颈髓损伤对颈髓细胞线粒体膜流动性与线粒体呼吸功能的影响
颈髓损伤对颈髓细胞线粒体膜流动性与线粒体呼吸功能的影响
邵擎东 肖建如 杨金华 侯铁胜 李医明
摘 要 目的 探讨颈髓损伤后颈髓细胞线粒体膜流动性变化与线粒体呼吸功能的关系。 方法 30只猫随机分成假手术组(对照组)和颈髓损伤后2，6，24，72 h组，每组6只。采用Allen打击法造成猫颈髓损伤，观察颈髓损伤后线粒体膜流动性、磷脂酶A2(PLA2)活性、线粒体呼吸控制率(RCR)、磷氧比值(P/O)、氧化磷酸化效率(OPR)的变化。 结果 颈髓损伤后2～72 h线粒体膜PLA2活性较假手术对照组明显增高(P<0.05)，而线粒体膜流动性、RCR、P/O比值、OPR均较假手术对照组明显降低(P<0.05)。 结论 颈髓损伤后，PLA2激活与膜流动性降低密切相关，颈髓线粒体膜流动性降低在颈髓损伤后线粒体呼吸功能损害的病理过程中起重要作用。
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关键词：脊髓损伤；线粒体；膜流动性
颈髓损伤后继发性损害是导致脊髓神经功能难以逆转的主要因素，而细胞生命活动所需能量90%以上由线粒体氧化磷酸化提供。因此，线粒体功能的改变直接影响神经细胞的功能。笔者采用超速离心法分离颈髓细胞线粒体，观察颈髓损伤后线粒体膜流动性、磷脂酶A2(PLA2)活性、线粒体呼吸功能的变化及其关系，从亚细胞水平探讨颈髓损伤后继发性损害的病理生理演变过程。
材料与方法
1. 实验动物分组：健康成年雄性猫30只，体重2.5～3.5 kg，随机分成假手术组(对照组)和颈髓损伤后2，6，24，72 h组，每组6只。
2. 颈髓损伤模型制作：各组动物均用质量浓度为30 g/L的戊巴比妥钠行腹腔注射麻醉(40 mg/kg)。咬除C6，7椎板，显露硬膜囊，致伤组采用Allen打击法造成C6，7段脊髓挫伤，致伤力为350 g.cm，对照组不致伤。所有动物均行右股动、静脉插管。必要时输液，使血压维持在97.5 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)以上。
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3. 颈髓细胞线粒体提取方法：按改良的Koide法[1]，各组于伤后相应时间切取C6，7颈髓组织，称重后迅速放入冷的缓冲液A中[含0.32 mol/L蔗糖、10 mmol/L 双乙醇双四乙酸(EGTA)、50 mmol/L Tris-HCl, pH7.4]，1 000×g离心10 min，取上清液17 000×g离心20 min，沉淀置于缓冲液B中(含0.32 mol/L 蔗糠、50 mmol/L Tris-HCl, pH7.4)，在质量浓度为75 g/L， 120 g/L 聚蔗糖(Ficcll)组成的不连续密度梯度上，以68 000×g离心1 h，其沉淀物即为线粒体，置于缓冲液B中低温保存待测。
4. 线粒体膜流动性及PLA2活性检测：膜流动性按聂松青等[2]方法进行，用MPF-4荧光光度计检测荧光偏振度P(激发波长362 nm，发射波长432 nm)，计算平均黏度(η)=2 P/0.46-P。η值越大，膜的流动性越小。PLA2活性检测采用化学滴定法[3]。
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5. 线粒体呼吸功能测定：用测氧仪连接台式自动平衡记录和恒温水浴，通过氧电极在30℃测定密闭连接搅拌的反应体系中的线粒体耗氧量，并根据线粒体耗氧量(nmol.min-1.mg-1)换算出线粒体呼吸控制率(RCR)、磷氧比值(P/O)、氧化磷酸化效率(OPR)。
6. 统计学处理：所有数据以±s表示，用t检验进行统计学分析。
结 果
1. 颈髓细胞线粒体膜PLA2活性及膜流动性变化：颈髓线粒体膜PLA2活性及η值在伤后早期显著增高，两者均在伤后6 h达高峰，其中PLA2活性在伤后2，6，24，72 h分别为对照组的1.71，2.58，1.92，1.65倍，η值分别为对照组的1.58，1.92，1.57，1.29倍。见表1。
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表1 猫颈髓损伤后颈髓细胞线粒体膜PLA2活性
及膜流动性的变化(±s)
组别
猫数
PLA2(U/mg)
η值
对照组
6
7.06±1.34
2.71±0.32
伤后2h组
6
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12.09±2.81*
4.27±0.69*
伤后6h组
6
18.23±2.79**
5.19±0.76**
伤后24h组
6
13.57±2.45*
4.25±0.53*
, http://www.100md.com 伤后72h组
6
11.65±2.62*
3.49±0.46*
与对照组比较：*P<0.05 **P<0.01 2. 颈髓细胞线粒体呼吸功能变化：颈髓损伤后2 h线粒体RCR、P/O值、OPR均明显下降(P<0.01)，至伤后24 h达最低值，OPR下降尤为显著。见表2。
表2 猫颈髓损伤后颈髓细胞线粒体
呼吸功能的变化(±s)
组别
猫数
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RCR(%)
P/O值
OPR(%)
对照组
6
6.08±0.78
2.64±0.41
383.63±46.01
伤后 2 h组
6
5.15±0.69*
2.07±0.39*
, http://www.100md.com
317.75±39.24*
伤后 6 h组
6
4.68±0.63*
1.43±0.21*
240.94±57.26*
伤后24 h组
6
3.05±0.31**
1.36±0.18**
, http://www.100md.com
190.52±28.07**
伤后72 h组
6
4.32±0.37*
1.43±0.17*
251.65±52.39*
与对照组比较：*P<0.05 **P<0.01讨 论
近几年来，线粒体等亚细胞器在中枢神经系统损伤后继发性损伤中的作用日益受到重视。线粒体是氧自由基产生的重要场所，线粒体的生物膜是动态结构，线粒体膜的流动性包括膜脂的流动性和膜蛋白的运动性，生物膜的各种功能与膜流动性密切相关[4]。本实验动态观察了颈髓细胞线粒体膜的流动性，结果显示，伤后2～72 h线粒体膜PLA2活性与η值升降幅度基本一致，提示颈髓损伤可使PLA2激活，引起膜的流动性降低。其原因系损伤早期磷脂酶A2活性增高使膜磷脂降解，多不饱和脂肪酸丢失，导致线粒体膜流动性下降，伤后6 h降至最低，这与伤后早期脂质过氧化反应、自由基增加促进膜磷脂降解有关。
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研究结果还显示，颈髓损伤后2 h即出现线粒体呼吸功能损害，以24 h为甚。正常情况下，线粒体产生的少量自由基很快被超氧化物歧化酶(SOD)参与的清除系统所清除，故不产生病理效应。但在伤后颈髓继发性缺血、缺氧情况下，导致参与电子转运的黄素二核腺苷、半醌辅酶解体，由于线粒体呼吸链电子传递发生障碍，还原型辅酶Ⅱ(NADH)得不到氧化而堆积。NADH是有效的电子供体，可使溶解在膜脂质中的氧分子单价还原，从而导致氧自由基不断生成。自由基是一种活性很强的炎性介质，主要破坏膜脂质，减少了多不饱和脂肪酸链的长度，使线粒体膜流动性降低。而膜流动性降低将对膜系统(ATP酶、细胞色素氧化酶)产生抑制，膜受体功能产生损害，使其不能发挥正常的生理功能，进而抑制了线粒体的呼吸功能[5]。
研究表明，颈髓损伤后PLA2激活与膜流动性降低密切相关，两者在颈髓损伤后线粒体功能损害的病理生理过程中起非常重要的作用。
作者单位：邵擎东(上海，解放军第四五五医院骨科 200052)
, 百拇医药
肖建如(第二军医大学附属长征医院骨科)
杨金华(第二军医大学附属长征医院骨科)
侯铁胜(第二军医大学附属长征医院骨科)
李医明(第二军医大学附属长征医院骨科)
参考文献
1，Koide T, Asano T, Matsushita H, et al. Enhancement of ATPase activity by a lipid peroxide of AA in rat brain microvessels. J Neurochem, 1986, 46:235-238.
2，聂松青，薄惠卿，林克椿.蜂王精对大鼠红细胞膜流动性的影响.北京医学院学报，1983， 62：112-115.
, 百拇医药
3，陈思锋，吴中立.体液和组织磷脂酶A2简便快速检测方法.第二军医大学学报，1989， 10：254-257.
4，Liu MS. Mechanisms of myocardial membrane alteration in endotoxin shock: role of phospholipase and posphorylation. Circ Shock, 1990, 30:43-45.
5，Sun D, Gillboe DD. Ischemia-induced changes in cerebral mitochondrial free fatty acids, phospholipids and respiration in the rats. J Neurochem, 1994, 62:1921-1924., http://www.100md.com
邵擎东 肖建如 杨金华 侯铁胜 李医明
摘 要 目的 探讨颈髓损伤后颈髓细胞线粒体膜流动性变化与线粒体呼吸功能的关系。 方法 30只猫随机分成假手术组(对照组)和颈髓损伤后2，6，24，72 h组，每组6只。采用Allen打击法造成猫颈髓损伤，观察颈髓损伤后线粒体膜流动性、磷脂酶A2(PLA2)活性、线粒体呼吸控制率(RCR)、磷氧比值(P/O)、氧化磷酸化效率(OPR)的变化。 结果 颈髓损伤后2～72 h线粒体膜PLA2活性较假手术对照组明显增高(P<0.05)，而线粒体膜流动性、RCR、P/O比值、OPR均较假手术对照组明显降低(P<0.05)。 结论 颈髓损伤后，PLA2激活与膜流动性降低密切相关，颈髓线粒体膜流动性降低在颈髓损伤后线粒体呼吸功能损害的病理过程中起重要作用。
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关键词：脊髓损伤；线粒体；膜流动性
颈髓损伤后继发性损害是导致脊髓神经功能难以逆转的主要因素，而细胞生命活动所需能量90%以上由线粒体氧化磷酸化提供。因此，线粒体功能的改变直接影响神经细胞的功能。笔者采用超速离心法分离颈髓细胞线粒体，观察颈髓损伤后线粒体膜流动性、磷脂酶A2(PLA2)活性、线粒体呼吸功能的变化及其关系，从亚细胞水平探讨颈髓损伤后继发性损害的病理生理演变过程。
材料与方法
1. 实验动物分组：健康成年雄性猫30只，体重2.5～3.5 kg，随机分成假手术组(对照组)和颈髓损伤后2，6，24，72 h组，每组6只。
2. 颈髓损伤模型制作：各组动物均用质量浓度为30 g/L的戊巴比妥钠行腹腔注射麻醉(40 mg/kg)。咬除C6，7椎板，显露硬膜囊，致伤组采用Allen打击法造成C6，7段脊髓挫伤，致伤力为350 g.cm，对照组不致伤。所有动物均行右股动、静脉插管。必要时输液，使血压维持在97.5 mm Hg(1 mm Hg=0.133 kPa)以上。
, 百拇医药
3. 颈髓细胞线粒体提取方法：按改良的Koide法[1]，各组于伤后相应时间切取C6，7颈髓组织，称重后迅速放入冷的缓冲液A中[含0.32 mol/L蔗糖、10 mmol/L 双乙醇双四乙酸(EGTA)、50 mmol/L Tris-HCl, pH7.4]，1 000×g离心10 min，取上清液17 000×g离心20 min，沉淀置于缓冲液B中(含0.32 mol/L 蔗糠、50 mmol/L Tris-HCl, pH7.4)，在质量浓度为75 g/L， 120 g/L 聚蔗糖(Ficcll)组成的不连续密度梯度上，以68 000×g离心1 h，其沉淀物即为线粒体，置于缓冲液B中低温保存待测。
4. 线粒体膜流动性及PLA2活性检测：膜流动性按聂松青等[2]方法进行，用MPF-4荧光光度计检测荧光偏振度P(激发波长362 nm，发射波长432 nm)，计算平均黏度(η)=2 P/0.46-P。η值越大，膜的流动性越小。PLA2活性检测采用化学滴定法[3]。
, http://www.100md.com
5. 线粒体呼吸功能测定：用测氧仪连接台式自动平衡记录和恒温水浴，通过氧电极在30℃测定密闭连接搅拌的反应体系中的线粒体耗氧量，并根据线粒体耗氧量(nmol.min-1.mg-1)换算出线粒体呼吸控制率(RCR)、磷氧比值(P/O)、氧化磷酸化效率(OPR)。
6. 统计学处理：所有数据以±s表示，用t检验进行统计学分析。
结 果
1. 颈髓细胞线粒体膜PLA2活性及膜流动性变化：颈髓线粒体膜PLA2活性及η值在伤后早期显著增高，两者均在伤后6 h达高峰，其中PLA2活性在伤后2，6，24，72 h分别为对照组的1.71，2.58，1.92，1.65倍，η值分别为对照组的1.58，1.92，1.57，1.29倍。见表1。
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表1 猫颈髓损伤后颈髓细胞线粒体膜PLA2活性
及膜流动性的变化(±s)
组别
猫数
PLA2(U/mg)
η值
对照组
6
7.06±1.34
2.71±0.32
伤后2h组
6
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12.09±2.81*
4.27±0.69*
伤后6h组
6
18.23±2.79**
5.19±0.76**
伤后24h组
6
13.57±2.45*
4.25±0.53*
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6
11.65±2.62*
3.49±0.46*
与对照组比较：*P<0.05 **P<0.01 2. 颈髓细胞线粒体呼吸功能变化：颈髓损伤后2 h线粒体RCR、P/O值、OPR均明显下降(P<0.01)，至伤后24 h达最低值，OPR下降尤为显著。见表2。
表2 猫颈髓损伤后颈髓细胞线粒体
呼吸功能的变化(±s)
组别
猫数
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RCR(%)
P/O值
OPR(%)
对照组
6
6.08±0.78
2.64±0.41
383.63±46.01
伤后 2 h组
6
5.15±0.69*
2.07±0.39*
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317.75±39.24*
伤后 6 h组
6
4.68±0.63*
1.43±0.21*
240.94±57.26*
伤后24 h组
6
3.05±0.31**
1.36±0.18**
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190.52±28.07**
伤后72 h组
6
4.32±0.37*
1.43±0.17*
251.65±52.39*
与对照组比较：*P<0.05 **P<0.01讨 论
近几年来，线粒体等亚细胞器在中枢神经系统损伤后继发性损伤中的作用日益受到重视。线粒体是氧自由基产生的重要场所，线粒体的生物膜是动态结构，线粒体膜的流动性包括膜脂的流动性和膜蛋白的运动性，生物膜的各种功能与膜流动性密切相关[4]。本实验动态观察了颈髓细胞线粒体膜的流动性，结果显示，伤后2～72 h线粒体膜PLA2活性与η值升降幅度基本一致，提示颈髓损伤可使PLA2激活，引起膜的流动性降低。其原因系损伤早期磷脂酶A2活性增高使膜磷脂降解，多不饱和脂肪酸丢失，导致线粒体膜流动性下降，伤后6 h降至最低，这与伤后早期脂质过氧化反应、自由基增加促进膜磷脂降解有关。
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研究结果还显示，颈髓损伤后2 h即出现线粒体呼吸功能损害，以24 h为甚。正常情况下，线粒体产生的少量自由基很快被超氧化物歧化酶(SOD)参与的清除系统所清除，故不产生病理效应。但在伤后颈髓继发性缺血、缺氧情况下，导致参与电子转运的黄素二核腺苷、半醌辅酶解体，由于线粒体呼吸链电子传递发生障碍，还原型辅酶Ⅱ(NADH)得不到氧化而堆积。NADH是有效的电子供体，可使溶解在膜脂质中的氧分子单价还原，从而导致氧自由基不断生成。自由基是一种活性很强的炎性介质，主要破坏膜脂质，减少了多不饱和脂肪酸链的长度，使线粒体膜流动性降低。而膜流动性降低将对膜系统(ATP酶、细胞色素氧化酶)产生抑制，膜受体功能产生损害，使其不能发挥正常的生理功能，进而抑制了线粒体的呼吸功能[5]。
研究表明，颈髓损伤后PLA2激活与膜流动性降低密切相关，两者在颈髓损伤后线粒体功能损害的病理生理过程中起非常重要的作用。
作者单位：邵擎东(上海，解放军第四五五医院骨科 200052)
, 百拇医药
肖建如(第二军医大学附属长征医院骨科)
杨金华(第二军医大学附属长征医院骨科)
侯铁胜(第二军医大学附属长征医院骨科)
李医明(第二军医大学附属长征医院骨科)
参考文献
1，Koide T, Asano T, Matsushita H, et al. Enhancement of ATPase activity by a lipid peroxide of AA in rat brain microvessels. J Neurochem, 1986, 46:235-238.
2，聂松青，薄惠卿，林克椿.蜂王精对大鼠红细胞膜流动性的影响.北京医学院学报，1983， 62：112-115.
, 百拇医药
3，陈思锋，吴中立.体液和组织磷脂酶A2简便快速检测方法.第二军医大学学报，1989， 10：254-257.
4，Liu MS. Mechanisms of myocardial membrane alteration in endotoxin shock: role of phospholipase and posphorylation. Circ Shock, 1990, 30:43-45.
5，Sun D, Gillboe DD. Ischemia-induced changes in cerebral mitochondrial free fatty acids, phospholipids and respiration in the rats. J Neurochem, 1994, 62:1921-1924., http://www.100md.com