成纤维细胞与细胞外基质在皮肤创伤修复中的相互作用及其调控
成纤维细胞与细胞外基质在皮肤创伤修复中的相互作用及其调控
苏顺清 于冶 张一鸣
关键词：成纤维细胞；细胞外基质；皮肤；创伤修复 皮肤创伤修复依赖于细胞与细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的相互作用。成纤维细胞(fibroblast,Fb)是主要修复细胞，在某些趋化因子的作用下，由创周向创面移位，并分泌大量的ECM如胶原蛋白(collagen)、纤维连接蛋白(fibronectin，FN)、层连蛋白(liminin，LN)[1，2]、体外黏连蛋白(vitronecftn，VN)、 蛋白多糖(proteoglylans，PG) 等。Fb-ECM相互作用时，一方面Fb 增殖，合成分泌ECM填充缺损；另一方面，ECM起着支架和连接作用，并调节Fb的发育、移位和增殖。在某些细胞因子作用下，Fb过度增殖，致ECM异常沉积，则可形成增生性瘢痕或瘢痕疙瘩。 笔者综述了皮肤创伤修复过程中Fb-ECM的相互作用及其调控的研究进展。
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一、 整合素介导Fb-ECM间的相互黏附
Fb-ECM相互作用是由黏附分子介导的，整合素 (integrin )是其中的主要家族。整合素是一组细胞表面糖蛋白，是由α和β亚单位经非共价键连接而成的异二聚体糖蛋白，其配基结合区能识别相应配体上的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列(Arg-Gig-Asp，RGD)。而ECM成分FN、LN、I型胶原等结构中均含有RGD序列，ECM即通过这些RGD序列与Fb表面整合素的配基结合区特异性结合。α、β亚单位结合后可决定整合素的结合活力和特异性，其功能也受表达细胞的影响。Gailit等[3] 研究了介导成人真皮Fb与创面基质蛋白相互作用的整合素。整合素α3β1、α4β1、αvβ3和αvβ1能与纤连蛋白结合[4]；整合素αvβ1、αvβ3则是VN受体。并认为，培养的成人真皮Fb可表达α3β1、α5β1、αvβ1，证实在创伤修复早期的ECM中，可与FN、VN和纤维蛋白结合[4]。αvβ5还能调节细胞表面结合的VN的分化与退化，而αvβ3则无此功能[5]。αvβ5的这种功能有利于ECM的塑型，因为二者接触处是相对的紧密部位，Fb快速向创面迁移需要αvβ5来调节不同的细胞内信号传导途径。
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二、 Fb表型与ECM合成和收缩
ECM和许多细胞因子可调节Fb表型。Gabbiani等[6]认为，在伤后2周，创面Fb即可发育成具有平滑肌细胞特征的表型，即肌成纤维细胞(myofibroblast，MFb)，它与后期ECM收缩有关。伤后3 d，创面内纤维素凝块中无Fb浸润，其中仅有FN和VN作为Fb增殖、迁移和合成ECM的暂时性载体[7]，此时Fb尚不具备迁移能力，因其动力装置(细胞骨架)对细胞运动有抑制作用，也可能与细胞迁移所需的表面受体不足有关。3 d后Fb由静止型向迁移型转换，并向创面中心迁移，同时大量增殖，胶原合成增多。胶原合成表型的Fb的超微结构特征是含有丰富的粗面内质网和高尔基体。伤后10 d，用 Maddon染色，胶原性ECM变成肉芽组织永久性成分，且纤维蛋白开始浓缩成疏松的束状，Fb表面可出现αv和α5β1二种整合素表达[8]。伤后14 d，ECM可发生收缩，与Fb向MFb表型转换有关。Fb通过其伪足的伸出、回缩而收缩其周围的胶原基质，创面中MFb伸出的伪足与Fb或ECM接触即收缩。当细胞-基质复合体置于增高张力状态下，MFb沿张力线拉长。在早期，由于胶原纤维排列的多向性，成纤维细胞的胞质沿这些纤维运动并产生多向性突起而呈星状。随着Fb与胶原纤维的相互作用，胶原纤维改构，其排列由多向性转变为单向性。Fb通过α2β1整合素调节ECM收缩，细胞内产生的收缩力量使基质变形，使定植的细胞再迁移。创面愈合后MFb通过细胞凋亡(apoptosis)而死亡、消失，表现为凋亡细胞数量急剧增加[9]。在某些细胞因子或生长因子的异常刺激下，Fb功能活跃，MFb持续存在，致ECM大量沉积而形成瘢痕增生和挛缩的分子基础。
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三、ECM对Fb功能的影响
FN及其片段能促进Fb增殖，使停止生长的Fb重新合成DNA，进入细胞周期[1]。而对LN及其片段的研究表明，LN短臂内部杆状片段含丰富的半胱氨酸，具有“EGF”样重复单位，该结构在其他几种ECM中也存在，在空间结构上有利于蛋白质相互作用。Gauss-Muller等[10]证实FN对Fb、巨噬细胞具有趋化作用，且依赖于FN-Fb间的黏附，通过此黏附作用，细胞膜蛋白和磷酯进行转甲基反应，细胞骨架中微丝微管收缩，使细胞迁移。此后进一步证实，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原及其降解产物、胶原酶降解片段对Fb均有趋化作用。真皮基质中的蛋白多糖(proteoglycans， PG)可抑制Fb功能[11]，其中含量较多的是硫酸软骨素B，包括DS-PGⅠ(biglgean)和DS-PGⅡ(decorin)。Decorin在培养细胞中可抑制转化生长因子β(TGF-β)，从而推测Decorin对Fb的抑制作用是通过TGF-β完成的[12]。胶原分泌到细胞外，其裂解产物前胶原肽在转录和翻译水平负反馈抑制Fb合成胶原[13]。创面愈合后，这种负反馈抑制可能减弱乃至消失，使ECM过量沉积而形成增生性瘢痕。
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四、Fb-ECM相互作用的调控因子
随着Fb和其他细胞迁移至伤口部位，并分裂增殖，伤口处ECM沉积，Fb、内皮细胞、角朊细胞持续合成分泌生长因子，如PDGF、TGF-β、FGF、EGF 等，使细胞持续增殖，ECM合成及新生血管形成。TGF-β对皮肤创伤的正常修复起着重要作用，如在创伤愈合后仍持续发挥作用，很可能形成增生性瘢痕。TGF-β刺激Fb合成ECM，同时抑制胶原酶的产生，并增加胶原酶抑制剂含金属蛋白酶(TIMPⅠ、Ⅱ)和α-巨球蛋白的组织抑制物的产生[14]。Zhang等[15]证实，烧伤后增生性瘢痕组织中，Ⅰ、Ⅱ型前胶原及TGT-β mRNA较正常皮肤表达明显增加。PDGF是血清中促进Fb 分裂最具潜力的促有丝分裂原，在损伤早期即由血小板释放。PDGF对体外培养的Fb具有趋化和增殖反应，还可刺激Fb合成胶原并使胶原酶活化，调节ECM的更新。同时，促进Fb向MFb表型转换，并获得表达α-平滑肌肌动蛋白的能力，与创伤愈合后ECM收缩和瘢痕挛缩有关[16]。伤后4～5 d，迁移的Fb表达体外黏连蛋白受体，与FGF作用有关，促使Fb向创面趋化。同时，Ⅰ型前胶原颗粒出现在Fb胞浆中，FGF可抑制胶原基质的收缩，其机制与蛋白激酶C激活有关[17]。肿瘤坏死因子(TNF)对Fb增殖具有促进和抑制双重作用，但对ECM合成具有促进作用。γ-干扰素(γ-INF)则可抑制Fb增殖和ECM合成[18]。
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近年来，作为生物体内重要的信息分子和效应分子的一氧化氮(NO)在创伤修复中的作用日益受到重视[19]。局部组织中，NO是活体细胞在一氧化氮合成酶(NOS)的催化下，以L -精氨酸为底物，在有氧条件下生成的小分子物质。在正常皮肤角朊细胞、血管内皮细胞、真皮Fb均可观察到 NOS活性[20，21]。Schaffer等[22]认为，NO可促进创面胶原沉积，并加强创面愈合的机械张力。在创伤早期，NO具有舒张血管作用，并促进血管再生，有利于创伤的正常修复。在修复晚期，因ECM过度沉积而形成的增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中，NOS表达却下降[23，24]。局部组织中，NO合成量减少，从而引起瘢痕组织中Fb异常增殖，ECM过量沉积。病理性瘢痕组织中NOS表达及NO合成减少的机制及意义尚未完全明了，可能与TGF-β抑制NO释放或组织中缺乏酶底物(L-精氨酶)致NO合成量下降有关。可以推测局部组织细胞合成分泌的NO，可能抑制Fb过渡增殖，NO替代疗法，也许可为防治增生性瘢痕提供一条新的途径。
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苏顺清(435005 黄石市第五医院烧伤整形科)
于冶(435005 黄石市第五医院烧伤整形科)
张一鸣(同济医科大学附属协和医院整形外科)
参考文献
1，付小兵，王德文，主编.创伤修复基础.第1版.北京：人民军医出版社，1996.122-124.
2，Clark RAF.Regulation of fibroblast in cutaneous wound repair.Am J Med Sci,1993， 306:42-48.
3，Cailit J,Clark RAF.Studies in vitro on the role of αvβ1 integrins in the adhesion of human dermal fibroblasts to provisional matris proteins fibronectin,vitronectin and fibuinogen.J Invest Dermatol,1996， 106:102-108.
, 百拇医药
4，Cailit J,Pierschbacher M,Clark RAF.Expression of functional α4β1 by human dermal fibroblast to provisional.J Invest Dermatol,1993,100:323-328.
5，Panetti TS, Mckeown-Long PJ.The αvβ5 integrin receptor regulates mediated endocytosis of vitronectin. J Biol Chem,1993,268:11492-11495.
6，Gabbiani G,Hirschel BJ,Ryon GB,et al.Granulation tissue as a contractive organ: a structure and function.J Exp Med,1972,135:719-734.
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7，Knox P,Crooks S,Rimmer CS.Role of fibronectin in the migration of fibroblasts into plasma clots.J Cell Biol,1986,102:2318-2323.
8，Klein CED,Dressel T,Steinmager T,et al. Integrin α2β1 is upregulated in fibroblasts and highly aggressive melanma cells in three-dimensional collagen lattices and mediates the recoganization of collagen I fibrils.J Cell Biol,1991,115:1427-1436.
9，Desomuliere A, Redard M, Darly I,et al.Apoptosis mediates the decrease in cellularity during the transition between granulaiton tissue and scar.Am J Pathal,1995,146:56-66.
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10，Gauss-Muller V,Klernman HK,Martin GR,et al. Role of attachment factors and attracants in fibroblast chemotaxis.J Lab Clin Med,1980,96:1071-1080.
11，Murir IFK,Padilla-Lamb A,Stewart E,et al.Growth inhibition of cultured fibroblasts by extracts from human dermis.Br J Plast Surg,1997,50:186-193.
12，Yamagacjo Y,Mann DM,Ruoslahti E.Negative regulation of transforming growth factor β by the proteoglycan decorin.Nature,1990,346:281-284.
, 百拇医药
13，Lambert CA,Soudant EP,Mizuno BV.Pretranslational regulation of extracellar matrix molecules and collagenase expression in fibroblast by mechanical forces.Lab Invest,1992,66:444-451.
14，Abergel RR,Dizszzurro D,Muker CA.Biochemical composition of the connective tissue in keloids and analysis of collagen metabolism in keloids fibroblast cultures.J Invest Dermatol,1985,84:384-390.
15，Zhang K,Carner W,Cohen L,et al.Increased types ⅠandⅡ collagen and transforming growth factor β mRNA and protein in hypertrophic burn scar.J Invest Dermatol,1995,104:750-759.
, 百拇医药
16，Schiro JA,Chan BMC,Roswit WR,et al.Integrin α2β1 mediate recorganization and contraction of collagen matrix by human cells.Cell,1991,67:403-410.
17，Finesmith TH,Broadly KN,Davidson JM.Fibroblasts from wounds of different stages of repair vary in their ability to contract to collagen gel in response to growth factors.J Cell Physiol,1990,144:99-107.
18，Kovacs EJ.Fibrogenic cytokines:the role of immune mediators in the development of sear tissue. Immunology Today,1991,12:17-23.
, 百拇医药
19，Tzeng E,Billar TR. Nitric oxide and surgical patient.Arch Surg, 1997,132:977-982.
20，Wang RJ,Ghohary A,Shen YJ,et al.Human dermol fibroblasts produce nitric oxide and express both constitutive and inducible nitric oxide synthase isoforms.J Invest Dermatol,1996,106:419-427.
21，Shimizu Y,Sakai M,Umcmura X.Immunogistochemical localization of mitric oxide synthase in normal skin:expression of endothelial-type and inducible-type nitric oxide synthase in keratinocytes.J Dermatol,1997,24:80-84.
, http://www.100md.com
22，Schaffer MR,Tantry V,Van Wesep RA,et al.Nitric oxide metabolism in wounds.J Surg Res,1997,71:25-31.
23，Wang RJ,Ghahary A,Shen YJ,et al.Nitric oxide synthase expression and nitric oxide production are reduced in hypertrophic scar tissue and fibroblast.J Invest Dermatol,1997,108:438-444.
24，Lim TC, Moochhala SM,Tanwlter TL,et al.Downregulation of inducible nitric oxide synthase expression in keloids.Plast Reconstr Surg,1996,98:911-912., 百拇医药
苏顺清 于冶 张一鸣
关键词：成纤维细胞；细胞外基质；皮肤；创伤修复 皮肤创伤修复依赖于细胞与细胞外基质(extracellular matrix,ECM)的相互作用。成纤维细胞(fibroblast,Fb)是主要修复细胞，在某些趋化因子的作用下，由创周向创面移位，并分泌大量的ECM如胶原蛋白(collagen)、纤维连接蛋白(fibronectin，FN)、层连蛋白(liminin，LN)[1，2]、体外黏连蛋白(vitronecftn，VN)、 蛋白多糖(proteoglylans，PG) 等。Fb-ECM相互作用时，一方面Fb 增殖，合成分泌ECM填充缺损；另一方面，ECM起着支架和连接作用，并调节Fb的发育、移位和增殖。在某些细胞因子作用下，Fb过度增殖，致ECM异常沉积，则可形成增生性瘢痕或瘢痕疙瘩。 笔者综述了皮肤创伤修复过程中Fb-ECM的相互作用及其调控的研究进展。
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一、 整合素介导Fb-ECM间的相互黏附
Fb-ECM相互作用是由黏附分子介导的，整合素 (integrin )是其中的主要家族。整合素是一组细胞表面糖蛋白，是由α和β亚单位经非共价键连接而成的异二聚体糖蛋白，其配基结合区能识别相应配体上的精氨酸-甘氨酸-天冬氨酸序列(Arg-Gig-Asp，RGD)。而ECM成分FN、LN、I型胶原等结构中均含有RGD序列，ECM即通过这些RGD序列与Fb表面整合素的配基结合区特异性结合。α、β亚单位结合后可决定整合素的结合活力和特异性，其功能也受表达细胞的影响。Gailit等[3] 研究了介导成人真皮Fb与创面基质蛋白相互作用的整合素。整合素α3β1、α4β1、αvβ3和αvβ1能与纤连蛋白结合[4]；整合素αvβ1、αvβ3则是VN受体。并认为，培养的成人真皮Fb可表达α3β1、α5β1、αvβ1，证实在创伤修复早期的ECM中，可与FN、VN和纤维蛋白结合[4]。αvβ5还能调节细胞表面结合的VN的分化与退化，而αvβ3则无此功能[5]。αvβ5的这种功能有利于ECM的塑型，因为二者接触处是相对的紧密部位，Fb快速向创面迁移需要αvβ5来调节不同的细胞内信号传导途径。
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二、 Fb表型与ECM合成和收缩
ECM和许多细胞因子可调节Fb表型。Gabbiani等[6]认为，在伤后2周，创面Fb即可发育成具有平滑肌细胞特征的表型，即肌成纤维细胞(myofibroblast，MFb)，它与后期ECM收缩有关。伤后3 d，创面内纤维素凝块中无Fb浸润，其中仅有FN和VN作为Fb增殖、迁移和合成ECM的暂时性载体[7]，此时Fb尚不具备迁移能力，因其动力装置(细胞骨架)对细胞运动有抑制作用，也可能与细胞迁移所需的表面受体不足有关。3 d后Fb由静止型向迁移型转换，并向创面中心迁移，同时大量增殖，胶原合成增多。胶原合成表型的Fb的超微结构特征是含有丰富的粗面内质网和高尔基体。伤后10 d，用 Maddon染色，胶原性ECM变成肉芽组织永久性成分，且纤维蛋白开始浓缩成疏松的束状，Fb表面可出现αv和α5β1二种整合素表达[8]。伤后14 d，ECM可发生收缩，与Fb向MFb表型转换有关。Fb通过其伪足的伸出、回缩而收缩其周围的胶原基质，创面中MFb伸出的伪足与Fb或ECM接触即收缩。当细胞-基质复合体置于增高张力状态下，MFb沿张力线拉长。在早期，由于胶原纤维排列的多向性，成纤维细胞的胞质沿这些纤维运动并产生多向性突起而呈星状。随着Fb与胶原纤维的相互作用，胶原纤维改构，其排列由多向性转变为单向性。Fb通过α2β1整合素调节ECM收缩，细胞内产生的收缩力量使基质变形，使定植的细胞再迁移。创面愈合后MFb通过细胞凋亡(apoptosis)而死亡、消失，表现为凋亡细胞数量急剧增加[9]。在某些细胞因子或生长因子的异常刺激下，Fb功能活跃，MFb持续存在，致ECM大量沉积而形成瘢痕增生和挛缩的分子基础。
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三、ECM对Fb功能的影响
FN及其片段能促进Fb增殖，使停止生长的Fb重新合成DNA，进入细胞周期[1]。而对LN及其片段的研究表明，LN短臂内部杆状片段含丰富的半胱氨酸，具有“EGF”样重复单位，该结构在其他几种ECM中也存在，在空间结构上有利于蛋白质相互作用。Gauss-Muller等[10]证实FN对Fb、巨噬细胞具有趋化作用，且依赖于FN-Fb间的黏附，通过此黏附作用，细胞膜蛋白和磷酯进行转甲基反应，细胞骨架中微丝微管收缩，使细胞迁移。此后进一步证实，Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ型胶原及其降解产物、胶原酶降解片段对Fb均有趋化作用。真皮基质中的蛋白多糖(proteoglycans， PG)可抑制Fb功能[11]，其中含量较多的是硫酸软骨素B，包括DS-PGⅠ(biglgean)和DS-PGⅡ(decorin)。Decorin在培养细胞中可抑制转化生长因子β(TGF-β)，从而推测Decorin对Fb的抑制作用是通过TGF-β完成的[12]。胶原分泌到细胞外，其裂解产物前胶原肽在转录和翻译水平负反馈抑制Fb合成胶原[13]。创面愈合后，这种负反馈抑制可能减弱乃至消失，使ECM过量沉积而形成增生性瘢痕。
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四、Fb-ECM相互作用的调控因子
随着Fb和其他细胞迁移至伤口部位，并分裂增殖，伤口处ECM沉积，Fb、内皮细胞、角朊细胞持续合成分泌生长因子，如PDGF、TGF-β、FGF、EGF 等，使细胞持续增殖，ECM合成及新生血管形成。TGF-β对皮肤创伤的正常修复起着重要作用，如在创伤愈合后仍持续发挥作用，很可能形成增生性瘢痕。TGF-β刺激Fb合成ECM，同时抑制胶原酶的产生，并增加胶原酶抑制剂含金属蛋白酶(TIMPⅠ、Ⅱ)和α-巨球蛋白的组织抑制物的产生[14]。Zhang等[15]证实，烧伤后增生性瘢痕组织中，Ⅰ、Ⅱ型前胶原及TGT-β mRNA较正常皮肤表达明显增加。PDGF是血清中促进Fb 分裂最具潜力的促有丝分裂原，在损伤早期即由血小板释放。PDGF对体外培养的Fb具有趋化和增殖反应，还可刺激Fb合成胶原并使胶原酶活化，调节ECM的更新。同时，促进Fb向MFb表型转换，并获得表达α-平滑肌肌动蛋白的能力，与创伤愈合后ECM收缩和瘢痕挛缩有关[16]。伤后4～5 d，迁移的Fb表达体外黏连蛋白受体，与FGF作用有关，促使Fb向创面趋化。同时，Ⅰ型前胶原颗粒出现在Fb胞浆中，FGF可抑制胶原基质的收缩，其机制与蛋白激酶C激活有关[17]。肿瘤坏死因子(TNF)对Fb增殖具有促进和抑制双重作用，但对ECM合成具有促进作用。γ-干扰素(γ-INF)则可抑制Fb增殖和ECM合成[18]。
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近年来，作为生物体内重要的信息分子和效应分子的一氧化氮(NO)在创伤修复中的作用日益受到重视[19]。局部组织中，NO是活体细胞在一氧化氮合成酶(NOS)的催化下，以L -精氨酸为底物，在有氧条件下生成的小分子物质。在正常皮肤角朊细胞、血管内皮细胞、真皮Fb均可观察到 NOS活性[20，21]。Schaffer等[22]认为，NO可促进创面胶原沉积，并加强创面愈合的机械张力。在创伤早期，NO具有舒张血管作用，并促进血管再生，有利于创伤的正常修复。在修复晚期，因ECM过度沉积而形成的增生性瘢痕和瘢痕疙瘩中，NOS表达却下降[23，24]。局部组织中，NO合成量减少，从而引起瘢痕组织中Fb异常增殖，ECM过量沉积。病理性瘢痕组织中NOS表达及NO合成减少的机制及意义尚未完全明了，可能与TGF-β抑制NO释放或组织中缺乏酶底物(L-精氨酶)致NO合成量下降有关。可以推测局部组织细胞合成分泌的NO，可能抑制Fb过渡增殖，NO替代疗法，也许可为防治增生性瘢痕提供一条新的途径。
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于冶(435005 黄石市第五医院烧伤整形科)
张一鸣(同济医科大学附属协和医院整形外科)
参考文献
1，付小兵，王德文，主编.创伤修复基础.第1版.北京：人民军医出版社，1996.122-124.
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4，Cailit J,Pierschbacher M,Clark RAF.Expression of functional α4β1 by human dermal fibroblast to provisional.J Invest Dermatol,1993,100:323-328.
5，Panetti TS, Mckeown-Long PJ.The αvβ5 integrin receptor regulates mediated endocytosis of vitronectin. J Biol Chem,1993,268:11492-11495.
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17，Finesmith TH,Broadly KN,Davidson JM.Fibroblasts from wounds of different stages of repair vary in their ability to contract to collagen gel in response to growth factors.J Cell Physiol,1990,144:99-107.
18，Kovacs EJ.Fibrogenic cytokines:the role of immune mediators in the development of sear tissue. Immunology Today,1991,12:17-23.
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19，Tzeng E,Billar TR. Nitric oxide and surgical patient.Arch Surg, 1997,132:977-982.
20，Wang RJ,Ghohary A,Shen YJ,et al.Human dermol fibroblasts produce nitric oxide and express both constitutive and inducible nitric oxide synthase isoforms.J Invest Dermatol,1996,106:419-427.
21，Shimizu Y,Sakai M,Umcmura X.Immunogistochemical localization of mitric oxide synthase in normal skin:expression of endothelial-type and inducible-type nitric oxide synthase in keratinocytes.J Dermatol,1997,24:80-84.
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22，Schaffer MR,Tantry V,Van Wesep RA,et al.Nitric oxide metabolism in wounds.J Surg Res,1997,71:25-31.
23，Wang RJ,Ghahary A,Shen YJ,et al.Nitric oxide synthase expression and nitric oxide production are reduced in hypertrophic scar tissue and fibroblast.J Invest Dermatol,1997,108:438-444.
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