鼠的体内实验研究中发现，不复合细胞的藻酸钙凝胶可通过酶解方式逐渐降解，但尚不清楚其明确的半衰期。
在实验过程中，我们发现软骨细胞复合于藻酸钙凝胶后，在体内可以透过凝胶形成的网状结构获取营养，维持生存并增殖。在同种异体动物皮下注射复合于藻酸钙凝胶的软骨细胞后，第2周即可出现软骨细胞增殖，而且细胞密度高，软骨基质较少，但多数软骨陷窝尚不明显，软骨组织中并有丰富的新生毛细血管，说明软骨细胞复合于藻酸钙载体植入动物体内后，可逐渐在动物自身血供中获取营养。然而新生的血管可致新生软骨发生软骨内骨化，至第4周时，软骨组织中则少见新生毛细血管(图5)。
在本研究的预实验中，我们取2周龄幼兔的软骨进行原代培养，发现细胞增殖迅速并且经多代传代细胞生长状态仍然稳定。我们亦曾对在下述实验条件下所获得的培养结果进行比较:质量分数为0.5%～2.0%的藻酸钠、钙交联剂含量在20～200mmol/L、软骨细胞密度为1×106/ml～1×107/ml，发现1%的藻酸钠、40mmol/L钙离子是交联的最佳浓度，而细胞密度在1×106/ml～1×107/ml皆可有新生软骨生成。
, http://www.100md.com
本实验结果提示，软骨细胞复合于凝胶状态的生物载体材料可通过注射方式进入动物体内直达缺损部位，并增殖成为软骨组织。说明采用以藻酸钙凝胶为载体的软骨细胞组织修复软骨组织缺损，具有可避免外科手术而直接修复体内软骨缺损的优点，作为液态藻酸钠可更灵活地使藻酸钙载体凝结为不同形状，以适应不同临床需求。在实验中，异体来源的软骨细胞在动物体免疫系统正常的情况下，仍可由异体动物得到血液供应并增殖，说明异体软骨细胞并未引起明显的免疫排斥反应，为今后临床采用同种异体来源的软骨细胞修复软骨缺损提供了可能性。本研究只是一个很初步的起动实验，对于藻酸钙载体在机体中代谢的半衰期以及复合物对关节软骨缺损的修复能力如何、组织工程性软骨在体内的长期转归等问题，还有待于进一步的实验研究。
参考文献
1，Kim WS, Vacanti CA, Upton J, et al. Bone defect repair with tissue-engineered cartilage. Plast Reconstr Surg,1994,94:580-584.
, 百拇医药
2，Cao Y, Vacanti JP, Paige KT, et al. Transplantation of chondrocytes utilizing a polymer-cell construct to produce tissue-engineered cartilage in the shape of a human ear. Plast Reconstr Surg, 1997, 100:297-302.
3，Butnariu-Ephrat M, Robinson D, Mendes DG, et al. Resurfacing of goat articular cartilage by chondrocytes derived from bone marrow. Clin Orthop,1996,(330):234-243.
4，Lacy PE, Hegre OD, Gerasimidi-Vazeou A, et al. Maintenance of normoglycemia in diabetic mice by subcutaneous xenografts of encapsulated islets. Science, 1991, 254:1782-1794.
, 百拇医药
5，Aebischer P, Tressco PA, Winn SR, et al. Long-term cross-species brain transplantation of a polymer-encapsulated dopamine-secreting cell line. Exp Neurol, 1991, 11:269-275.
6，Brittberg M, Lindahl A, Nilsson A, et al. Treatment of deep cartilage defects in the knee with autologous chondrocyte transplantation. N Engl J Med, 1994, 331:889-895.
7，Vacanti CA, Langer R, Schloo B, et al. Synthetic polymers seeded with chondrocytes provide a template for new cartilage formation. Plast Reconstr Surg, 1991, 88:753-759.
, 百拇医药
8，Chu CR, Coutts RD, Yoshioka M, et al. Articular cartilage repair using allogeneic perichondrocyte-seeded biodegradable porous polylactic acid(PLA): a tissue- engineering study. J Biomed Mater Res, 1995, 29:1147-1154.
9，Aydelotte MB, Thonar EJ, Mollenhauer J, et al. Culture of chondrocytes in alginate gel: variations in conditions of gelation influence the structure of the alginate gel, and the arrangement and morphology of proliferating chondrocytes. In Vitro Cell Dev Biol Anim, 1998, 34:123-130.
10，Paige KT, Cima LG, Yaremchuk MJ, et al. Injectable cartilage. Plast Reconstr Surg, 1995, 96:1390-1398.
(收稿日期:1999-11-16), 百拇医药