积极审慎地开展创面愈合的基因治疗研究
付小兵 盛志勇
关键词：创面愈合；基因治疗 尽管基因治疗的最早思路是用于治疗单基因遗传性疾病，如囊性纤维化(CF)，但近年来这一技术已被广泛应用于刺激特异性免疫反应、介导细胞杀伤等诸多领域。在组织修复方面，人们希望通过基因转移技术去影响组织修复的自然过程，使正常条件下创面愈合的时间缩短，加速或使难愈的创面愈合[1，2]。但近年来，实验室与临床初试的结果尚没有完全证明该方法具有优于或完全能替代其他方法的优越之处，特别是有关转基因疗法应用于创面修复的目的性、安全性以及实用手段等问题尚未完全解决。故在临床应用前有必要就以下几个问题进行更加深入的思考与研究。
一、进一步明确创面愈合的基因调控机制与基因疗法应用于创面修复的目的性
创面愈合受基因调控已是一个不争的事实。但是创面愈合的类型、方式与时间是否受遗传因素影响则不完全清楚。流行病学调查显示，黑种人与黄种人损伤创面瘢痕疙瘩与增生性瘢痕发生率较白种人分别高1/5和1/15，提示创面愈合具有种族差异，而这种差异又可能与遗传因素有关。笔者曾设想并在探索中的“修复基因”近来已获证实。美国科学家的研究表明，一种被称之为Smad 3的蛋白及其基因对创面愈合非常重要。普通带有3倍Smad 3基因鼠的创面愈合时间为5 d，而带有1倍或不带Smad 3基因鼠的创面则在3 d和2 d内愈合，提示这种Smad 3基因就是控制创面愈合的“修复基因”。但到目前为止，创面愈合的遗传学机制、多基因机制以及网络调控机制尚不完全清楚。就已开展的工作来看，应用于创面修复的基因疗法本质上仅是一种生长因子的基因疗法，其目的是基于创面直接应用生长因子半衰期短或易受创面盐类与油类介质影响而活性降低等因素。但人们忽略了一个重要事实，即在绝大多数创面，与组织修复有关的内源性生长因子基因或蛋白表达下调常常是一种短暂的、生理性的改变或抑制，而非长久的病理性改变。相反，在有的创面，生长因子的含量其实并不低，因而在这些情况下导入外源性生长因子基因是否有更多价值值得考虑。其次，组织修复是一个复杂的网络调控过程，其真正动力还在于参与组织修复的细胞本身，如成纤维细胞、血管内皮细胞以及上皮细胞等。这些细胞在正常修复条件下的遗传学特征以及在“失控”修复状态下的遗传学改变将直接影响修复的结局。因此，从基因治疗的角度来讲，有必要也将它们列为基因改造的目标。设想目前发现的Smad 3基因是一种控制组织修复中实质细胞的基因，而非生长因子调控基因。如果这样，可以认为创面愈合本身也有其遗传学机制，而“修复基因”的“失控”则可能是创面愈合延迟、不愈合或过度愈合的真正原因。据此，笔者认为用于创面愈合基因疗法的目的性至少应包括3方面：一是对创面修复调控因子的基因疗法；二是对创面修复成分进行修饰的基因疗法；三是改变创面修复遗传特征的基因疗法[3]。
, 百拇医药
二、应当客观评价目前创面愈合基因治疗已取得的阶段性成果
基因治疗应用于创面愈合的主要靶器官是皮肤。目前在细胞培养与在体条件下的研究已获成功。在表皮细胞研究中，通过逆转录病毒介导、微粒子轰击以及脂质体等技术将目的基因，如血小板衍化生长因子A(PDGF-A)基因、胰岛素样生长因子1(IGF-1)基因、表皮细胞生长因子(EGF)基因等导入培养的人角化细胞或直接应用于动物皮肤，可以观察到这些受转染的细胞具有分泌PDGF-A与IGF-1或显著加速创面愈合等作用，表明基因转染引起了这些细胞遗传信息的改变，从而影响了组织修复进程。真皮成纤维细胞的转基因疗法与表皮类似，可根据不同需要导入不同因子的基因。有作者观察到，将用质粒转染了酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)的真核细胞移植创面后，其创面抗拉力强度较对照组明显增强；将转染了分泌型EGF cDNA的人成纤维细胞KMST 6植于裸鼠全厚创面，可持续分泌EGF 7 d。但总的来讲，目前用于皮肤基因疗法的内容非常局限，仅限于改变某些影响创面修复的因素上，即仅是生长因子的基因疗法，而没有触及修复细胞本身，因而尚不能从根本上改变修复过程。
, 百拇医药
骨关节与韧带修复也是目前创伤修复基因疗法的重点。研究表明，采用生长因子的基因疗法，如转导入EGF、PDGF以及转化生长因子β(TGF-β)基因，可以显著加速成纤维细胞增殖或提高胞外基质蛋白产量。一个典型的实验是用脂质体法将lac I基因转移至手术后3 d鼠的膑韧带受创部位，结果转染上lac I的阳性细胞(主要为成纤维细胞或巨噬细胞/单核细胞)表达lac I于伤后7 d达高峰，56 d仍有阳性表达，其时相与修复过程相一致。
血循环重建是修复的重要基础。研究表明，用逆转录病毒载体将lac I基因转导入内皮细胞，再将转染后的内皮细胞植入合成的血管，结果lac I基因表达可持续5周。在冠状动脉缺血性疾病或外周血管性疾病，采用现有的基因疗法，可引起靶组织产生显著的血管生长以及邻近组织再生等作用。将含有MyoD的腺病毒注入正在愈合的小鼠心脏肉芽组织中，能使其分化出骨骼肌细胞，从而使梗死后的细胞修复出现收缩性的组织细胞；低剂量注射时，心脏肉芽组织中有MyoD的mRNA和蛋白表达，但没有骨骼肌肌球蛋白重链和肌浆蛋白原的表达，在大剂量时二者均有表达[2，4]。
, http://www.100md.com
三、应当更加密切关注创面愈合基因治疗尚待解决的主要问题[5，6]
1. 安全性：目前有关基因疗法应用于创面愈合的安全性问题尚未完全解决。它包括两方面内容，一是方法本身的安全性，二是转基因事件发生后目的基因在体内受控的安全性。目前，尽管毒性较高的重组腺病毒技术已较少应用，而非病毒转导的脂质体技术与基因枪技术以及重组逆转录病毒技术已获得较广泛应用，但应用后引起的局部炎症反应、流行性感冒样综合征以及整合入外源性DNA可能导致的恶性转化等改变仍值得人们注意。加之这些常用的技术存在转染的DNA片段小，或目的基因表达短暂，或整合的DNA稳定性较低等因素，故在用于人体时，其方法学的安全性仍然受到怀疑。另一方面，转导入体内后，目的基因的可控性是安全性考虑的另一重点。从创面愈合的生理学来讲，许多与修复有关的生长因子的基因和蛋白在正常条件下处于“失活”的储存状态。当损伤发生后，部分参与组织修复的生长因子基因激活与表达上调也仅仅发生在修复的某一阶段，呈有序而可控，而非持续的激活与表达。尽管一般转染基因表达的时间仅为数天或2～3周，但近来有实验报告，某些转基因研究的目的基因在体内表达可持续5周甚至8周以上。目前尚没有外源性基因转导入修复组织后受调控的详细报告，特别是转入的外源性基因与组织相同的内源性基因之间的相互关系尚不清楚。因此，人们担心一旦导入的外源性基因发生失控将产生灾难性后果。
, 百拇医药
2. 实用性：实用性研究是基因疗法走向临床应用的重要环节。尽管目前所采用的非病毒转导技术与病毒转染技术已有其实用价值，但距方便、快捷的临床应用还有一定差距，大部分仍停留在实验室阶段。以脂质体转导技术为例，它需要将细胞分离，经体外培养、修饰后再移植回体内，对培养条件与移植技术有一定要求，并且治疗将花去较长的时间。再如体外法，可利用基因枪技术将目的基因制成带电颗粒，在高压电泳的作用下直接穿透细胞膜进入细胞，在细胞自身生理机制作用下整合到宿主染色体上，形成稳定的表达。但这种方法也有其明显的局限性，即目的性较差。因此，对于创面愈合这一类目前看来是一种非单基因缺陷性遗传性疾病的治疗采用如此复杂技术的实际意义值得考虑。
3. 经济性：方便、有效与经济性是患者接受治疗的关键。目前，由于基因工程技术的发展和迅速普及与应用，使得在基因工厂生产用于创面修复的基因工程药物，如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和EGF，已变得十分容易，并且这类药物应用于临床的价格也变得十分低廉，且创面直接应用生长因子蛋白具有方便、快捷等特点。而转基因技术尽管具有目的明确与表达作用时间长等优势，但如果经过一套繁杂的细胞分离、培养、修饰以及回输等技术，其治疗价格与时间消耗将是创面直接应用生长因子蛋白的数倍至数十倍。因此，与一些必须采用转基因疗法治疗并有特效的经典型遗传病(如镰状红细胞性贫血、β-地中海贫血等)相比，对创面修复采用基因疗法和采用生长因子直接治疗，很显然，二者在经济消耗方面存在着显著差异。
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除此之外，鉴别靶细胞、基因转移的效率，表达期的调控，重复治疗等技术方法的解决仍是目前影响其临床应用的主要障碍。
虽然基因治疗有巨大的临床应用前景，但目前的成就离人们所希望的结果尚有较大差距。尽管如此，应当肯定的是一种新技术、新方法以及新思路的出现，将会给临床治疗带来一场革命性突破。在目前有关基因治疗的方法学、安全性以及伦理道德等尚没有完全解决之前，对创面愈合的基因治疗应当采取积极而又审慎的态度。
付小兵(100037 北京，解放军第三O四医院创伤中心)
盛志勇(100037 北京，解放军第三O四医院创伤中心)
参考文献
1，Smith AE. Gene therapy- where are we. Lancet， 1999， 354 Suppl 1:1-4.
, http://www.100md.com
2，蒋礼先，付小兵.基因治疗技术与组织修复的基因治疗.中华整形烧伤外科杂志,1999， 15：228-230.
3，付小兵，盛志勇.进一步重视创面修复研究.中华整形烧伤外科杂志，1999， 15：165-166.
4，付小兵，盛志勇.我国软组织创伤修复研究的现状与展望.中华医学杂志，1999， 79：317-318.
5，Anderson WF. Human gene therapy. Nature， 1998， 392 Suppl 6:25-30.
6，Tolstoshev P. Retroviral-mediated gene therapy-safety considerations and preclinical studies. Bone Marrow Transpl， 1992，9 Suppl 1: 148-150., http://www.100md.com
关键词：创面愈合；基因治疗 尽管基因治疗的最早思路是用于治疗单基因遗传性疾病，如囊性纤维化(CF)，但近年来这一技术已被广泛应用于刺激特异性免疫反应、介导细胞杀伤等诸多领域。在组织修复方面，人们希望通过基因转移技术去影响组织修复的自然过程，使正常条件下创面愈合的时间缩短，加速或使难愈的创面愈合[1，2]。但近年来，实验室与临床初试的结果尚没有完全证明该方法具有优于或完全能替代其他方法的优越之处，特别是有关转基因疗法应用于创面修复的目的性、安全性以及实用手段等问题尚未完全解决。故在临床应用前有必要就以下几个问题进行更加深入的思考与研究。
一、进一步明确创面愈合的基因调控机制与基因疗法应用于创面修复的目的性
创面愈合受基因调控已是一个不争的事实。但是创面愈合的类型、方式与时间是否受遗传因素影响则不完全清楚。流行病学调查显示，黑种人与黄种人损伤创面瘢痕疙瘩与增生性瘢痕发生率较白种人分别高1/5和1/15，提示创面愈合具有种族差异，而这种差异又可能与遗传因素有关。笔者曾设想并在探索中的“修复基因”近来已获证实。美国科学家的研究表明，一种被称之为Smad 3的蛋白及其基因对创面愈合非常重要。普通带有3倍Smad 3基因鼠的创面愈合时间为5 d，而带有1倍或不带Smad 3基因鼠的创面则在3 d和2 d内愈合，提示这种Smad 3基因就是控制创面愈合的“修复基因”。但到目前为止，创面愈合的遗传学机制、多基因机制以及网络调控机制尚不完全清楚。就已开展的工作来看，应用于创面修复的基因疗法本质上仅是一种生长因子的基因疗法，其目的是基于创面直接应用生长因子半衰期短或易受创面盐类与油类介质影响而活性降低等因素。但人们忽略了一个重要事实，即在绝大多数创面，与组织修复有关的内源性生长因子基因或蛋白表达下调常常是一种短暂的、生理性的改变或抑制，而非长久的病理性改变。相反，在有的创面，生长因子的含量其实并不低，因而在这些情况下导入外源性生长因子基因是否有更多价值值得考虑。其次，组织修复是一个复杂的网络调控过程，其真正动力还在于参与组织修复的细胞本身，如成纤维细胞、血管内皮细胞以及上皮细胞等。这些细胞在正常修复条件下的遗传学特征以及在“失控”修复状态下的遗传学改变将直接影响修复的结局。因此，从基因治疗的角度来讲，有必要也将它们列为基因改造的目标。设想目前发现的Smad 3基因是一种控制组织修复中实质细胞的基因，而非生长因子调控基因。如果这样，可以认为创面愈合本身也有其遗传学机制，而“修复基因”的“失控”则可能是创面愈合延迟、不愈合或过度愈合的真正原因。据此，笔者认为用于创面愈合基因疗法的目的性至少应包括3方面：一是对创面修复调控因子的基因疗法；二是对创面修复成分进行修饰的基因疗法；三是改变创面修复遗传特征的基因疗法[3]。
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二、应当客观评价目前创面愈合基因治疗已取得的阶段性成果
基因治疗应用于创面愈合的主要靶器官是皮肤。目前在细胞培养与在体条件下的研究已获成功。在表皮细胞研究中，通过逆转录病毒介导、微粒子轰击以及脂质体等技术将目的基因，如血小板衍化生长因子A(PDGF-A)基因、胰岛素样生长因子1(IGF-1)基因、表皮细胞生长因子(EGF)基因等导入培养的人角化细胞或直接应用于动物皮肤，可以观察到这些受转染的细胞具有分泌PDGF-A与IGF-1或显著加速创面愈合等作用，表明基因转染引起了这些细胞遗传信息的改变，从而影响了组织修复进程。真皮成纤维细胞的转基因疗法与表皮类似，可根据不同需要导入不同因子的基因。有作者观察到，将用质粒转染了酸性成纤维细胞生长因子(aFGF)的真核细胞移植创面后，其创面抗拉力强度较对照组明显增强；将转染了分泌型EGF cDNA的人成纤维细胞KMST 6植于裸鼠全厚创面，可持续分泌EGF 7 d。但总的来讲，目前用于皮肤基因疗法的内容非常局限，仅限于改变某些影响创面修复的因素上，即仅是生长因子的基因疗法，而没有触及修复细胞本身，因而尚不能从根本上改变修复过程。
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骨关节与韧带修复也是目前创伤修复基因疗法的重点。研究表明，采用生长因子的基因疗法，如转导入EGF、PDGF以及转化生长因子β(TGF-β)基因，可以显著加速成纤维细胞增殖或提高胞外基质蛋白产量。一个典型的实验是用脂质体法将lac I基因转移至手术后3 d鼠的膑韧带受创部位，结果转染上lac I的阳性细胞(主要为成纤维细胞或巨噬细胞/单核细胞)表达lac I于伤后7 d达高峰，56 d仍有阳性表达，其时相与修复过程相一致。
血循环重建是修复的重要基础。研究表明，用逆转录病毒载体将lac I基因转导入内皮细胞，再将转染后的内皮细胞植入合成的血管，结果lac I基因表达可持续5周。在冠状动脉缺血性疾病或外周血管性疾病，采用现有的基因疗法，可引起靶组织产生显著的血管生长以及邻近组织再生等作用。将含有MyoD的腺病毒注入正在愈合的小鼠心脏肉芽组织中，能使其分化出骨骼肌细胞，从而使梗死后的细胞修复出现收缩性的组织细胞；低剂量注射时，心脏肉芽组织中有MyoD的mRNA和蛋白表达，但没有骨骼肌肌球蛋白重链和肌浆蛋白原的表达，在大剂量时二者均有表达[2，4]。
, http://www.100md.com
三、应当更加密切关注创面愈合基因治疗尚待解决的主要问题[5，6]
1. 安全性：目前有关基因疗法应用于创面愈合的安全性问题尚未完全解决。它包括两方面内容，一是方法本身的安全性，二是转基因事件发生后目的基因在体内受控的安全性。目前，尽管毒性较高的重组腺病毒技术已较少应用，而非病毒转导的脂质体技术与基因枪技术以及重组逆转录病毒技术已获得较广泛应用，但应用后引起的局部炎症反应、流行性感冒样综合征以及整合入外源性DNA可能导致的恶性转化等改变仍值得人们注意。加之这些常用的技术存在转染的DNA片段小，或目的基因表达短暂，或整合的DNA稳定性较低等因素，故在用于人体时，其方法学的安全性仍然受到怀疑。另一方面，转导入体内后，目的基因的可控性是安全性考虑的另一重点。从创面愈合的生理学来讲，许多与修复有关的生长因子的基因和蛋白在正常条件下处于“失活”的储存状态。当损伤发生后，部分参与组织修复的生长因子基因激活与表达上调也仅仅发生在修复的某一阶段，呈有序而可控，而非持续的激活与表达。尽管一般转染基因表达的时间仅为数天或2～3周，但近来有实验报告，某些转基因研究的目的基因在体内表达可持续5周甚至8周以上。目前尚没有外源性基因转导入修复组织后受调控的详细报告，特别是转入的外源性基因与组织相同的内源性基因之间的相互关系尚不清楚。因此，人们担心一旦导入的外源性基因发生失控将产生灾难性后果。
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2. 实用性：实用性研究是基因疗法走向临床应用的重要环节。尽管目前所采用的非病毒转导技术与病毒转染技术已有其实用价值，但距方便、快捷的临床应用还有一定差距，大部分仍停留在实验室阶段。以脂质体转导技术为例，它需要将细胞分离，经体外培养、修饰后再移植回体内，对培养条件与移植技术有一定要求，并且治疗将花去较长的时间。再如体外法，可利用基因枪技术将目的基因制成带电颗粒，在高压电泳的作用下直接穿透细胞膜进入细胞，在细胞自身生理机制作用下整合到宿主染色体上，形成稳定的表达。但这种方法也有其明显的局限性，即目的性较差。因此，对于创面愈合这一类目前看来是一种非单基因缺陷性遗传性疾病的治疗采用如此复杂技术的实际意义值得考虑。
3. 经济性：方便、有效与经济性是患者接受治疗的关键。目前，由于基因工程技术的发展和迅速普及与应用，使得在基因工厂生产用于创面修复的基因工程药物，如碱性成纤维细胞生长因子(bFGF)和EGF，已变得十分容易，并且这类药物应用于临床的价格也变得十分低廉，且创面直接应用生长因子蛋白具有方便、快捷等特点。而转基因技术尽管具有目的明确与表达作用时间长等优势，但如果经过一套繁杂的细胞分离、培养、修饰以及回输等技术，其治疗价格与时间消耗将是创面直接应用生长因子蛋白的数倍至数十倍。因此，与一些必须采用转基因疗法治疗并有特效的经典型遗传病(如镰状红细胞性贫血、β-地中海贫血等)相比，对创面修复采用基因疗法和采用生长因子直接治疗，很显然，二者在经济消耗方面存在着显著差异。
, 百拇医药
除此之外，鉴别靶细胞、基因转移的效率，表达期的调控，重复治疗等技术方法的解决仍是目前影响其临床应用的主要障碍。
虽然基因治疗有巨大的临床应用前景，但目前的成就离人们所希望的结果尚有较大差距。尽管如此，应当肯定的是一种新技术、新方法以及新思路的出现，将会给临床治疗带来一场革命性突破。在目前有关基因治疗的方法学、安全性以及伦理道德等尚没有完全解决之前，对创面愈合的基因治疗应当采取积极而又审慎的态度。
付小兵(100037 北京，解放军第三O四医院创伤中心)
盛志勇(100037 北京，解放军第三O四医院创伤中心)
参考文献
1，Smith AE. Gene therapy- where are we. Lancet， 1999， 354 Suppl 1:1-4.
, http://www.100md.com
2，蒋礼先，付小兵.基因治疗技术与组织修复的基因治疗.中华整形烧伤外科杂志,1999， 15：228-230.
3，付小兵，盛志勇.进一步重视创面修复研究.中华整形烧伤外科杂志，1999， 15：165-166.
4，付小兵，盛志勇.我国软组织创伤修复研究的现状与展望.中华医学杂志，1999， 79：317-318.
5，Anderson WF. Human gene therapy. Nature， 1998， 392 Suppl 6:25-30.
6，Tolstoshev P. Retroviral-mediated gene therapy-safety considerations and preclinical studies. Bone Marrow Transpl， 1992，9 Suppl 1: 148-150., http://www.100md.com