骨肉瘤组织中三种血管形成因子的表达
骨肉瘤组织中三种血管形成因子的表达
徐勤枝 高奉浔 李增鹏 刘忠令
关键词；骨肉瘤
肿瘤性血管的形成受血管形成因子的特异性调节,肿瘤细胞及宿主细胞产生并释放多种血管形成肽，刺激血管内皮细胞分裂、增殖、迁移并吻合成新血管[1]。本实验以人体骨肉瘤切除标本为材料，检测血管形成因子血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、内皮生长因子(EGF)蛋白的表达，探讨各血管形成因子与肿瘤微血管密度、骨肉瘤远处转移的关系及对患者预后的意义。
一、材料与方法
1.手术切除的58例骨肉瘤标本，常规4%甲醛固定。石蜡包埋，4 μm连续切片，分别进行HE及免疫组织化学染色。兔抗VEGF、bFGF及EGF(SANTA CRUZ公司)，工作浓度分别为1∶20，1∶50和1∶50。以0.01 mol/L PBS漂洗3×5 min，以PBS代替一抗作为阴性对照。
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2.免疫组织化学染色结果判断[2]：判定标准以细胞膜和(或)胞质出现棕黄色颗粒为阳性细胞。每例切片随机选择10个中倍视野(×200)观察，计数肿瘤细胞阳性细胞数并结合染色强度。为便于数据统计分析，将其分为2级：阳性：(+)，阳性细胞数>5%，染色强度与背景相比，细胞胞质或膜有明显棕黄色颗粒；阴性：(-)，阳性细胞数<5%，或染色强度与背景相近。肿瘤微血管密度: 在低倍镜下(×40)选择微血管密集区(hot spots)，然后在高倍视野(×200)选择5个视野计数微血管数目，取5个视野均值。单个阳性细胞，孤立的内皮细胞簇及独立的血管分支均作为血管数目。微血管直径大于8个红细胞直径时，组织坏死区域以及切片边缘部分均不在计数范围内。
3.统计学分析：计数资料以二维列联表法进行相关分析。
二、结果
1.骨肉瘤微血管密度标记第八因子相关抗原：Ag的免疫细胞化学染色：肿瘤内微血管密度计数结果最低值为21，最高值142，中位数为57，均值为60.97。肿瘤微血管密度≥61者27例，肿瘤转移率为65.20%(15/27)，<61者31例，肿瘤转移率为34.81%。χ2检验发现高肿瘤微血管密度组，其肿瘤出现远处转移机率高(P<0.05)，相关性分析表明：肿瘤内微血管数与患者术后生存时间密切相关(P<0.05)，微血管数目高者其生存时间短。
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2.血管形成因子VEGF、bFGF和EGF的免疫细胞化学染色:VEGF、bFGF和 EGF阳性产物呈棕褐色颗粒状，定位于肿瘤细胞胞质及血管内皮细胞胞质，胞核未见着色。58例骨肉瘤组织VEGF 、bFGF和 EGF阳性率分别为51.7%(30/58)、55.2%(32/58)和39.7%(23/58)。
3.血管形成因子染色与肿瘤内肿瘤微血管密度肿瘤转移及3年生存率的关系统计检验提示VEGF、bFGF阳性表达分别与肿瘤内肿瘤微血管密度、肿瘤转移及术后3年生存时间相关显著，EGF蛋白阳性表达在肿瘤微血管密度两组间差异有显著性(P<0.05)，与肿瘤转移、患者术后生存时间无显著相关性。
三、讨论
肿瘤增殖与转移依赖于血管形成，其过程极为复杂，取决于血管形成因子与抑制因子相互拮抗作用的失衡，其中血管形成因子发挥着重要作用。我们的结果发现骨肉瘤组织肿瘤微血管密度与肿瘤远处转移密切相关，进一步证实为肿瘤患者预后不良的指标之一。这表明VEGF、bFGF蛋白表达水平与骨肉瘤微血管密度密切相关，VEGF、bFGF蛋白表达阳性患者其肿瘤出现远处转移的机率高于阴性组，与Toi等[3]在乳腺癌及胃癌中的研究中也有类似之处。推测可能与VEGF、bFGF分别和相应受体结合后，通过信号传导途径，激活u-PA或(和)t-PA，介导血管基膜蛋白Ⅳ型胶原、层粘连蛋白、纤维粘连蛋白降解有关[4]。我们首先发现EGF蛋白对骨肉瘤血管形成有调节作用，目前对于EGF调节血管形成的机制尚不很清楚，多数学者认为EGF通过作用于细胞表面受体，激活受体蛋白自身的酪氨酸激酶活性，使受体酪氨酸残基发生自磷酸化，从而启动刺激细胞增生信号途径。VEGF 、bFGF蛋白表达水平与患者术后生存时间密切相关，提示VEGF 、bFGF可能成为临床对骨肉瘤患者进行预后判断的新的参考指标，并为临床抑制骨肉瘤血管形成治疗提供了一定的实验依据。
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作者单位：徐勤枝(200433 上海，第二军医大学附属第一医院呼吸内科)
高奉浔(第三军医大学附属第三医院病理科)
参考文献
1 Fidler IJ,Ellis LM. The implication of angiogenesis for the biology and therapy of cancer metastasis. Cell, 1994,79:185-188.
2 Maeda K, Chung YS, Ogawa Y, et al. Prognostic value of vascular endothelial growth factor expression in gastric carcinoma. Cancer, 1996,77:858-863.
3 Toi M,Hoshina S, Takayanagi T, et al. Association of vascular endothelial growth factor expression with tumor angiogenesis and with early relapse in primary breast cancer. Jpn J Cancer , 1994,85:1045-1049.
4 Bicknell R, Harri AL. Mechanisms and therapeutic implication of angiogenesis . Curr Opin Oncol ,1996,8:60-65., 百拇医药
徐勤枝 高奉浔 李增鹏 刘忠令
关键词；骨肉瘤
肿瘤性血管的形成受血管形成因子的特异性调节,肿瘤细胞及宿主细胞产生并释放多种血管形成肽，刺激血管内皮细胞分裂、增殖、迁移并吻合成新血管[1]。本实验以人体骨肉瘤切除标本为材料，检测血管形成因子血管内皮细胞生长因子(VEGF)、碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)、内皮生长因子(EGF)蛋白的表达，探讨各血管形成因子与肿瘤微血管密度、骨肉瘤远处转移的关系及对患者预后的意义。
一、材料与方法
1.手术切除的58例骨肉瘤标本，常规4%甲醛固定。石蜡包埋，4 μm连续切片，分别进行HE及免疫组织化学染色。兔抗VEGF、bFGF及EGF(SANTA CRUZ公司)，工作浓度分别为1∶20，1∶50和1∶50。以0.01 mol/L PBS漂洗3×5 min，以PBS代替一抗作为阴性对照。
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2.免疫组织化学染色结果判断[2]：判定标准以细胞膜和(或)胞质出现棕黄色颗粒为阳性细胞。每例切片随机选择10个中倍视野(×200)观察，计数肿瘤细胞阳性细胞数并结合染色强度。为便于数据统计分析，将其分为2级：阳性：(+)，阳性细胞数>5%，染色强度与背景相比，细胞胞质或膜有明显棕黄色颗粒；阴性：(-)，阳性细胞数<5%，或染色强度与背景相近。肿瘤微血管密度: 在低倍镜下(×40)选择微血管密集区(hot spots)，然后在高倍视野(×200)选择5个视野计数微血管数目，取5个视野均值。单个阳性细胞，孤立的内皮细胞簇及独立的血管分支均作为血管数目。微血管直径大于8个红细胞直径时，组织坏死区域以及切片边缘部分均不在计数范围内。
3.统计学分析：计数资料以二维列联表法进行相关分析。
二、结果
1.骨肉瘤微血管密度标记第八因子相关抗原：Ag的免疫细胞化学染色：肿瘤内微血管密度计数结果最低值为21，最高值142，中位数为57，均值为60.97。肿瘤微血管密度≥61者27例，肿瘤转移率为65.20%(15/27)，<61者31例，肿瘤转移率为34.81%。χ2检验发现高肿瘤微血管密度组，其肿瘤出现远处转移机率高(P<0.05)，相关性分析表明：肿瘤内微血管数与患者术后生存时间密切相关(P<0.05)，微血管数目高者其生存时间短。
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2.血管形成因子VEGF、bFGF和EGF的免疫细胞化学染色:VEGF、bFGF和 EGF阳性产物呈棕褐色颗粒状，定位于肿瘤细胞胞质及血管内皮细胞胞质，胞核未见着色。58例骨肉瘤组织VEGF 、bFGF和 EGF阳性率分别为51.7%(30/58)、55.2%(32/58)和39.7%(23/58)。
3.血管形成因子染色与肿瘤内肿瘤微血管密度肿瘤转移及3年生存率的关系统计检验提示VEGF、bFGF阳性表达分别与肿瘤内肿瘤微血管密度、肿瘤转移及术后3年生存时间相关显著，EGF蛋白阳性表达在肿瘤微血管密度两组间差异有显著性(P<0.05)，与肿瘤转移、患者术后生存时间无显著相关性。
三、讨论
肿瘤增殖与转移依赖于血管形成，其过程极为复杂，取决于血管形成因子与抑制因子相互拮抗作用的失衡，其中血管形成因子发挥着重要作用。我们的结果发现骨肉瘤组织肿瘤微血管密度与肿瘤远处转移密切相关，进一步证实为肿瘤患者预后不良的指标之一。这表明VEGF、bFGF蛋白表达水平与骨肉瘤微血管密度密切相关，VEGF、bFGF蛋白表达阳性患者其肿瘤出现远处转移的机率高于阴性组，与Toi等[3]在乳腺癌及胃癌中的研究中也有类似之处。推测可能与VEGF、bFGF分别和相应受体结合后，通过信号传导途径，激活u-PA或(和)t-PA，介导血管基膜蛋白Ⅳ型胶原、层粘连蛋白、纤维粘连蛋白降解有关[4]。我们首先发现EGF蛋白对骨肉瘤血管形成有调节作用，目前对于EGF调节血管形成的机制尚不很清楚，多数学者认为EGF通过作用于细胞表面受体，激活受体蛋白自身的酪氨酸激酶活性，使受体酪氨酸残基发生自磷酸化，从而启动刺激细胞增生信号途径。VEGF 、bFGF蛋白表达水平与患者术后生存时间密切相关，提示VEGF 、bFGF可能成为临床对骨肉瘤患者进行预后判断的新的参考指标，并为临床抑制骨肉瘤血管形成治疗提供了一定的实验依据。
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作者单位：徐勤枝(200433 上海，第二军医大学附属第一医院呼吸内科)
高奉浔(第三军医大学附属第三医院病理科)
参考文献
1 Fidler IJ,Ellis LM. The implication of angiogenesis for the biology and therapy of cancer metastasis. Cell, 1994,79:185-188.
2 Maeda K, Chung YS, Ogawa Y, et al. Prognostic value of vascular endothelial growth factor expression in gastric carcinoma. Cancer, 1996,77:858-863.
3 Toi M,Hoshina S, Takayanagi T, et al. Association of vascular endothelial growth factor expression with tumor angiogenesis and with early relapse in primary breast cancer. Jpn J Cancer , 1994,85:1045-1049.
4 Bicknell R, Harri AL. Mechanisms and therapeutic implication of angiogenesis . Curr Opin Oncol ,1996,8:60-65., 百拇医药