生物骨移植材料的灭菌
生物骨移植材料的灭菌
桑宏勋 胡蕴玉 李丹 戴秀兰 吕荣 杨光 孙怡群
摘 要：目的 为寻找用于骨移植材料灭菌的最佳方法和途径.对比研究环氧乙烷(EO)及γ射线对生物骨移植材料的灭菌方法及其对诱导成骨活性的影响. 方法 以金葡菌繁殖体、枯草杆菌黑色变种芽胞及蜡样杆菌芽胞3种标准菌株定量污染复合BMP的重组合异种骨(RBX)，分别做各剂量组60Co-γ射线辐照及EO气体灭菌试验，计数残存活菌.同时将上述RBX植入小鼠股部肌袋内，做异位成骨活性实验，术后7，14，21，28d取材，检测生成组织碱性磷酸酶(AKP)及钙(Ca)含量，并常规做组织学切片. 结果 EO及γ射线均有较强的灭菌效果，金葡菌在EO中0.5h或γ射线辐照3kGy即可完全灭菌.两种芽胞菌抗性较大，EO2000mg.h.L-1的消毒强度可完全杀灭，而γ射线辐照则需40kGy以上剂量.EO及γ射线对诱导成骨活性影响呈一剂量依赖关系，小的消毒剂量对移植骨生物活性无明显影响，但当γ射线辐照20kGy以上或EO消毒2500mg.h.L-1以上时，对诱导成骨活性均有不良影响. 结论 环氧乙烷比γ射线有更快更强的灭菌效果，安全范围大，完全杀菌的γ射线辐照剂量(40kGy)也同时完全破坏了骨移植物的成骨诱导活性，而完全灭菌的EO剂量对成骨活性干扰小.中等剂量的EO消毒即质量浓度500mg.L-1、作用3～4h左右,既可完全灭菌,又不干扰移植骨生物活性,用于生物骨移植材料(特别是颗粒状骨移植材料)灭菌安全有效,可推荐应用.
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关键词：骨移植；灭菌；环氧乙烷；电离辐射
0 引言
随着骨移植术的发展和骨库的建立，骨移植材料应用日趋广泛，但有报道骨库收集的异体骨不合格率为30%，其中细菌阳性4.3%, HBsAg,HIVAb阳性率分为3.4%和1.2%[1]. 而临床应用大段异体骨移植后感染率达11.7%[2]. 故控 制感染和交叉感染，对移植物进行灭菌处理至关重要. 生物骨移植材料灭菌的关键在于彻底灭菌的同时最大限度地保留其成骨诱导活性，因而应选择较适宜的消毒方法. 现国外临床骨组织库趋向于应用环氧乙烷(ethylene oxide,EO)气体及60Co-γ射线辐 照灭菌，但对其优缺点特别是对成骨活性的影响认识不一[3-6]. 我们以复合BMP的重组合异种骨(RBX)为载体，定量染菌,对比EO及γ射线灭菌效果及其对活性影响,以寻找更好的生物骨移植材料的灭菌的方法.
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1 材料和方法
参照本所方法制备重组合异种骨(RBX)[7];参照薛广波方法[8]，将 标准菌种金葡菌ATCC25923株，枯草杆菌黑色变种芽胞8017株及蜡样芽胞杆菌4001株分别制成细菌繁殖体及芽胞悬液，使含菌量107 cfu.mL-1,每个试验样本加入冻干RBX约1 g,菌液1 mL. 使菌液全部浸入RBX. 每次取上述样品各3份，分别做各剂量组γ射线及EO灭菌试验，计数平均残存活菌. 整个实验重复3次，同时设立对照. 同时取5～6 wk龄昆明种小白鼠300只,随机分为15组,每只两股部肌袋内各植入一粒经不同剂量消毒处理的RBX,术后7, 14, 21, 28 d取材,分别测定AKP及Ca含量,并做组织切片观察. 数据分组计算，方差分析统计，并进行各组间比较.
2 结果
, http://www.100md.com 金葡菌繁殖体极易杀灭，1 kGy辐照剂量即可杀灭99.99%以上，3 kGy以上达到完全灭菌；而枯草及蜡样两种芽胞菌对γ射线抗性较大，5 kGy时杀灭90%，但至40 kGy时方杀灭99.99%，50 kGy方能完全灭菌，尤以蜡样芽胞杆菌抵抗力强(Tab 1). 金葡菌繁殖体抵抗力最低，于EO中暴露0.5 h即可完全被杀灭，而两种芽胞菌在质量浓度100 mg.L-1时作用10 h， 500 mg.L-1时2 h及1000 mg.L-1时1 h均可杀灭99.99%以上，即1000 mg.h.L-1的消毒 强度达一般灭菌要求，而2000 mg.h.L-1的消毒强度可达完全灭菌(Tab 2). EO及γ射线杀灭90 %细菌所需剂量(D10值)都很小(Tab 3), 显示出其强大的灭菌效果.
, 百拇医药
表1 60Co-γ射线辐照灭菌结果
Tab 1 Effect of 60Co-γ radiation sterilization
D(Radiation)/
kGy
S. Aureus ATCC25923
B. Subtilis 8017
B. Cereus4001
Survivor B. cfu.L-1
GR%
, 百拇医药
Survivor B. cfu.L-1
GR%
Survivor B. cfu.L-1
GR%
0
6.60×1010
0.00
5.05×1010
0.00
2.85 ×1010
, 百拇医药
0.00
1
2.00×104
99.99
4.50×1010
10.89
2.55×1010
10.53
3
-
100.00
2.00×1010
, http://www.100md.com
60.40
1.60×1010
43.86
5
-
100.00
5.00×109
90.10
2.80×109
90.18
10
-
, 百拇医药
100.00
1.23×109
97.56
1.03×109
96.39
20
-
100.00
4.04×107
99.92
4.00×107
, http://www.100md.com 99.86
30
-
100.00
1.20×107
99.98
1.47×107
99.95
40
-
100.00
1.66×106
, http://www.100md.com
99.99
3.30×106
99.99
50
-
100.00
-
100.0
-
100.00
GR: germicidal rate. 表2 EO灭菌效果
Tab 2 Effect of EO sterilization
, 百拇医药
EO Dose/
(mg.h.L-1)
Survivor B. cfu.L-1
S. Aureus
ATCC25923
B. Subtilis8017
B. Cereus4001
0×0
6.60×1010
5.05×10 10
, http://www.100md.com
2.85×1010
100×2.0
-
2.00×106
1.50×106
100×5.0
-
1.00×106
7.00×106
100×10.0
-
, http://www.100md.com
4.00×104
-
100×20.0
-
-
-
500×0.5
-
3.66×105
1.00×105
500×1.0
-
, 百拇医药
1.20×105
1.00×104
500×2.0
-
-
-
1000×1.0
-
-
-
表3 杀灭90%微生物所需灭菌剂量
Tab 3 Doses of 90% germicidal rate (D10)
, 百拇医药
(EO mass concentration 500 mg.L -1)
Bacteria
D(Radiation)/kGy
tEO/h
S. Aureus
0.17
<0.07
B. Subtilis
2.50
<0.10
B. Cereus
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4.20
<0.10
γ射线及EO消毒对成骨诱导活性影响见Tab 4～6及Fig 1～6. 可见γ射线辐照剂量10 kGy时对生成组织AKP及Ca含量无明显影响,20 kGy以上时对诱导活性有明显影响. EO消毒强度低于2000 mg.h.L-1时AKP及Ca含量无明显影响;而大于2500 mg.h.L-1时则有明显影响. 同为2000 mg.h.L-1的强度下,高质量浓 度组及低质量浓度长时间组对诱导活性均有明显影响(Tab 6). 表4 γ射线辐照对诱导成骨AKP含量及钙含量影响
Tab 4 Effect of γ radiation on AKP activity and Ca content of inducible bone
, 百拇医药
[n=6, X±s, z/m(AKP)/(U.g-1), w(Ca)/(mg.g -1)]
tPO/d
D(Radiation)/kGy
0(control)
10
20
30
40
50
7
, 百拇医药 AKP
2.07±0.87
1.97±0.68
1.10±0.42a
0.73±0.26a
0.50±0.89b
0.40±0.31b
Ca
22.8 ±3.3
21.5 ±4.7
23.5 ±6.4
, http://www.100md.com
21. 8 ±6.6
15.2 ±3.7
24.1 ±2.5
14
AKP
2.05±0.81
1.60±0.67
0.76±0.27a
0.44±0.22b
0.44±0.09b
0.37±0.10b
, 百拇医药
Ca
15.0 ±2.3
14.7 ±1.3
14.3 ±4.5
13.7 ±4.1
14.6 ±3.9
19.0 ±4.9
21
AKP
1.58±0.39
0.83±0.18
0.41±0.07
, http://www.100md.com
0.23±0.12a
0.25±0.04a
0.17±0.03b
Ca
21.4 ±9.4
18.5 ±4.9
10.2 ±3.3
12.5 ±2.8
11.5 ±3.0
12.1 ±4.9
28
, 百拇医药
AKP
0.40±0.22
0.36±0.04
0.27±0.12
0.17±0.06
0.1 7±0.04
0.18±0.02
Ca
34.4 ±5.7
18.9 ±5.3
10.9 ±2.5b
11 .0 ±2.6b
, http://www.100md.com
10.6 ±1.8b
10.9 ±5.0b
Mean
AKP
1.53±0.91
1.19±0.79
0.63±0.41b
0.39 ±0.28b
0.34±0.15b
0.28±0.19b
, 百拇医药
Ca
23.4 ±9.0
18.3 ±4.8
14.7 ±6.8b
14.8 ±5.9b
13.0 ±3.6b
16.5 ±6.9b
aP<0.05, bP<0.01 vs control group. 表5 环氧乙烷对诱导成骨AKP活性及钙含量影响
Tab 5 Effect of EO sterilization on AKP activity and Ca content of inducible bo ne
, 百拇医药
[n=6, X±s, z/m(AKP)/(U.g-1), w(Ca)/(mg.g-1)]
t(Post-operation)/d
EO Dose/(mg.h.L-1)
0(control)
1000
1500
2000
2500
5000
, 百拇医药
7
AKP
2.07±0.87
1.96±0.54
1.82±0.57
1.85±0.38
1.00±0 .23a
0.49±0.08b
Ca
22.8 ±3.3
21.7 ±5.0
-
, 百拇医药
-
20.8±3.8
21.0 ±7.1
14
AKP
2.05±0.81
1.80±0.56
1.50±0.57
1.33±0.28
0.8 9±0.20a
0.30±0.06b
Ca
, 百拇医药
15.0 ±2.3
15.0 ±5.2
-
-
15.6 ±5.9
15.0 ±6.5
21
AKP
1.58±0.39
1.57±0.34
1.10±0.41
1.03±0.30
, 百拇医药
0.4 4±0.03b
0.20±0.06b
Ca
21.4 ±9.4
19.4 ±4.9
-
-
9.8 ±3.0
9.5 ±2.9
28
AKP
0.40±0.22
, 百拇医药
0.32±0.15
0.36±0.14
0.33±0.09
0.1 9±0.03
0.13±0.04
Ca
34.4 ±5.7
24.5 ±8.3
-
-
11.4 ±3.4b
10.2±2.4b
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Mean
AKP
1.53±0.91
1.41±0.77
1.20±0.70
1.13±0.62
0.63±0.37b
0.28±0.15b
Ca
23.4 ±9.0
20.2 ±6.6
, 百拇医药 -
-
14.4±5.9b
14.0 ±6.7b
aP<0.05, bP<0.01 vs control group. 表6 EO浓度与时间效应分析
Tab 6 Analysis of EO concentration and sterilization times on AKP activity
[n=6,X±s, z/m(AKP)/(U.g-1), w(Ca)/(mg.g- 1)]
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ρ(EO)/(mg.L-1)×t(Sterilization)/h
Negative
control
0×0
100×20
500×4
1000×2
2.05±0.81
0.22±0.12b
1.33±0.28a
, http://www.100md.com 0.46±0.33b
0.20±0.05b
aP>0.05, bP<0.01 vs 0×0.
图1 RBX植入后14 d，大量骨软骨分化，小梁状骨形成
Fig 1 14 d after RBX implantation, large amount of differentiated new b one and cartilage, with woven bone formation HE ×80
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图2 RBX植入后28 d，成熟骨小梁组织及骨髓分化
Fig 2 28 d post implantation, laminal bone and bone marrow formation HE × 80
图3 EO 2000 mg.h.L-1消毒，植入后14 d，较多软骨及小梁骨形成
Fig 3 Sterilization with 2000 mg.h.L-1 EO, 14 d after implantation , large amount of new cartilage and woven bone formation. Trichromatic staining ×80
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图4 EO 2500 mg.h.L-1消毒，术后28 d，少量骨软骨形成，周围较多结缔组织 形成
Fig 4 Sterilization with 2500 mg.h.L-1 EO, 28 d after implantatio n, small amount of new bone surrounded with fibrous tissue. Trichromatic staining ×80
图5 γ射线20 kGy辐照，术后14 d，少量软骨细胞分化
, http://www.100md.com Fig 5 20 kGy radiation, 14 d post implantation, small islands of new cartilage bone differentiated HE ×80
图6 γ射线40 kGy辐照，术后28 d, 无新生骨软骨组织，纤维组织包裹植骨
Fig 6 40 kGy radiation, 28 d post implantation, no new bone formation , the bone graft was encased by fibrous tissue. Trichromatic staining ×80
组织学结果与上述结论一致,γ射线20 kGy及EO 2500 mg.h.L-1以下各组植入 小鼠肌袋内可诱导生成大量骨软骨及小梁状骨，与对照组无明显差异,但消毒剂量进一步增大时,可见诱导生成骨软骨量减少,时间推后,当γ射线辐照40 kGy以上及EO消毒5000 mg.h.L-1以上时活性完全丧失,不能诱导骨软骨生成(Fig 4～6).
, 百拇医药
3 讨论
生物骨移植材料多取自于人(异体骨)或其他动物(异种骨)，细菌、病毒等致病微生物的污染很难避免，故生物骨移植材料的消毒处理十分重要[1-5].
EO气体及γ射线对细菌繁殖体、芽胞、真菌及病毒(如HBV,HIV等)均有较强的杀灭作用[9,10]. 现已知枯草杆菌显色变种芽胞及蜡样杆菌芽胞分别对EO及 γ射线抵抗力最强, 常做为二者消毒实验的标准指示菌种[8]. 我们选用枯草杆菌 黑色变种8017株及蜡样杆菌4001株两种芽胞菌,并和金葡菌ATCC25923繁殖体对比, 将细胞污染骨粒载体, 染菌量1010 cfu*L-1, 模拟实际应用骨移植材料的消 毒. 同时将BMP与无活性的松质骨载体再复合(RBX), 测定各处理组诱导生成组织AKP及Ca含量, 能较好的分析各因素对诱导成骨活性特别是BMP活性的影响.
, 百拇医药
不少作者研究了EO及γ射线对骨移植物的消毒作用, 但就其对诱导成骨活性的影响众说纷纭[11-14]. 事实上, EO为一种烷基化剂,γ射线则是由于激发电子 的直接作用和*H及*OH自由基的生成,它们均作用于微生物蛋白质、酶、核酸及DNA而将其灭活,而骨诱导生长因子如BMP等多为蛋白质和多肽,因而EO及γ射线消毒可能对其均有不良影响. 大的EO及γ射线消毒剂量完全范围大, 但均可使成骨诱导活性丧失. 另一方面, 生物骨移植材料用于临床治疗的主要目的是提供有一定机械强度同时又有诱导成骨作用载体支架, 使之于植骨部位发生骨诱(osteoinduction)和骨传导(osteoconduction)作用[15]. 对骨移植物的消毒处理不在于成功地保存 其细胞代谢活性, 而在于彻底消毒灭菌的同时尽量减少对移植物的理化性质及诱导成骨活性的影响, 因而应根据骨移植物的特性及病原微生物污染情况, 选择适当的消毒方法和剂量, 以期达到最好的临床应用效果.
本研究证明,EO及γ射线对诱导成骨活性影响呈一剂量依赖关系,但EO较γ射线安全范围大,活性干扰小,中等剂量EO即质量浓度500 mg.L-1、作用时间3～4 h左 右，消毒强度在1500～2000 mg.h.L-1，既可完全灭菌,又不干扰生物 活性,用于生物骨移植材料特别是颗粒状骨移植材料的消毒安全有效,可推荐应用.
, 百拇医药
作者简介：桑宏勋(1967-)，男(汉族)，河南省扶沟县人. 主治医师、讲师，博士. Tel.(029)3375289 Email. slbone@fmmu.edu.cn
桑宏勋(第四军医大学西京医院：全军骨科研究所，陕西 西安 710033)
胡蕴玉(第四军医大学西京医院：全军骨科研究所，陕西 西安 710033)
李丹(第四军医大学西京医院：全军骨科研究所，陕西 西安 710033)
戴秀兰(第四军医大学西京医院：检验科，陕西 西安 710033)
吕荣(第四军医大学西京医院：全军骨科研究所，陕西 西安 710033)
杨光(第四军医大学西京医院：全军骨科研究所，陕西 西安 710033)
, http://www.100md.com
孙怡群(第四军医大学西京医院：检验科，陕西 西安 710033)
参考文献
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桑宏勋 胡蕴玉 李丹 戴秀兰 吕荣 杨光 孙怡群
摘 要：目的 为寻找用于骨移植材料灭菌的最佳方法和途径.对比研究环氧乙烷(EO)及γ射线对生物骨移植材料的灭菌方法及其对诱导成骨活性的影响. 方法 以金葡菌繁殖体、枯草杆菌黑色变种芽胞及蜡样杆菌芽胞3种标准菌株定量污染复合BMP的重组合异种骨(RBX)，分别做各剂量组60Co-γ射线辐照及EO气体灭菌试验，计数残存活菌.同时将上述RBX植入小鼠股部肌袋内，做异位成骨活性实验，术后7，14，21，28d取材，检测生成组织碱性磷酸酶(AKP)及钙(Ca)含量，并常规做组织学切片. 结果 EO及γ射线均有较强的灭菌效果，金葡菌在EO中0.5h或γ射线辐照3kGy即可完全灭菌.两种芽胞菌抗性较大，EO2000mg.h.L-1的消毒强度可完全杀灭，而γ射线辐照则需40kGy以上剂量.EO及γ射线对诱导成骨活性影响呈一剂量依赖关系，小的消毒剂量对移植骨生物活性无明显影响，但当γ射线辐照20kGy以上或EO消毒2500mg.h.L-1以上时，对诱导成骨活性均有不良影响. 结论 环氧乙烷比γ射线有更快更强的灭菌效果，安全范围大，完全杀菌的γ射线辐照剂量(40kGy)也同时完全破坏了骨移植物的成骨诱导活性，而完全灭菌的EO剂量对成骨活性干扰小.中等剂量的EO消毒即质量浓度500mg.L-1、作用3～4h左右,既可完全灭菌,又不干扰移植骨生物活性,用于生物骨移植材料(特别是颗粒状骨移植材料)灭菌安全有效,可推荐应用.
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关键词：骨移植；灭菌；环氧乙烷；电离辐射
0 引言
随着骨移植术的发展和骨库的建立，骨移植材料应用日趋广泛，但有报道骨库收集的异体骨不合格率为30%，其中细菌阳性4.3%, HBsAg,HIVAb阳性率分为3.4%和1.2%[1]. 而临床应用大段异体骨移植后感染率达11.7%[2]. 故控 制感染和交叉感染，对移植物进行灭菌处理至关重要. 生物骨移植材料灭菌的关键在于彻底灭菌的同时最大限度地保留其成骨诱导活性，因而应选择较适宜的消毒方法. 现国外临床骨组织库趋向于应用环氧乙烷(ethylene oxide,EO)气体及60Co-γ射线辐 照灭菌，但对其优缺点特别是对成骨活性的影响认识不一[3-6]. 我们以复合BMP的重组合异种骨(RBX)为载体，定量染菌,对比EO及γ射线灭菌效果及其对活性影响,以寻找更好的生物骨移植材料的灭菌的方法.
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1 材料和方法
参照本所方法制备重组合异种骨(RBX)[7];参照薛广波方法[8]，将 标准菌种金葡菌ATCC25923株，枯草杆菌黑色变种芽胞8017株及蜡样芽胞杆菌4001株分别制成细菌繁殖体及芽胞悬液，使含菌量107 cfu.mL-1,每个试验样本加入冻干RBX约1 g,菌液1 mL. 使菌液全部浸入RBX. 每次取上述样品各3份，分别做各剂量组γ射线及EO灭菌试验，计数平均残存活菌. 整个实验重复3次，同时设立对照. 同时取5～6 wk龄昆明种小白鼠300只,随机分为15组,每只两股部肌袋内各植入一粒经不同剂量消毒处理的RBX,术后7, 14, 21, 28 d取材,分别测定AKP及Ca含量,并做组织切片观察. 数据分组计算，方差分析统计，并进行各组间比较.
2 结果
, http://www.100md.com 金葡菌繁殖体极易杀灭，1 kGy辐照剂量即可杀灭99.99%以上，3 kGy以上达到完全灭菌；而枯草及蜡样两种芽胞菌对γ射线抗性较大，5 kGy时杀灭90%，但至40 kGy时方杀灭99.99%，50 kGy方能完全灭菌，尤以蜡样芽胞杆菌抵抗力强(Tab 1). 金葡菌繁殖体抵抗力最低，于EO中暴露0.5 h即可完全被杀灭，而两种芽胞菌在质量浓度100 mg.L-1时作用10 h， 500 mg.L-1时2 h及1000 mg.L-1时1 h均可杀灭99.99%以上，即1000 mg.h.L-1的消毒 强度达一般灭菌要求，而2000 mg.h.L-1的消毒强度可达完全灭菌(Tab 2). EO及γ射线杀灭90 %细菌所需剂量(D10值)都很小(Tab 3), 显示出其强大的灭菌效果.
, 百拇医药
表1 60Co-γ射线辐照灭菌结果
Tab 1 Effect of 60Co-γ radiation sterilization
D(Radiation)/
kGy
S. Aureus ATCC25923
B. Subtilis 8017
B. Cereus4001
Survivor B. cfu.L-1
GR%
, 百拇医药
Survivor B. cfu.L-1
GR%
Survivor B. cfu.L-1
GR%
0
6.60×1010
0.00
5.05×1010
0.00
2.85 ×1010
, 百拇医药
0.00
1
2.00×104
99.99
4.50×1010
10.89
2.55×1010
10.53
3
-
100.00
2.00×1010
, http://www.100md.com
60.40
1.60×1010
43.86
5
-
100.00
5.00×109
90.10
2.80×109
90.18
10
-
, 百拇医药
100.00
1.23×109
97.56
1.03×109
96.39
20
-
100.00
4.04×107
99.92
4.00×107
, http://www.100md.com 99.86
30
-
100.00
1.20×107
99.98
1.47×107
99.95
40
-
100.00
1.66×106
, http://www.100md.com
99.99
3.30×106
99.99
50
-
100.00
-
100.0
-
100.00
GR: germicidal rate. 表2 EO灭菌效果
Tab 2 Effect of EO sterilization
, 百拇医药
EO Dose/
(mg.h.L-1)
Survivor B. cfu.L-1
S. Aureus
ATCC25923
B. Subtilis8017
B. Cereus4001
0×0
6.60×1010
5.05×10 10
, http://www.100md.com
2.85×1010
100×2.0
-
2.00×106
1.50×106
100×5.0
-
1.00×106
7.00×106
100×10.0
-
, http://www.100md.com
4.00×104
-
100×20.0
-
-
-
500×0.5
-
3.66×105
1.00×105
500×1.0
-
, 百拇医药
1.20×105
1.00×104
500×2.0
-
-
-
1000×1.0
-
-
-
表3 杀灭90%微生物所需灭菌剂量
Tab 3 Doses of 90% germicidal rate (D10)
, 百拇医药
(EO mass concentration 500 mg.L -1)
Bacteria
D(Radiation)/kGy
tEO/h
S. Aureus
0.17
<0.07
B. Subtilis
2.50
<0.10
B. Cereus
, http://www.100md.com
4.20
<0.10
γ射线及EO消毒对成骨诱导活性影响见Tab 4～6及Fig 1～6. 可见γ射线辐照剂量10 kGy时对生成组织AKP及Ca含量无明显影响,20 kGy以上时对诱导活性有明显影响. EO消毒强度低于2000 mg.h.L-1时AKP及Ca含量无明显影响;而大于2500 mg.h.L-1时则有明显影响. 同为2000 mg.h.L-1的强度下,高质量浓 度组及低质量浓度长时间组对诱导活性均有明显影响(Tab 6). 表4 γ射线辐照对诱导成骨AKP含量及钙含量影响
Tab 4 Effect of γ radiation on AKP activity and Ca content of inducible bone
, 百拇医药
[n=6, X±s, z/m(AKP)/(U.g-1), w(Ca)/(mg.g -1)]
tPO/d
D(Radiation)/kGy
0(control)
10
20
30
40
50
7
, 百拇医药 AKP
2.07±0.87
1.97±0.68
1.10±0.42a
0.73±0.26a
0.50±0.89b
0.40±0.31b
Ca
22.8 ±3.3
21.5 ±4.7
23.5 ±6.4
, http://www.100md.com
21. 8 ±6.6
15.2 ±3.7
24.1 ±2.5
14
AKP
2.05±0.81
1.60±0.67
0.76±0.27a
0.44±0.22b
0.44±0.09b
0.37±0.10b
, 百拇医药
Ca
15.0 ±2.3
14.7 ±1.3
14.3 ±4.5
13.7 ±4.1
14.6 ±3.9
19.0 ±4.9
21
AKP
1.58±0.39
0.83±0.18
0.41±0.07
, http://www.100md.com
0.23±0.12a
0.25±0.04a
0.17±0.03b
Ca
21.4 ±9.4
18.5 ±4.9
10.2 ±3.3
12.5 ±2.8
11.5 ±3.0
12.1 ±4.9
28
, 百拇医药
AKP
0.40±0.22
0.36±0.04
0.27±0.12
0.17±0.06
0.1 7±0.04
0.18±0.02
Ca
34.4 ±5.7
18.9 ±5.3
10.9 ±2.5b
11 .0 ±2.6b
, http://www.100md.com
10.6 ±1.8b
10.9 ±5.0b
Mean
AKP
1.53±0.91
1.19±0.79
0.63±0.41b
0.39 ±0.28b
0.34±0.15b
0.28±0.19b
, 百拇医药
Ca
23.4 ±9.0
18.3 ±4.8
14.7 ±6.8b
14.8 ±5.9b
13.0 ±3.6b
16.5 ±6.9b
aP<0.05, bP<0.01 vs control group. 表5 环氧乙烷对诱导成骨AKP活性及钙含量影响
Tab 5 Effect of EO sterilization on AKP activity and Ca content of inducible bo ne
, 百拇医药
[n=6, X±s, z/m(AKP)/(U.g-1), w(Ca)/(mg.g-1)]
t(Post-operation)/d
EO Dose/(mg.h.L-1)
0(control)
1000
1500
2000
2500
5000
, 百拇医药
7
AKP
2.07±0.87
1.96±0.54
1.82±0.57
1.85±0.38
1.00±0 .23a
0.49±0.08b
Ca
22.8 ±3.3
21.7 ±5.0
-
, 百拇医药
-
20.8±3.8
21.0 ±7.1
14
AKP
2.05±0.81
1.80±0.56
1.50±0.57
1.33±0.28
0.8 9±0.20a
0.30±0.06b
Ca
, 百拇医药
15.0 ±2.3
15.0 ±5.2
-
-
15.6 ±5.9
15.0 ±6.5
21
AKP
1.58±0.39
1.57±0.34
1.10±0.41
1.03±0.30
, 百拇医药
0.4 4±0.03b
0.20±0.06b
Ca
21.4 ±9.4
19.4 ±4.9
-
-
9.8 ±3.0
9.5 ±2.9
28
AKP
0.40±0.22
, 百拇医药
0.32±0.15
0.36±0.14
0.33±0.09
0.1 9±0.03
0.13±0.04
Ca
34.4 ±5.7
24.5 ±8.3
-
-
11.4 ±3.4b
10.2±2.4b
, http://www.100md.com
Mean
AKP
1.53±0.91
1.41±0.77
1.20±0.70
1.13±0.62
0.63±0.37b
0.28±0.15b
Ca
23.4 ±9.0
20.2 ±6.6
, 百拇医药 -
-
14.4±5.9b
14.0 ±6.7b
aP<0.05, bP<0.01 vs control group. 表6 EO浓度与时间效应分析
Tab 6 Analysis of EO concentration and sterilization times on AKP activity
[n=6,X±s, z/m(AKP)/(U.g-1), w(Ca)/(mg.g- 1)]
, http://www.100md.com
ρ(EO)/(mg.L-1)×t(Sterilization)/h
Negative
control
0×0
100×20
500×4
1000×2
2.05±0.81
0.22±0.12b
1.33±0.28a
, http://www.100md.com 0.46±0.33b
0.20±0.05b
aP>0.05, bP<0.01 vs 0×0.
图1 RBX植入后14 d，大量骨软骨分化，小梁状骨形成
Fig 1 14 d after RBX implantation, large amount of differentiated new b one and cartilage, with woven bone formation HE ×80
, http://www.100md.com
图2 RBX植入后28 d，成熟骨小梁组织及骨髓分化
Fig 2 28 d post implantation, laminal bone and bone marrow formation HE × 80
图3 EO 2000 mg.h.L-1消毒，植入后14 d，较多软骨及小梁骨形成
Fig 3 Sterilization with 2000 mg.h.L-1 EO, 14 d after implantation , large amount of new cartilage and woven bone formation. Trichromatic staining ×80
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图4 EO 2500 mg.h.L-1消毒，术后28 d，少量骨软骨形成，周围较多结缔组织 形成
Fig 4 Sterilization with 2500 mg.h.L-1 EO, 28 d after implantatio n, small amount of new bone surrounded with fibrous tissue. Trichromatic staining ×80
图5 γ射线20 kGy辐照，术后14 d，少量软骨细胞分化
, http://www.100md.com Fig 5 20 kGy radiation, 14 d post implantation, small islands of new cartilage bone differentiated HE ×80
图6 γ射线40 kGy辐照，术后28 d, 无新生骨软骨组织，纤维组织包裹植骨
Fig 6 40 kGy radiation, 28 d post implantation, no new bone formation , the bone graft was encased by fibrous tissue. Trichromatic staining ×80
组织学结果与上述结论一致,γ射线20 kGy及EO 2500 mg.h.L-1以下各组植入 小鼠肌袋内可诱导生成大量骨软骨及小梁状骨，与对照组无明显差异,但消毒剂量进一步增大时,可见诱导生成骨软骨量减少,时间推后,当γ射线辐照40 kGy以上及EO消毒5000 mg.h.L-1以上时活性完全丧失,不能诱导骨软骨生成(Fig 4～6).
, 百拇医药
3 讨论
生物骨移植材料多取自于人(异体骨)或其他动物(异种骨)，细菌、病毒等致病微生物的污染很难避免，故生物骨移植材料的消毒处理十分重要[1-5].
EO气体及γ射线对细菌繁殖体、芽胞、真菌及病毒(如HBV,HIV等)均有较强的杀灭作用[9,10]. 现已知枯草杆菌显色变种芽胞及蜡样杆菌芽胞分别对EO及 γ射线抵抗力最强, 常做为二者消毒实验的标准指示菌种[8]. 我们选用枯草杆菌 黑色变种8017株及蜡样杆菌4001株两种芽胞菌,并和金葡菌ATCC25923繁殖体对比, 将细胞污染骨粒载体, 染菌量1010 cfu*L-1, 模拟实际应用骨移植材料的消 毒. 同时将BMP与无活性的松质骨载体再复合(RBX), 测定各处理组诱导生成组织AKP及Ca含量, 能较好的分析各因素对诱导成骨活性特别是BMP活性的影响.
, 百拇医药
不少作者研究了EO及γ射线对骨移植物的消毒作用, 但就其对诱导成骨活性的影响众说纷纭[11-14]. 事实上, EO为一种烷基化剂,γ射线则是由于激发电子 的直接作用和*H及*OH自由基的生成,它们均作用于微生物蛋白质、酶、核酸及DNA而将其灭活,而骨诱导生长因子如BMP等多为蛋白质和多肽,因而EO及γ射线消毒可能对其均有不良影响. 大的EO及γ射线消毒剂量完全范围大, 但均可使成骨诱导活性丧失. 另一方面, 生物骨移植材料用于临床治疗的主要目的是提供有一定机械强度同时又有诱导成骨作用载体支架, 使之于植骨部位发生骨诱(osteoinduction)和骨传导(osteoconduction)作用[15]. 对骨移植物的消毒处理不在于成功地保存 其细胞代谢活性, 而在于彻底消毒灭菌的同时尽量减少对移植物的理化性质及诱导成骨活性的影响, 因而应根据骨移植物的特性及病原微生物污染情况, 选择适当的消毒方法和剂量, 以期达到最好的临床应用效果.
本研究证明,EO及γ射线对诱导成骨活性影响呈一剂量依赖关系,但EO较γ射线安全范围大,活性干扰小,中等剂量EO即质量浓度500 mg.L-1、作用时间3～4 h左 右，消毒强度在1500～2000 mg.h.L-1，既可完全灭菌,又不干扰生物 活性,用于生物骨移植材料特别是颗粒状骨移植材料的消毒安全有效,可推荐应用.
, 百拇医药
作者简介：桑宏勋(1967-)，男(汉族)，河南省扶沟县人. 主治医师、讲师，博士. Tel.(029)3375289 Email. slbone@fmmu.edu.cn
桑宏勋(第四军医大学西京医院：全军骨科研究所，陕西 西安 710033)
胡蕴玉(第四军医大学西京医院：全军骨科研究所，陕西 西安 710033)
李丹(第四军医大学西京医院：全军骨科研究所，陕西 西安 710033)
戴秀兰(第四军医大学西京医院：检验科，陕西 西安 710033)
吕荣(第四军医大学西京医院：全军骨科研究所，陕西 西安 710033)
杨光(第四军医大学西京医院：全军骨科研究所，陕西 西安 710033)
, http://www.100md.com
孙怡群(第四军医大学西京医院：检验科，陕西 西安 710033)
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