人血小板生成素在大肠杆菌中的高效表达
邢桂春 张津辉 魏汉东 陈惠鹏 柳晓兰 邱丽玲 贺福初
摘 要 目的：人血小板生成素(TPO)在大肠杆菌中的高效表达。方法：利用PCR技术，扩增出了(1～174个氨基酸的)人血小板生成素cDNA，并将其克隆到pGEX-1λT 载体中，构建了融合蛋白表达质粒。重组子用限制性内切酶酶切鉴定，表达产物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。结果：限制性内切酶酶切鉴定表明重组子含有正确的(1～174氨基酸)TPO cDNA片段；表达产物经SDS-PAGE相对分子质量约为43 000，与预期的相符合，表达占可溶性菌体总蛋白的44.56%。结论：表达产物具有明显的刺激Mo7e细胞增殖与CFU-Meg生成的功能。
关键词：血小板生成素；聚合酶链反应；cDNA克隆；融合蛋白；基因表达；大肠杆菌；电泳，聚丙酰凝胶
, 百拇医药
人血小板生成素(human thrombopoietin, hTPO) 是血液学界寻找已久，但只是在1994年才被克隆成功的造血调控因子。由于它具有特异刺激巨核细胞-血小板生成的作用，人们普遍预期它对于治疗各种原因引起的血小板减少症会有显著效果，可能是继G-CSF、EPO之后的又一重要药物。
我们已成功地用反转录PCR法从中国人胎肝mRNA中扩增并克隆出人血小板生成素全长cDNA[1]，并完成序列分析。此cDNA在COS-7和CHO细胞中均能表达出典型的特异刺激CFU-Meg(骨髓巨核细胞集落)的TPO活性，但哺乳动物细胞生产TPO存在成本高、工艺难、价格贵等缺点。而Bartley等[2]报道，1～174氨基酸的hTPO在体外具有完整生物活性，因此，我们又构建了N端非糖基化hTPO cDNA重组表达载体[3]，表达实验未见明显的表达蛋白带，但活性测试表明，它具有能刺激CFU-Meg形成的活性。为此，我们将其重组到高效表达的融合表达载体中，以期实现其在大肠杆菌中的高效表达。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 细菌菌株与质粒
大肠杆菌JM109、HB101、DH5α、MM294为本室保存，质粒pcDNA3-TPO带有TPO全长cDNA，为本室自行构建；质粒pGEX-1λT购自Pharmacia公司。
1.2 工具酶和试剂
DNA限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ，T4 DNA连接酶，Taq DNA聚合酶及PCR产物纯化试剂盒等分别购自华美生物制品公司和Promega公司。
1.3 寡核苷酸引物的合成
所用引物均由本室自行合成，DNA自动合成仪(381A)及其成套试剂为ABI公司产品，用固相亚磷酸三酯法合成寡核苷酸片段。
, http://www.100md.com
1.4 hTPO174 cDNA的PCR扩增
PCR上游引物为：5′CGGAATTC ATG AGC CCT GCT CCT CCTG 3′, 含EcoRⅠ位点；下游引物序列为：5′CGGAATTC TTA GAG CTC GTT CAG TGT GA 3′，也含EcoRⅠ位点。PCR模板为pcDNA3-TPO 30，在PE480扩增仪上扩增，参数为：94℃ 1 min,50℃ 1 min,72℃ 1 min 30 s，循环35次后，72℃ 7 min。
1.5 融合蛋白质粒的构建
经EcoRⅠ酶切，碱性磷酸酶磷酸化的pGEX-1λT 载体和用EcoRⅠ酶切的hTPO(1～174氨基酸)cDNA，按1∶3摩尔比连接，以常规氯化钙法转入感受态E.coli JM109细胞中。
1.6 hTPO174 cDNA重组子酶切鉴定
, http://www.100md.com
以常规快速小量质粒提取法提取重组质粒,经质粒大小比较后,再用EcoRⅠ、BamHⅠ酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定重组片段大小及插入方向。
1.7 重组hTPO174 cDNA的诱导表达
单菌落接种LB(含氨苄西林 100 μg/ml)培养基中，37℃振荡培养过夜，以1%或10%扩种后，继续振荡培养1～4 h，等其生长至D600=0.2～1.0时，加入IPTG(终浓度0.1～1 mmol/L)，于不同时间取菌液187.5 μl，4℃收集表达菌体，表达菌体在样品缓冲液中直接裂解，进行SDS-PAGE[4]，考马斯亮蓝R-250染色，表达产物在菌体总蛋白中所占比例由光密度(波长560 nm)薄层扫描结果确定。表达菌体收集后，用50 mmol/L Tris*Cl(pH8.0)，1 mmol/L EDTA悬浮菌体，超声波破碎后，观察表达带是在上清中还是在包涵体中。
, 百拇医药
1.8 重组融合蛋白的快速纯化及复性
工程菌菌体超声破碎后离心收集包涵体，依次用含1%Triton X-100及4 mol/L NaCl的50 mmol/L Tris*Cl-1 mmol/L EDTA(pH8.0)洗涤，然后用SDS-PAGE样品处理液裂解，进行制备电泳，电泳后将凝胶在脱色液中固定，切下相应条带，捣碎，用电极缓冲液抽提出蛋白质[5]，稀释至蛋白浓度为100 μg/ml，对含0.1 mmol/L GSH及0.1 mmol/L GSSG(上海丽珠东风生物技术有限公司生产)的乙酸铵缓冲液(pH7.0)充分透析。
1.9 活性测定
分别用Mo7e细胞以MTS法及小鼠骨髓巨核细胞集落(CFU-Meg)法测定[6]。
2 结果与讨论
, http://www.100md.com
2.1 hTPO174 cDNA的PCR扩增
以20ng pcDNA3-TPO 30重组质粒为模板，经PCR 35个循环后，取10 μl样品电泳即可见强扩增带，其相对分子质量位于657 bp与454 bp之间，与其预期大小543 bp一致(图1)。
图1 hTPO174 cDNA的PCR产物电泳分析
1,2.PCR产物；3.pGEM-7Zf(+)-HaeⅢ
2.2 hTPO174 cDNA融合表达质粒的构建
, http://www.100md.com
hTPO174 cDNA片段克隆到pGEX-1λT表达载体见图2所示。
2.3 重组hTPO174cDNA的酶切鉴定
在重组实验中，获得Apr菌落6个，经比较质粒大小得到6个候选克隆，为鉴定hTPO174cDNA插入有无错误和重组片段是否完全，进行重组位点EcoRⅠ酶切后的电泳鉴定。结果表明，在6个候选克隆提取的质粒中除切下4.9 kb左右的载体片段外，还有一543 bp左右的插入片段(图3a)，它与PCR产物以及所拟克隆的hTPO174 cDNA长度一致。此结果表明插入片段内无EcoRⅠ酶切位点，从而与文献中hTPO174 cDNA序列预期的一致；一方面提示所克隆的hTPO174 cDNA完整。将此重组质粒命名为pGEX-TPO。由于hTPO174cDNA两端只有EcoRⅠ酶切位点，为鉴定插入方向，我们用BamHⅠ对pGEX-TPO进行了酶切鉴定(图3b)，结果有4个为正向插入(即切下了一400 bp左右的外源片段)，1个为反向插入(即切下一200 bp左右的外源片段)。
, 百拇医药
图2 pGEX-GST/TPO融合蛋白表达质粒的构建路线
2.4 融合蛋白的表达
IPTG诱导表达的结果(图4)表明，JM109菌(pGEX-TPO)经振荡培养后能高效表达hTPO融合蛋白，表达菌体SDS-PAGE结果显示出特异的表达产物带，相对分子质量43 000，光密度薄层扫描结果表明其占菌体可溶性总蛋白44.56%左右。以不同大肠杆菌(JM109、HB101、MM294、DH5α)为受体菌，其表达水平无明显差异，JM109稍高(图5)。此外，以JM109为受体菌，观察了细菌生长状态，及IPTG的浓度和诱导时间对表达水平的影响(图略)。结果表明细菌生长状态对表达水平无显著影响，以D600=0.3～0.4稍好，诱导时间则以3～5 h最佳，诱导时间即使再延长，表达水平亦未见增加。扩种量为1%时的表达量稍高于10%的扩种量。诱导表达菌体超声破碎后，上清及沉淀分别进行SDS-PAGE电泳，结果表明特异表达产物绝大部分以不溶性包涵体形式存在(图6)。
, http://www.100md.com
图3 pGEX-TPO限制性内切酶酶切的琼脂糖凝胶电泳分析图谱
a:1.PCR 标志物; b:1.PCR 标志物;
2.pGEX-1λT-EcoRⅠ; 2.pGEX-1λT-BamHⅠ;
3～8.pGEX-TPO(1-6)-EcoRⅠ 3～8.pGEX-TPO(1-6)-BamHⅠ
图4 含pGEX-GST-TPO大肠杆菌(JM109)诱导表达后
1.蛋白质分子量标准；
, 百拇医药 2～4.pGEX-GST/TPO融合蛋白表达菌体；
5～7.单独GST表达菌体；2，5.10%扩种1 h后诱导；
3，6.10%扩种3 h后诱导；4，7.1%扩种3 h后诱导
图5 受体菌对含pGEX-TPO5大肠杆菌表达水平的影响
1和6，2和7，3和8，4和9，5和10.受体菌分别为DH5α、MM294、HB101和JM109，上样量分别为5和10 μl。5和10为含pGEX-1λT空质粒的阴性对照
, http://www.100md.com
图6 含pGEX-TPO5 JM109大肠杆菌诱导表达后的SDS-PAGE图谱
1.蛋白质相对分子质量标准；2.pGEX-1λT包涵体；
3,4.pGEX-TPO5包涵体(上样量分别为5,10 μl)；
5,6.pGEX-TPO5超声破碎上清(上样量分别为5,10 μl)；
7,8.pGEX-1λT全菌(上样量分为别5,10 μl)；
9,10.pGEX-TPO5全菌
2.5 重组融合蛋白的纯化及活性测定
用制备电泳可快速纯化少量重组蛋白，纯化后的蛋白质在SDS-PAGE中显示单一条带，有一定的刺激Mo7e细胞生长及小鼠CFU-Meg生成的活性。
, 百拇医药
用MTS法测定重组蛋白对Mo7e细胞的作用，当重组融合蛋白浓度为0.25 μg/ml及2.5 μg/ml时，D570分别为0.361±0.030及0.389±0.001，空白对照为0.242±0.014，相应的P值分别小于0.025和0.005，说明重组融合蛋白具有一定的刺激Mo7e细胞增殖的活性。用小鼠骨髓CFU-Meg集落法测定重组蛋白活性，当重组融合蛋白浓度为1 μg/ml及10 μg/ml时，每2×105骨髓有核细胞生成的集落数由18.3±2.9个分别升至35.0±0.6及38.32±5.8个(P<0.025)，说明重组融合蛋白具有一定的刺激小鼠CFU-Meg集落生成的活性。
3 讨论
基因工程法生产是获得大量具有药用价值细胞因子的重要途径，原核细胞作为表达系统具有成本低、周期短、操作简便等突出优点，且由于糖基化对hTPO的生物活性并非必需，因此我们选择了大肠杆菌表达hTPO。
, 百拇医药
利用大肠杆菌表达外源基因时，影响表达效率的因素很多，除需要高效表达载体外，外源基因序列对表达效率影响也很大。hTPO cDNA由于其本身的结构特点，在大肠杆菌中表达水平很低，因此，我们构建了表达hTPO融合蛋白的高效表达质粒，其表达水平达44.56%，为下游的纯化、复性研究提供了方便。
[基金项目] 国家自然科学基金资助项目(39620514)；国家“八六三”高技术基金资助项目(863-102-08-05)
[作者简介] 邢桂春(1961-)，女，山东文登人，实验师。
邢桂春(军事医学科学院放射医学研究所，北京 100850)
张津辉(军事医学科学院放射医学研究所，北京 100850)
魏汉东(军事医学科学院放射医学研究所，北京 100850)
, 百拇医药
陈惠鹏(军事医学科学院放射医学研究所，北京 100850)
柳晓兰(军事医学科学院放射医学研究所，北京 100850)
邱丽玲(军事医学科学院放射医学研究所，北京 100850)
贺福初(军事医学科学院放射医学研究所，北京 100850)
参考文献
[1] 邢桂春，郭树华，胡志远，等.人血小板生成素(hTPO)全长cDNA克隆在CHO细胞中的表达[J].生物工程学报，1997，13(4):410.
[2] Bartley TD, Bogenberger J, Hunt P，et al. Identification and cloning of a megakaryocyte growth and development factor that is a ligand for the cytokine receptor[J]. Mol Cell，1994，77(7):1117.
, 百拇医药
[3] 邢桂春，贺福初，邱丽玲，等.人血小板生成素在大肠杆菌中的表达[J].实验血液学杂志，1996，4(2):217.
[4] Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J]. Nature，1970,227(15):680.
[5] 张津辉，蒋中华，陈惠鹏，等.制备电泳中蛋白质区带定位与染色方法的比较[J].军事医学科学院院刊,1997，21(2):159.
[6] 刘秀珍.造血祖细胞培养技术实验手册[M].北京：北京出版社,1992.111., 百拇医药
摘 要 目的：人血小板生成素(TPO)在大肠杆菌中的高效表达。方法：利用PCR技术，扩增出了(1～174个氨基酸的)人血小板生成素cDNA，并将其克隆到pGEX-1λT 载体中，构建了融合蛋白表达质粒。重组子用限制性内切酶酶切鉴定，表达产物经SDS-聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。结果：限制性内切酶酶切鉴定表明重组子含有正确的(1～174氨基酸)TPO cDNA片段；表达产物经SDS-PAGE相对分子质量约为43 000，与预期的相符合，表达占可溶性菌体总蛋白的44.56%。结论：表达产物具有明显的刺激Mo7e细胞增殖与CFU-Meg生成的功能。
关键词：血小板生成素；聚合酶链反应；cDNA克隆；融合蛋白；基因表达；大肠杆菌；电泳，聚丙酰凝胶
, 百拇医药
人血小板生成素(human thrombopoietin, hTPO) 是血液学界寻找已久，但只是在1994年才被克隆成功的造血调控因子。由于它具有特异刺激巨核细胞-血小板生成的作用，人们普遍预期它对于治疗各种原因引起的血小板减少症会有显著效果，可能是继G-CSF、EPO之后的又一重要药物。
我们已成功地用反转录PCR法从中国人胎肝mRNA中扩增并克隆出人血小板生成素全长cDNA[1]，并完成序列分析。此cDNA在COS-7和CHO细胞中均能表达出典型的特异刺激CFU-Meg(骨髓巨核细胞集落)的TPO活性，但哺乳动物细胞生产TPO存在成本高、工艺难、价格贵等缺点。而Bartley等[2]报道，1～174氨基酸的hTPO在体外具有完整生物活性，因此，我们又构建了N端非糖基化hTPO cDNA重组表达载体[3]，表达实验未见明显的表达蛋白带，但活性测试表明，它具有能刺激CFU-Meg形成的活性。为此，我们将其重组到高效表达的融合表达载体中，以期实现其在大肠杆菌中的高效表达。
, 百拇医药
1 材料与方法
1.1 细菌菌株与质粒
大肠杆菌JM109、HB101、DH5α、MM294为本室保存，质粒pcDNA3-TPO带有TPO全长cDNA，为本室自行构建；质粒pGEX-1λT购自Pharmacia公司。
1.2 工具酶和试剂
DNA限制性内切酶EcoRⅠ、BamHⅠ，T4 DNA连接酶，Taq DNA聚合酶及PCR产物纯化试剂盒等分别购自华美生物制品公司和Promega公司。
1.3 寡核苷酸引物的合成
所用引物均由本室自行合成，DNA自动合成仪(381A)及其成套试剂为ABI公司产品，用固相亚磷酸三酯法合成寡核苷酸片段。
, http://www.100md.com
1.4 hTPO174 cDNA的PCR扩增
PCR上游引物为：5′CGGAATTC ATG AGC CCT GCT CCT CCTG 3′, 含EcoRⅠ位点；下游引物序列为：5′CGGAATTC TTA GAG CTC GTT CAG TGT GA 3′，也含EcoRⅠ位点。PCR模板为pcDNA3-TPO 30，在PE480扩增仪上扩增，参数为：94℃ 1 min,50℃ 1 min,72℃ 1 min 30 s，循环35次后，72℃ 7 min。
1.5 融合蛋白质粒的构建
经EcoRⅠ酶切，碱性磷酸酶磷酸化的pGEX-1λT 载体和用EcoRⅠ酶切的hTPO(1～174氨基酸)cDNA，按1∶3摩尔比连接，以常规氯化钙法转入感受态E.coli JM109细胞中。
1.6 hTPO174 cDNA重组子酶切鉴定
, http://www.100md.com
以常规快速小量质粒提取法提取重组质粒,经质粒大小比较后,再用EcoRⅠ、BamHⅠ酶切，琼脂糖凝胶电泳鉴定重组片段大小及插入方向。
1.7 重组hTPO174 cDNA的诱导表达
单菌落接种LB(含氨苄西林 100 μg/ml)培养基中，37℃振荡培养过夜，以1%或10%扩种后，继续振荡培养1～4 h，等其生长至D600=0.2～1.0时，加入IPTG(终浓度0.1～1 mmol/L)，于不同时间取菌液187.5 μl，4℃收集表达菌体，表达菌体在样品缓冲液中直接裂解，进行SDS-PAGE[4]，考马斯亮蓝R-250染色，表达产物在菌体总蛋白中所占比例由光密度(波长560 nm)薄层扫描结果确定。表达菌体收集后，用50 mmol/L Tris*Cl(pH8.0)，1 mmol/L EDTA悬浮菌体，超声波破碎后，观察表达带是在上清中还是在包涵体中。
, 百拇医药
1.8 重组融合蛋白的快速纯化及复性
工程菌菌体超声破碎后离心收集包涵体，依次用含1%Triton X-100及4 mol/L NaCl的50 mmol/L Tris*Cl-1 mmol/L EDTA(pH8.0)洗涤，然后用SDS-PAGE样品处理液裂解，进行制备电泳，电泳后将凝胶在脱色液中固定，切下相应条带，捣碎，用电极缓冲液抽提出蛋白质[5]，稀释至蛋白浓度为100 μg/ml，对含0.1 mmol/L GSH及0.1 mmol/L GSSG(上海丽珠东风生物技术有限公司生产)的乙酸铵缓冲液(pH7.0)充分透析。
1.9 活性测定
分别用Mo7e细胞以MTS法及小鼠骨髓巨核细胞集落(CFU-Meg)法测定[6]。
2 结果与讨论
, http://www.100md.com
2.1 hTPO174 cDNA的PCR扩增
以20ng pcDNA3-TPO 30重组质粒为模板，经PCR 35个循环后，取10 μl样品电泳即可见强扩增带，其相对分子质量位于657 bp与454 bp之间，与其预期大小543 bp一致(图1)。
图1 hTPO174 cDNA的PCR产物电泳分析
1,2.PCR产物；3.pGEM-7Zf(+)-HaeⅢ
2.2 hTPO174 cDNA融合表达质粒的构建
, http://www.100md.com
hTPO174 cDNA片段克隆到pGEX-1λT表达载体见图2所示。
2.3 重组hTPO174cDNA的酶切鉴定
在重组实验中，获得Apr菌落6个，经比较质粒大小得到6个候选克隆，为鉴定hTPO174cDNA插入有无错误和重组片段是否完全，进行重组位点EcoRⅠ酶切后的电泳鉴定。结果表明，在6个候选克隆提取的质粒中除切下4.9 kb左右的载体片段外，还有一543 bp左右的插入片段(图3a)，它与PCR产物以及所拟克隆的hTPO174 cDNA长度一致。此结果表明插入片段内无EcoRⅠ酶切位点，从而与文献中hTPO174 cDNA序列预期的一致；一方面提示所克隆的hTPO174 cDNA完整。将此重组质粒命名为pGEX-TPO。由于hTPO174cDNA两端只有EcoRⅠ酶切位点，为鉴定插入方向，我们用BamHⅠ对pGEX-TPO进行了酶切鉴定(图3b)，结果有4个为正向插入(即切下了一400 bp左右的外源片段)，1个为反向插入(即切下一200 bp左右的外源片段)。
, 百拇医药
图2 pGEX-GST/TPO融合蛋白表达质粒的构建路线
2.4 融合蛋白的表达
IPTG诱导表达的结果(图4)表明，JM109菌(pGEX-TPO)经振荡培养后能高效表达hTPO融合蛋白，表达菌体SDS-PAGE结果显示出特异的表达产物带，相对分子质量43 000，光密度薄层扫描结果表明其占菌体可溶性总蛋白44.56%左右。以不同大肠杆菌(JM109、HB101、MM294、DH5α)为受体菌，其表达水平无明显差异，JM109稍高(图5)。此外，以JM109为受体菌，观察了细菌生长状态，及IPTG的浓度和诱导时间对表达水平的影响(图略)。结果表明细菌生长状态对表达水平无显著影响，以D600=0.3～0.4稍好，诱导时间则以3～5 h最佳，诱导时间即使再延长，表达水平亦未见增加。扩种量为1%时的表达量稍高于10%的扩种量。诱导表达菌体超声破碎后，上清及沉淀分别进行SDS-PAGE电泳，结果表明特异表达产物绝大部分以不溶性包涵体形式存在(图6)。
, http://www.100md.com
图3 pGEX-TPO限制性内切酶酶切的琼脂糖凝胶电泳分析图谱
a:1.PCR 标志物; b:1.PCR 标志物;
2.pGEX-1λT-EcoRⅠ; 2.pGEX-1λT-BamHⅠ;
3～8.pGEX-TPO(1-6)-EcoRⅠ 3～8.pGEX-TPO(1-6)-BamHⅠ
图4 含pGEX-GST-TPO大肠杆菌(JM109)诱导表达后
1.蛋白质分子量标准；
, 百拇医药 2～4.pGEX-GST/TPO融合蛋白表达菌体；
5～7.单独GST表达菌体；2，5.10%扩种1 h后诱导；
3，6.10%扩种3 h后诱导；4，7.1%扩种3 h后诱导
图5 受体菌对含pGEX-TPO5大肠杆菌表达水平的影响
1和6，2和7，3和8，4和9，5和10.受体菌分别为DH5α、MM294、HB101和JM109，上样量分别为5和10 μl。5和10为含pGEX-1λT空质粒的阴性对照
, http://www.100md.com
图6 含pGEX-TPO5 JM109大肠杆菌诱导表达后的SDS-PAGE图谱
1.蛋白质相对分子质量标准；2.pGEX-1λT包涵体；
3,4.pGEX-TPO5包涵体(上样量分别为5,10 μl)；
5,6.pGEX-TPO5超声破碎上清(上样量分别为5,10 μl)；
7,8.pGEX-1λT全菌(上样量分为别5,10 μl)；
9,10.pGEX-TPO5全菌
2.5 重组融合蛋白的纯化及活性测定
用制备电泳可快速纯化少量重组蛋白，纯化后的蛋白质在SDS-PAGE中显示单一条带，有一定的刺激Mo7e细胞生长及小鼠CFU-Meg生成的活性。
, 百拇医药
用MTS法测定重组蛋白对Mo7e细胞的作用，当重组融合蛋白浓度为0.25 μg/ml及2.5 μg/ml时，D570分别为0.361±0.030及0.389±0.001，空白对照为0.242±0.014，相应的P值分别小于0.025和0.005，说明重组融合蛋白具有一定的刺激Mo7e细胞增殖的活性。用小鼠骨髓CFU-Meg集落法测定重组蛋白活性，当重组融合蛋白浓度为1 μg/ml及10 μg/ml时，每2×105骨髓有核细胞生成的集落数由18.3±2.9个分别升至35.0±0.6及38.32±5.8个(P<0.025)，说明重组融合蛋白具有一定的刺激小鼠CFU-Meg集落生成的活性。
3 讨论
基因工程法生产是获得大量具有药用价值细胞因子的重要途径，原核细胞作为表达系统具有成本低、周期短、操作简便等突出优点，且由于糖基化对hTPO的生物活性并非必需，因此我们选择了大肠杆菌表达hTPO。
, 百拇医药
利用大肠杆菌表达外源基因时，影响表达效率的因素很多，除需要高效表达载体外，外源基因序列对表达效率影响也很大。hTPO cDNA由于其本身的结构特点，在大肠杆菌中表达水平很低，因此，我们构建了表达hTPO融合蛋白的高效表达质粒，其表达水平达44.56%，为下游的纯化、复性研究提供了方便。
[基金项目] 国家自然科学基金资助项目(39620514)；国家“八六三”高技术基金资助项目(863-102-08-05)
[作者简介] 邢桂春(1961-)，女，山东文登人，实验师。
邢桂春(军事医学科学院放射医学研究所，北京 100850)
张津辉(军事医学科学院放射医学研究所，北京 100850)
魏汉东(军事医学科学院放射医学研究所，北京 100850)
, 百拇医药
陈惠鹏(军事医学科学院放射医学研究所，北京 100850)
柳晓兰(军事医学科学院放射医学研究所，北京 100850)
邱丽玲(军事医学科学院放射医学研究所，北京 100850)
贺福初(军事医学科学院放射医学研究所，北京 100850)
参考文献
[1] 邢桂春，郭树华，胡志远，等.人血小板生成素(hTPO)全长cDNA克隆在CHO细胞中的表达[J].生物工程学报，1997，13(4):410.
[2] Bartley TD, Bogenberger J, Hunt P，et al. Identification and cloning of a megakaryocyte growth and development factor that is a ligand for the cytokine receptor[J]. Mol Cell，1994，77(7):1117.
, 百拇医药
[3] 邢桂春，贺福初，邱丽玲，等.人血小板生成素在大肠杆菌中的表达[J].实验血液学杂志，1996，4(2):217.
[4] Laemmli UK. Cleavage of structural proteins during the assembly of the head of bacteriophage T4[J]. Nature，1970,227(15):680.
[5] 张津辉，蒋中华，陈惠鹏，等.制备电泳中蛋白质区带定位与染色方法的比较[J].军事医学科学院院刊,1997，21(2):159.
[6] 刘秀珍.造血祖细胞培养技术实验手册[M].北京：北京出版社,1992.111., 百拇医药