鼻咽癌染色体7q32区域微缺失的研究
唐湘娜 阳剑波 邓龙文 江宁 周鸣 曾朝阳 谢奕 谭国林 邱元正 李桂源
摘 要 目的 进一步明确鼻咽癌染色体7q32的D7S500-D7S495附近区域高频率等位基因缺失的范围。方法 采用更高密度的微卫星标记位点，分析30个鼻咽癌病例等位基因杂合性缺失的情况。结果30例患者中有19例(63.3%)存在杂合性缺失；D7S500-D7S509-D7S495是高频率缺失集中的区域，共同缺失区在D7S509附近。结论 D7S509附近可能存在与鼻咽癌发病相关的抑癌基因。
关键词：鼻咽癌；染色体7q32；等位基因缺失；抑癌基因
鼻咽癌是我国南方各省高发的恶性肿瘤。据估计，世界上80%的病例发生在这些地区，故又称“中国癌”。流行病学调查结果显示，其发病与遗传、EB病毒及环境中某些理化因素有关，发病率因种族、地区、年龄不同而差异显著[1]。以往限制性酶切片段长度多态性研究发现7q32至末端有非随机的缺失[2]。近期分子遗传学研究发现，在7q32的微卫星位点D7S500-D7S495附近区域存在高频率的等位基因杂合性缺失(loss of heterozygosity, LOH)，遗传距离约9.8 cM，且与原发灶肿瘤组织大小、淋巴结转移情况及临床分期无显著相关(P>0.05)，提示该缺失区可能存在与鼻咽癌发病相关的抑瘤基因[3]。为进一步明确7q32的缺失范围，找出最小共同缺失区，我们从Internet网(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)查到D7S500-D7S495区域之间及与之毗邻的所有尚未研究的微卫星位点：D7S2452，D7S509，D7S2560，分析了30个鼻咽癌病例等位基因杂合性缺失的情况。
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1 材料与方法
1.1 标本 鼻咽癌原发灶活检组织和配对外周血，由湖南医科大学湘雅医院和附属第三医院提供，肿瘤组织含量超过70%，病理诊断均为低分化鳞癌，活检前未经放疗、化疗。
1.2 DNA抽提 参照《分子克隆》有关章节提供的方法[4]，经蛋白酶K消化后，苯酚、氯仿抽提肿瘤活检组织、配对正常鼻咽上皮和外周血白细胞基因组DNA，溶解于亚沸水，-20 ℃保存。
1.3 PCR反应 所有微卫星标记引物购自Research Genetic公司。PCR反应体系为50 μl，含基因组DNA100～200 ng，4种dNTP各200 μmol/L，上、下游引物各0.3 μmol/L，Taq酶1.5 U(购自华美公司)，10×PCR反应缓冲液5 μl(MgCl2 1.5 mmol/L,Tris.HCl 10 mmol/L, KCl 50 mmol/L)。反应参数为94 ℃1 min，52～60 ℃1 min，72 ℃1 min，32～35个循环，最后72 ℃延伸10 min。
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1.4 电泳及染色 5～8 μl PCR反应产物稀释于5 μl甲酰胺载样缓冲液，上样于含8 mol/L尿素的6%～8%变性聚丙烯酰胺凝胶，550～600 V电泳2.5～3 h后，用0.2%AgNO3溶液染色约15 min，在含1.5%NaOH和0.5%甲醛的水溶液中显色约5 min，比较肿瘤组织DNA及配对正常DNA的PCR扩增产物，即微卫星位点的等位基因[5]。
1.5 杂合性缺失的判断 肿瘤组织的1对等位基因缺少1条或其中1条的相对密度减少大于50%，认为是杂合性缺失。所有阳性和可疑病例重复实验。
2 结果
2.1 微卫星位点等位基因杂合性缺失 30个病例的临床分期为：Ⅰ期2例(男女各1例)，Ⅱ期9例(男5例，女4例)，Ⅲ期16例(男12例，女4例)，Ⅳ期3例(均为男性)。在7q32的D7S631-D7S500-D7S495区域及毗邻微卫星位点，等位基因杂合性缺失有代表性的LOH分析凝胶照片如图1所示，缺失情况总结为图2，其中D7S500和D7S495的缺失情况引自参考文献[3]。在这30个病例中，19例出现微卫星位点等位基因杂合性缺失，缺失率为63.3%(19/30)。高频率缺失集中在D7S500-D7S509-D7S495，缺失率分别是45%、39%和46%；而紧邻D7S500和D7S495的位点D7S2452和D7S2560则显著降低，分别是23%和10%。19例中有7例表现为连续的片段性缺失，共有13例不止一个位点存在缺失。
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2.2 共同缺失区 我们选出有片段性缺失的7例(例1、2、3、7、8、19和21)作染色体缺失区重叠图(如图3)。显示出最小共同缺失区位于D7S509附近，距其相邻的微卫星位点D7S500和D7S495分别为2.9 cM和1.2 cM。D7S631的缺失情况引自参考文献[3]。
2.3 杂合性缺失与临床分期 用χ2检验分析杂合性缺失与临床分期无显著相关(表1)。
表1 LOH和临床分期的相关性分析
Table 1 Correlation analysis between LOH and clinical stage
Clinical stage
(临床分期)
, 百拇医药 No.of
cases
(例数)
+LOH
(重复序列
有缺失)
-LOH
(重复序列
无缺失)
P value
(P值)
Ⅰor Ⅱ(early stage)
(早期)
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11
6
5
0.2295
Ⅲ or Ⅳ(late stage)
(晚期)
19
13
6
>0.05
, http://www.100md.com 图1 代表性微卫星多态性位点LOH分析银染凝胶照片 T：鼻咽癌活检组织DNA的PCR扩增片段；N：配对的外周血DNA扩增片段；箭头：缺失的等位基因
Fig 1 Representative silver-stained polyacrymide gels with NPC tumor (T) and corresponding normal leukocytes (N) are shown Arrow indicates allelic loss
3 讨论
流行病学调查显示鼻咽癌发病具有明显的种族、家族聚集现象[1]，分子遗传学和细胞遗传学研究发现鼻咽癌患者基因组有遗传脆性[6，7]。上述资料提示遗传物质的异常，即基因组DNA的损伤是鼻咽癌的重要病因之一。
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图2 鼻咽癌7q32区域精细微卫星位点等位基因杂合性缺失图 ■表示杂合子有缺失；□表示杂合子无缺失；○表示纯合子无缺失；●表示纯合性缺失
Fig 2 Result of LOH analysis using microsatellite markers LOH(■)；retention of heterozygosity(□); retention of homozygosity(○); homozygous deletion(●)
图3 染色体缺失区重叠图 ■示表有缺失的区域；□表示无缺失的区域
Fig 3 Summary of deletion in tumor 1,2,3,7,8,19,21 with contiguous LOH Deleted region(■), no deletion(□)
, 百拇医药
迄今为止，已知抑癌基因如p53、p21、RB、VHL、MDM2在鼻咽癌中DNA水平无明显异常[8-13]，排除了它们在鼻咽上皮恶变过程中起重要作用的可能性，p16基因是否为鼻咽癌相关的抑瘤基因各家报道不一[14，15]。因此，寻找鼻咽癌相关抑瘤基因的出路是克隆和定位新的抑癌基因。
等位基因杂合性缺失分析在肿瘤相关的抑瘤基因的定位和克隆上有突出的价值，例如结肠癌染色体5q21存在高频率的等位基因杂合性缺失[16]，从这个位点获得了APC基因[17]。此外，LOH也可能是肿瘤基因组不稳定的结果，这类LOH一般频率低，且与肿瘤进展的指标显著相关。
据报道，人类染色体7q31-ter在多种恶性肿瘤中存在不同程度、不同区域的缺失，肾细胞癌、乳腺癌、前列腺癌、进展期卵巢癌、其它头颈部肿瘤和肠癌等在7q31区域有缺失[18-22]，其中D7S522位点的缺失报道较多，这些缺失多与临床分期相关，即中晚期病例发生缺失的频率较早期病例显著增高，提示7q31的缺失可能与这些肿瘤转移相关；将7号染色体转入人绒毛癌细胞株和鳞癌细胞株细胞均可使其恶性表型明显缓解[23，24]，推测该染色体上可能存在一个或多个抑瘤基因。
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我们曾用限制性酶切片段长度多态性的方法，发现鼻咽癌7q32-ter有染色体片段缺失，近期的分子遗传学研究更将缺失定在7q32的D7S631-D7S500-D7S495，遗传距离约9.8 cM。在本研究中我们发现共同缺失在D7S509附近，与肿瘤进展与否不相关，提示该缺失是鼻咽上皮癌变早期的分子事件，故可能是散发鼻咽癌的病因之一。
有研究小组采用比较基因组杂交的方法发现鼻咽癌3p和11q有大片段的染色体缺失，而未发现7q有明显异常[25]。由于该方法在确定染色体缺失方面，敏感性相对较低，不完全缺失的范围要达到3～5 Mb才能检测出，且还受计算机图像分辨能力的影响，所以不能发现相对较小的DNA缺失。
目前人类染色体7q32-ter尚无抑瘤基因被克隆和定位，鼻咽癌特异相关的抑瘤基因尚未被发现，因此，寻找新的抑瘤基因显得非常重要而且迫切。我们的研究为进一步克隆和定位新的抑瘤基因、进一步阐明鼻咽癌的病因提供了新的、明确的线索。
, 百拇医药
基金项目：国家“863”项目(102-10-01-05)，国家自然科学基金项目(39700158)
通信作者：唐湘娜(E-mail:ligy@public.cs.hn.cn)
作者单位：唐湘娜(410078 长沙，湖南医科大学肿瘤研究所)
阳剑波(410078 长沙，湖南医科大学肿瘤研究所)
邓龙文(410078 长沙，湖南医科大学肿瘤研究所)
江宁(410078 长沙，湖南医科大学肿瘤研究所)
周鸣(410078 长沙，湖南医科大学肿瘤研究所)
曾朝阳(410078 长沙，湖南医科大学肿瘤研究所)
, 百拇医药
谢奕(410078 长沙，湖南医科大学肿瘤研究所)
李桂源(410078 长沙，湖南医科大学肿瘤研究所)
谭国林(附属第三医院耳鼻喉科)
邱元正(湘雅医院耳鼻喉科)
参考文献
[1]Hildesheim A, Levin P. Etiology of nasopharyngeal carcinoma： a review. Epidemiol Rev, 1993, 15∶446-485.
[2]Cheng XG, Yao KT. First Acadmic Annual Meeting of Youths Proceedinys of China. Bejing:China Scientific and Technological Publishing Company, 1992.48.[陈孝光，姚开泰.中国科协首届青年学术论文集.北京：中国科学技术出版社，1992.48.]
, 百拇医药
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[4]Sambrook J, Fritsch EF, Maniatis T. Molecular cloning. A Laboratory Manual. 2nd ed. Bejing:Science Press,1989.464-467.[J.萨姆布鲁克，EF.弗里其，T.曼尼阿蒂斯.分子克隆实验指南.金冬雁，黎孟枫译.第2版.北京：科学出版社，1989.464-467.]
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[25]Guo Y, Fan Y, Liang QW, et al.Chromosome abberations in 47 nasopharyngeal carcinoma. Cancer,1999,18∶5-8.[郭颖，方嬿，梁启万，等.47例鼻咽癌遗传变异的研究.癌症，1999，18：5-8.], 百拇医药
摘 要 目的 进一步明确鼻咽癌染色体7q32的D7S500-D7S495附近区域高频率等位基因缺失的范围。方法 采用更高密度的微卫星标记位点，分析30个鼻咽癌病例等位基因杂合性缺失的情况。结果30例患者中有19例(63.3%)存在杂合性缺失；D7S500-D7S509-D7S495是高频率缺失集中的区域，共同缺失区在D7S509附近。结论 D7S509附近可能存在与鼻咽癌发病相关的抑癌基因。
关键词：鼻咽癌；染色体7q32；等位基因缺失；抑癌基因
鼻咽癌是我国南方各省高发的恶性肿瘤。据估计，世界上80%的病例发生在这些地区，故又称“中国癌”。流行病学调查结果显示，其发病与遗传、EB病毒及环境中某些理化因素有关，发病率因种族、地区、年龄不同而差异显著[1]。以往限制性酶切片段长度多态性研究发现7q32至末端有非随机的缺失[2]。近期分子遗传学研究发现，在7q32的微卫星位点D7S500-D7S495附近区域存在高频率的等位基因杂合性缺失(loss of heterozygosity, LOH)，遗传距离约9.8 cM，且与原发灶肿瘤组织大小、淋巴结转移情况及临床分期无显著相关(P>0.05)，提示该缺失区可能存在与鼻咽癌发病相关的抑瘤基因[3]。为进一步明确7q32的缺失范围，找出最小共同缺失区，我们从Internet网(http://www.ncbi.nlm.nih.gov)查到D7S500-D7S495区域之间及与之毗邻的所有尚未研究的微卫星位点：D7S2452，D7S509，D7S2560，分析了30个鼻咽癌病例等位基因杂合性缺失的情况。
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1 材料与方法
1.1 标本 鼻咽癌原发灶活检组织和配对外周血，由湖南医科大学湘雅医院和附属第三医院提供，肿瘤组织含量超过70%，病理诊断均为低分化鳞癌，活检前未经放疗、化疗。
1.2 DNA抽提 参照《分子克隆》有关章节提供的方法[4]，经蛋白酶K消化后，苯酚、氯仿抽提肿瘤活检组织、配对正常鼻咽上皮和外周血白细胞基因组DNA，溶解于亚沸水，-20 ℃保存。
1.3 PCR反应 所有微卫星标记引物购自Research Genetic公司。PCR反应体系为50 μl，含基因组DNA100～200 ng，4种dNTP各200 μmol/L，上、下游引物各0.3 μmol/L，Taq酶1.5 U(购自华美公司)，10×PCR反应缓冲液5 μl(MgCl2 1.5 mmol/L,Tris.HCl 10 mmol/L, KCl 50 mmol/L)。反应参数为94 ℃1 min，52～60 ℃1 min，72 ℃1 min，32～35个循环，最后72 ℃延伸10 min。
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1.4 电泳及染色 5～8 μl PCR反应产物稀释于5 μl甲酰胺载样缓冲液，上样于含8 mol/L尿素的6%～8%变性聚丙烯酰胺凝胶，550～600 V电泳2.5～3 h后，用0.2%AgNO3溶液染色约15 min，在含1.5%NaOH和0.5%甲醛的水溶液中显色约5 min，比较肿瘤组织DNA及配对正常DNA的PCR扩增产物，即微卫星位点的等位基因[5]。
1.5 杂合性缺失的判断 肿瘤组织的1对等位基因缺少1条或其中1条的相对密度减少大于50%，认为是杂合性缺失。所有阳性和可疑病例重复实验。
2 结果
2.1 微卫星位点等位基因杂合性缺失 30个病例的临床分期为：Ⅰ期2例(男女各1例)，Ⅱ期9例(男5例，女4例)，Ⅲ期16例(男12例，女4例)，Ⅳ期3例(均为男性)。在7q32的D7S631-D7S500-D7S495区域及毗邻微卫星位点，等位基因杂合性缺失有代表性的LOH分析凝胶照片如图1所示，缺失情况总结为图2，其中D7S500和D7S495的缺失情况引自参考文献[3]。在这30个病例中，19例出现微卫星位点等位基因杂合性缺失，缺失率为63.3%(19/30)。高频率缺失集中在D7S500-D7S509-D7S495，缺失率分别是45%、39%和46%；而紧邻D7S500和D7S495的位点D7S2452和D7S2560则显著降低，分别是23%和10%。19例中有7例表现为连续的片段性缺失，共有13例不止一个位点存在缺失。
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2.2 共同缺失区 我们选出有片段性缺失的7例(例1、2、3、7、8、19和21)作染色体缺失区重叠图(如图3)。显示出最小共同缺失区位于D7S509附近，距其相邻的微卫星位点D7S500和D7S495分别为2.9 cM和1.2 cM。D7S631的缺失情况引自参考文献[3]。
2.3 杂合性缺失与临床分期 用χ2检验分析杂合性缺失与临床分期无显著相关(表1)。
表1 LOH和临床分期的相关性分析
Table 1 Correlation analysis between LOH and clinical stage
Clinical stage
(临床分期)
, 百拇医药 No.of
cases
(例数)
+LOH
(重复序列
有缺失)
-LOH
(重复序列
无缺失)
P value
(P值)
Ⅰor Ⅱ(early stage)
(早期)
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11
6
5
0.2295
Ⅲ or Ⅳ(late stage)
(晚期)
19
13
6
>0.05
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Fig 1 Representative silver-stained polyacrymide gels with NPC tumor (T) and corresponding normal leukocytes (N) are shown Arrow indicates allelic loss
3 讨论
流行病学调查显示鼻咽癌发病具有明显的种族、家族聚集现象[1]，分子遗传学和细胞遗传学研究发现鼻咽癌患者基因组有遗传脆性[6，7]。上述资料提示遗传物质的异常，即基因组DNA的损伤是鼻咽癌的重要病因之一。
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图2 鼻咽癌7q32区域精细微卫星位点等位基因杂合性缺失图 ■表示杂合子有缺失；□表示杂合子无缺失；○表示纯合子无缺失；●表示纯合性缺失
Fig 2 Result of LOH analysis using microsatellite markers LOH(■)；retention of heterozygosity(□); retention of homozygosity(○); homozygous deletion(●)
图3 染色体缺失区重叠图 ■示表有缺失的区域；□表示无缺失的区域
Fig 3 Summary of deletion in tumor 1,2,3,7,8,19,21 with contiguous LOH Deleted region(■), no deletion(□)
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迄今为止，已知抑癌基因如p53、p21、RB、VHL、MDM2在鼻咽癌中DNA水平无明显异常[8-13]，排除了它们在鼻咽上皮恶变过程中起重要作用的可能性，p16基因是否为鼻咽癌相关的抑瘤基因各家报道不一[14，15]。因此，寻找鼻咽癌相关抑瘤基因的出路是克隆和定位新的抑癌基因。
等位基因杂合性缺失分析在肿瘤相关的抑瘤基因的定位和克隆上有突出的价值，例如结肠癌染色体5q21存在高频率的等位基因杂合性缺失[16]，从这个位点获得了APC基因[17]。此外，LOH也可能是肿瘤基因组不稳定的结果，这类LOH一般频率低，且与肿瘤进展的指标显著相关。
据报道，人类染色体7q31-ter在多种恶性肿瘤中存在不同程度、不同区域的缺失，肾细胞癌、乳腺癌、前列腺癌、进展期卵巢癌、其它头颈部肿瘤和肠癌等在7q31区域有缺失[18-22]，其中D7S522位点的缺失报道较多，这些缺失多与临床分期相关，即中晚期病例发生缺失的频率较早期病例显著增高，提示7q31的缺失可能与这些肿瘤转移相关；将7号染色体转入人绒毛癌细胞株和鳞癌细胞株细胞均可使其恶性表型明显缓解[23，24]，推测该染色体上可能存在一个或多个抑瘤基因。
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我们曾用限制性酶切片段长度多态性的方法，发现鼻咽癌7q32-ter有染色体片段缺失，近期的分子遗传学研究更将缺失定在7q32的D7S631-D7S500-D7S495，遗传距离约9.8 cM。在本研究中我们发现共同缺失在D7S509附近，与肿瘤进展与否不相关，提示该缺失是鼻咽上皮癌变早期的分子事件，故可能是散发鼻咽癌的病因之一。
有研究小组采用比较基因组杂交的方法发现鼻咽癌3p和11q有大片段的染色体缺失，而未发现7q有明显异常[25]。由于该方法在确定染色体缺失方面，敏感性相对较低，不完全缺失的范围要达到3～5 Mb才能检测出，且还受计算机图像分辨能力的影响，所以不能发现相对较小的DNA缺失。
目前人类染色体7q32-ter尚无抑瘤基因被克隆和定位，鼻咽癌特异相关的抑瘤基因尚未被发现，因此，寻找新的抑瘤基因显得非常重要而且迫切。我们的研究为进一步克隆和定位新的抑瘤基因、进一步阐明鼻咽癌的病因提供了新的、明确的线索。
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基金项目：国家“863”项目(102-10-01-05)，国家自然科学基金项目(39700158)
通信作者：唐湘娜(E-mail:ligy@public.cs.hn.cn)
作者单位：唐湘娜(410078 长沙，湖南医科大学肿瘤研究所)
阳剑波(410078 长沙，湖南医科大学肿瘤研究所)
邓龙文(410078 长沙，湖南医科大学肿瘤研究所)
江宁(410078 长沙，湖南医科大学肿瘤研究所)
周鸣(410078 长沙，湖南医科大学肿瘤研究所)
曾朝阳(410078 长沙，湖南医科大学肿瘤研究所)
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谢奕(410078 长沙，湖南医科大学肿瘤研究所)
李桂源(410078 长沙，湖南医科大学肿瘤研究所)
谭国林(附属第三医院耳鼻喉科)
邱元正(湘雅医院耳鼻喉科)
参考文献
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