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编号:10501981
用温度调控高效液相色谱探索基因组单核苷酸多态性的方法研究
http://www.100md.com 《中华医学遗传学杂志》 2000年第3期
     廖林川 孟海英 侯一平 张思仲 颜有仪 苏智广 李英碧 吴瑾 张霁

    摘 要 目的 优化并评估一种新的探索基因组单核苷酸多态(single nucleotide polymorphism,SNP)的温度调控高效液相色谱技术。方法 从洗脱方式、洗脱温度、检测器流通池规格、适应片段大小、检测灵敏度等方面,探讨适合探索基因组SNP的温度调控高效液相色谱技术参数及实用价值。结果 找到在普通高效液相色谱仪上检测SNP的具有普遍意义的色谱条件。dNTP、PCR引物峰与被检测PCR产物峰完全分离,纯合子和杂合子样本能有效区分。建立起在普通高效液相色谱仪上进行快速筛选突变型DNA的温度调控高效液相色谱法。结论 温度调控高效液相色谱法是一种高效、灵敏、操作简便、对较大片段具有普遍适用意义的探索基因组SNP方法。

    关键词:温度调控高效液相色谱法;变性高效液相色谱法;单核苷酸多态性

    温度调控高效液相色谱法(temperature-modulated high-performance liquid chromatography, TmHPLC),又称为变性高效液相色谱法(de-naturing high performance liquid chromatography,DHPLC)[1],它是一种新的高通量筛选DNA序列多态性的技术。这一技术最先由美国Stanford大学Oefner及Underhill等[2]于1995年报道,其原理是用离子对反向高效液相色谱法分离并检测异源双链。该方法具有半自动化、快速、检出率高、适合大片段等优点[3,4]。Jin及Underhill等[5,6]将其用于基因序列的比较、人类基因多态性的系统研究,已有采用该原理的专利化仪器, 称为WAVE DNA片段分析系统。目前已有多个实验室开始采用WAVE系统进行DNA突变的检测及疾病相关性研究[7-9]。我们注意到高效液相色谱仪是已经在广泛使用的仪器,如果能够在普通高效液相色谱仪上进行单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)分析,无疑可以为SNP分析提供一种具有推广意义的技术选择。因此,我们通过实验系统地研究了各种技术条件,用普通的高效液相色谱仪和分析柱建立了具有普遍适用意义的、优化的SNP检测方法。
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    1 材料和方法

    1.1 仪器 高效液相色谱仪(美国惠普HP1100);紫外可见分光光度计(日本岛津UV-260)。

    1.2 试剂 TEAA(色谱纯,PE),EDTA(色谱纯,Fluka),乙腈(色谱纯,Fisher),超纯水(电阻>18 MΩ),其它试剂均为色谱纯。

    1.3 样本 100 bp为间距的DNA分子量标准物(Pharmacia),及来源于人类基因组由PCR扩增所得的长度分别为148 bp、178 bp、269 bp、272 bp的DNA片段。

    1.4 聚合酶链反应

    1.4.1 DNA提取 Chelex法提取DNA[10]

    1.4.2 聚合酶链反应 我们设计的4对引物是针对Homo sapiens UWGC克隆和GGAT3G09克隆的5′agctcgcacgtccttagtgg和5′agccagcgtcacgttcaacg,5′atgtacattctgtgccacga和5′ggtcaagcaccaggtcgcgt,5′tgccgggaatgctataacatt和5′attgggttctttggaactgg,5′cccacactgggaccgcggtt和5′ccaattacggacgttcagtg。每一反应体系含模板DNA2~40 ng,1×Taq缓冲液,1.5 mmol/L MgCl2,150 μmol/L dNTP,2 U Taq DNA聚合酶(Gibco/BRL),每种引物0.25 μmol/L,反应体积50 μl。在热循环仪(Biometra)中94 ℃变性1 min,60 ℃退火1 min,72 ℃延伸1 min,循环32次。产物用聚丙酰胺凝胶水平电泳确证。
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    1.4.3 PCR产物定量 取30 μl PCR产物,稀释成3 ml。用单引物浓度为0.25 μmol/L的1对引物溶液为空白对照,检测3个PCR产物在波长260 nm处的吸收度值。

    1.5 DNA序列分析 用PCR循环测序法和ABI377自动激光荧光测序仪进行DNA序列分析。

    1.6 温度调控高效液相色谱分析 将制备好的样本在色谱仪上进样、检测、记录和分析。以已知杂合子样本和纯合子样本色谱峰的保留时间和对称性,以及色谱图的基线、柱效等作为指标,对如下色谱条件进行摸索、筛选。(1)固定相:惠普dsDNA不锈钢柱(75 mm×2.1 mmi.d.,3.5 μm,填料为表面涂布有机涂料的硅化物);同样填料的短柱(12.5 mm×4.6 mmi.d.,10 μm)作保护柱。(2)流动相:A液是TEAA和EDTA混合液;B液为A液中加入乙腈,将A液和B液按不同比例混合进行梯度洗脱。(3)柱温、流速及紫外检测波长根据片段大小,先从室温逐渐升高,并参考http://www.insertion.stanford.edu/melt.html中查得的推荐温度,流速0.2~0.8 ml/min。流通池分别为13 μl、5 μl及1.7 μl的检测器,紫外检测波长:260 nm,254 nm,参比波长:360 nm;同时收集紫外全光谱数据。
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    2 结果与讨论

    2.1 DNA序列测定 PCR产物经测序确定存在有突变,以长度为178 bp的DNA片段为例,测序结果如图1。选取其中的杂合子和部分纯合子用于TmHPLC。t20501.gif (9843 bytes)

    图1 长度为178 bp等位DNA片段的测序结果 A:变异型,第75位有1个A→G突变; B:野生型

    Fig 1 Sequences of two alleles One of them includes a single nucleotide mutation;A:DNA sequence,which includes an‘A’to‘G’mutation;B:DNA sequence,which has no mutation
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    2.2 流动相 为寻找适合分离引物及PCR产物的流动相条件,先在不变温状态下用DNA分子量标准品对下列流动相逐一筛选:(1)A液:0.05 mol/L TEAA,0.1 mmol/L EDTA;B液:0.05 mol/L TEAA,0.1 mmol/L EDTA,25%乙腈。(2)A液:0.1 mol/L TEAA,0.1 mmol/L EDTA;B液:0.1 mol/L TEAA,0.1 mmol/L EDTA,25%乙腈。(3)A液:0.2 mol/L TEAA,0.1 mmol/L EDTA;B液:0.2 mol/L TEAA,0.1 mmol/L EDTA,25%乙腈。然后用推荐温度并结合其他条件逐一考察拟选的流动相对色谱峰的保留时间、对称性、基线、柱效和色谱图等各项指标的影响。结果表明,条件(2)的分离效果最好,基线平稳。

    2.3 洗脱梯度 我们采用的流动相中B液含乙腈浓度不超过25%,且由低到高进行洗脱使水溶性的DNA样品不致沉积在柱头,而先被洗脱出来,再用含乙腈浓度较高的流动相及双倍流速使杂质尽量被洗出,为下一次进样做准备。由图2A、B和C可以看出,随着流动相B在洗脱液中所占比例的增加,DNA样品在分析柱上的保留时间逐渐缩短。DNA样品在分析柱上的保留时间越短,色谱峰的峰高及宽峰之比越大。流动相中TEAA的主要作用是与DNA分子形成离子对,使DNA分子呈电中型,吸附在经硅烷基化处理色谱柱上。流动相中的乙腈是作为洗脱溶剂,将TEAA和DNA分子复合体从色谱柱上洗脱。t20601.gif (4840 bytes)
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    图2 流动相中B液所占比例对分子量分型标准物中DNA片段洗脱保留时间的影响 B液比例:A>B>C

    Fig 2 The effect on retention time of fragment eluted by mobile B in differential ratio The ratio of B in mobile:A>B>C

    2.4 洗脱温度 实验中发现随着柱温的提高,DNA分子的保留时间缩短。272 bp的DNA样品在不同温度条件下的检测结果如图3。61.5 ℃时,该样品的保留时间是5.08 min;63.5 ℃时保留时间是4.18 min;65.5 ℃时是3.53 min。

    另一方面,使用Stanford大学软件推荐的温度检测一定数量的样本后,未能观察到野生型和突变型的杂合子时,难以判断是所测样本在该DNA片段上确实不存在序列多态,还是由于温度不当没有检测出。此时对温度在±2℃范围作适当调整,观察峰高与峰宽的比值是否发生改变,可以间接判断选择的洗脱温度是否合适。同时,也有助于观察到原温度条件下不能检测出的序列多态,可提高检出率。t20602.gif (3343 bytes)
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    图3 不同温度对272 bp DNA片段洗脱保留时间的影响 A:61.5 ℃;B:63.5 ℃;C:65.5 ℃; a:引物峰;A、B和C:DNA片段峰

    Fig 3 The effect on retention time of fragment in differential temperature A:61.5 ℃;B:63.5 ℃;C:65.5 ℃; a:peak of primers;A,B and C:peaks of DNA fragments

    2.5 流通池 对于SNP,野生型和突变型DNA分子序列只相差一个核苷酸,构象极相似,在DHPLC检测时,依靠构象不同分离,需要有极高的检测效能。我们先后用过13 μl、5 μl和1.7 μl流通池,在相同温度和梯度条件下,13 μl流通池检测出的DNA样品峰高宽比最小,分离度最小。1.7 μl流通池检测出的DNA样品峰高宽比最大,分离度最高。说明选用大流通池时,虽然光路较长,检测灵敏度较高,但由于已分离的样品各组分在流通池内再混合,使分离度降低,SNP纯合子和杂合子无法区别(图4)。因此保证有足够灵敏度时,应选择最小的流通池(1.7 μl)。
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    2.6 灵敏度 3个PCR产物经紫外分光光度计检测吸收度值分别为0.039、0.043和0.030,平均吸收度值为0.037。根据吸收度值为1约相当于50 μg/ml的经验公式,本次实验的平均PCR产物浓度为185 μg/ml。取0.5~10 μl PCR产物进柱,TmHPLE检测均能得到阳性结果。因此可认为TmHPLC可检测ng级的DNA样本。

    2.7 杂合子的判断 如何准确判断所检测样本为纯合子还是杂合子,在适当色谱条件下,主要以色谱图中色谱峰的个数及峰的对称性作为标准。一般讲如果为纯合子,除溶剂及引物峰应只出现一个峰,且峰的对称参数应接近1。杂合子在达到要求分离度的情况下,往往会有多个峰出现,在分离度不够的情况下可能出现肩峰及不对称峰,如图5所示。

    3 小结

    我们找到了在普通高效液相色谱仪上适合用于检测SNP的具有普遍意义的色谱条件。dNTP、PCR引物峰与被检测PCR产物峰完全分离;纯合子和杂合子样本能有效区分,建立起在普通高效液相色谱仪上进行DNA突变型快速筛选的变性高效液相色谱法。此法可表述为:固定相:dsDNA不锈钢柱(75 mm×2.1 mmi.d.,3.5 μm);同样填料(12.5 mm×4.6 mmi.d.,10 μm)的短柱作保护柱。流动相:A液是含0.1 mol/L TEAA和0.1 mmol/L EDTA的混合液;B液为A液中含25%的乙腈,洗脱梯度如表1。柱温根据预期片段的大小,参考http://www.insertion.stanford.edu/melt.html中查得的温度,在推荐温度±2 ℃进行适当调整。1.7 μl流通池的紫外检测器,检测波长:260 nm。t20701.gif (4076 bytes)
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    图4 SNP纯合子和杂合子无法区别的比较图(大检测池) A和B:杂合子;C:纯合子;a:引物峰;b:DNA片段峰Fig 4 The diagram that can not recognize homozygote and heterozygote using larger cell A and B:heterozygotes;C:homozygote;a:peak of primers;b:peak of DNA fragmentt20702.gif (4977 bytes)

    图5 已知SNP纯合子和杂合子色谱图(小检测池) A、B和C:杂合子;D:纯合子

    Fig 5 The chromatographic diagram of homozygote and heterozygote using small cell A,B and C:heterozygotes;D:homozygote
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    表1 TmHPLC选用的洗脱梯度

    Table 1 The eluting gradient ranges of TmHPLC

    Time(min)

    (时间)

    BufferA (%)

    (A液)

    Buffer B(%)

    (B液)

    Flow rate(ml/min)

    (流速)

    0
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    55

    45

    0.4

    0.10

    44

    56

    0.4

    8.10

    28

    72

    0.4

    8.50

    15

, 百拇医药     85

    0.8

    9.00

    5

    95

    0.8

    9.50

    5

    95

    0.8

    10.50

    55

    45

    0.8
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    11.00

    55

    45

    0.4

    基金项目:国家自然科学基金重大课题(39993420)

    通信作者:侯一平(E-mail:forensic@mail.sc.cninfo.net)

    作者单位:廖林川(610041成都,华西医科大学法医学院)

    孟海英(610041成都,华西医科大学法医学院)

    侯一平(610041成都,华西医科大学法医学院)

    颜有仪(610041成都,华西医科大学法医学院)
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    李英碧(610041成都,华西医科大学法医学院)

    吴瑾(610041成都,华西医科大学法医学院)

    张霁(610041成都,华西医科大学法医学院)

    张思仲(附属第一医院医学遗传研究室)

    苏智广(附属第一医院医学遗传研究室)

    参考文献

    [1]Hou YP, Zhang SZ. Temperature-modulated high-performance liquid chromatography for detecting variation in human genome. Chin J Med Genet,2000,17∶145-148.[侯一平,张思仲.温度调控高效液相色谱探索人类基因组变异的进展.中华医学遗传学杂志,2000,17∶145-148.]
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    [3]O'Donovan MC,Oefner PJ,Roberts SC,et al.Blind analysis of denaturing high-performance liquid chromatography as a tool for mutation detection.Genomics,1998,52,44-49.

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    [6]Underhill PA,Jin L,Lin AL,et al.Detection of numerous Y chromosome biallelic polymorphisms by denaturing high performance liquid chromatography.Genome Res,1997,7∶996-1005.

    [7]Bonner MR,Stone AC,Taylor P,et al.Increasing the throughput of DHPLC for detecting mutations in DNA.Am J Hum Genet (Suppl),1998,63∶1300.
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    [8]Bonner MR,Stone AC,Hammer MF.High throughput genome screening with RF-DHPLC.J Biomolecular Techniques, 1999,10∶108.

    [9]Bonner MR,Kabesch M,Martinez FD,et al.Using DHPLC to identify disease related polymorphisms in the human interleukin 4 gene.Am J Hum Genet (Suppl),1999,65∶222.

    [10]Singer-Sam J,Tanguay RL,Riggs AD.Use of Chelex to improve the PCR signal from a small number of cells.Amplification,1989,3(1)∶11., http://www.100md.com(廖林川 孟海英△ 侯一平 张思仲 颜有仪 苏智广 李英碧 吴瑾 张霁)