γ-干扰素对肝星状细胞表达a1(Ⅰ) mRNA信号传递途径的影响
杨永平 陈德永 孔宪涛 张世兰 张伟 宋喜秀
关键词：IFN-γ HSC前胶原；基因表达；信号传递
探讨IFN-γ对HSC前胶原基因表达的信号传递途径影响。
一、材料与方法
1. 鼠a1(Ⅰ) cDNA、a1(Ⅲ) cDNA及磷酸-3-甘油醛脱氢酶(GAP)cDNA探针制备及标记：小鼠a1(Ⅰ)及a1(Ⅲ)胶原cDNA重组质粒和用做内标准的GAP cDNA克隆由DeCrumbrugghe提供，插入片断a1(Ⅰ)为321bp、a1(Ⅲ)为1kb，GPA为1.2kb。按地高辛标记的DNA检测试剂盒(德国宝林曼)说明操作，标记探针浓度分别为52ng/ml、48ng/ml和54ng/ml。
, http://www.100md.com 2. 胎牛血清，199完全培养基，DMEM,Ⅰ型胶原酶，蛋白丝裂酶E, 百日咳毒素(pertussis toxin，PTX)，霍乱毒素(choleratoxin，CTX), 8-溴-环磷酸腺苷酸(8Br-cAMP)，二氢磺胺氯喹啉(H-8)，新霉素及IFN-γ等均为美国Sigma公司产品。
3. HSC体外分离及培养: 雄性SD大鼠，体重450～500g，购自军事医学科学院实验动物中心。采用闭式循环低酶原位消化法分离细胞，以2×106/ml浓度悬浮于199完全培养基，接种于35mm六孔板，在37℃, 5% CO2条件下行体外培养。
4. 细胞内cAMP水平检测：参见文献[1]。
5. 细胞内蛋白激酶A(PKA)活性检测: 采用PKA Kit(Promega)，按说明书操作。6. DNA-RNA斑点杂交：采用异硫氰酸胍法提取HSC中总RNA(RNA纯度A260/A280>1.8)行杂交、洗膜和免疫显色。实验所有数据均为三复孔均数。
, 百拇医药
二、结果
1. IFN-γ、CTX及PTX对HSC cAMP水平的影响：CTX诱导HSC cAMP水平增加最显著达(316±28)pmol/106 cells，PTX对cAMP水平的影响不受IFN-γ的影响。
2. IFN-γ、H-8及8Br-cAMP对PKA活性的影响: 8Br-cAMP可增强PKA活性，在作用30min时最强达(716±134)pmol·min-1·mg-1，H-8可抑制8Br-cAMP活化PKA达59.08%；而抑制IFN-γ活化PKA达30.64%。
3. IFN-γ、CTX、PTX、H-8及8Br-cAMP对前胶原基因表达信号传递G蛋白途径的影响：CTX浓度由50μg/L增至400μg/L, a1(Ⅰ) mRNA水平显著减少，当CTX为400μg/L时，a1(Ⅰ) mRNA为对照组的(35.3±16.7)%; 再用50 U IFN-γ作用时，a1(Ⅰ) mRNA为对照组的(31.2±5.4)%。PTX浓度由1μg/L增至10μg/L，a1(Ⅰ) mRNA水平增高，当PTX为10μg/L时，a1(Ⅰ) mRNA为对照组的(121±16)%，再用50U IFN-γ作用时，a1(Ⅰ) mRNA为对照组的(136±16)%；当PTX为15μg/L时，随作用时间的延长而增强，当作用24h时，a1(Ⅰ) mRNA为对照组的(243.6±46.2)%。当IFN-g为50U时，a1(Ⅰ) mRNA为对照组的(56.7±10.3)%。8Br-cAMP为1mmol/L, a1(Ⅰ) mRNA为对照组的(40.6±3.6)%。H-8为50mmol/L, a1(Ⅰ) mRNA为对照组的(90.6±20.3)%。两者分别再用50U IFN-γ作用时，a1(Ⅰ) mRNA分别为对照组的(34.7±9.2)%和(76±11.2)%。
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三、讨论
我们曾证实IFN-γ可抑制HSC合成胶原和非胶原基质，但关于IFN-γ抑制胶原表达的第二信使和信号传递途径知之较少，在G蛋白信号传递途径中，Gs蛋白对CTX敏感，抑制G蛋白对PTX敏感，利用CTX及PTX对G蛋白信号传递途径中不同蛋白的敏感性，研究G蛋白在IFN-γ影响HSC表达a1(Ⅰ) mRNA信号传递中的作用。研究结果示CTX可显著减少a1(Ⅰ) mRNA水平，使HSC内cAMP浓度明显增加，当加入IFN-γ作用HSC时，不改变细胞内cAMP含量；而a1(Ⅰ) mRNA水平更为降低。8Br-cAMP及H-8作用与CTX类似。提示CTX、8Br-cAMP及H-8敏感蛋白系统可能不参与IFN-γ影响HSC前胶原a1(Ⅰ) mRNA表达的信号传递途径。而PTX影响IFN-γ抑制HSC a1(Ⅰ) mRNA表达，随作用时间和浓度的增加，抑制IFN-γ对HSC a1(Ⅰ) mRNA表达的影响增强，诱导cAMP的作用远没有CTX显著，且PTX对cAMP水平的影响不受IFN-γ的影响，提示PTX敏感的抑制G蛋白可能是IFN-γ影响HSC前胶原a1(Ⅰ) mRNA表达的重要信号传递途径。
, 百拇医药
研究表明IFN-γ抑制HSC前胶原a1(Ⅰ) mRNA表达受PTX敏感的抑制G蛋白调节，没有充分证据提示CTX敏感蛋白、cAMP及PKA也参与该调节。
全军九.五攻关课题
杨永平,男,35岁,副主任医师,主要从事肝纤维化基础和临床研究,发表30余篇论文
杨永平(100039 北京，解放军第三○二医院)
陈德永(100039 北京，解放军第三○二医院)
孔宪涛(上海，第二军医大学附属长征医院免疫中心)
张世兰(100039 北京，解放军第三○二医院)
张伟(100039 北京，解放军第三○二医院)
宋喜秀(100039 北京，解放军第三○二医院)
参考文献
[1]杨永平，周艳贤，陈德永，等. 肝细胞生长素，胰岛素对肝细胞cAMP/cGMP系统的影响. 中华肝脏病杂志，1998, 6: 115., http://www.100md.com
关键词：IFN-γ HSC前胶原；基因表达；信号传递
探讨IFN-γ对HSC前胶原基因表达的信号传递途径影响。
一、材料与方法
1. 鼠a1(Ⅰ) cDNA、a1(Ⅲ) cDNA及磷酸-3-甘油醛脱氢酶(GAP)cDNA探针制备及标记：小鼠a1(Ⅰ)及a1(Ⅲ)胶原cDNA重组质粒和用做内标准的GAP cDNA克隆由DeCrumbrugghe提供，插入片断a1(Ⅰ)为321bp、a1(Ⅲ)为1kb，GPA为1.2kb。按地高辛标记的DNA检测试剂盒(德国宝林曼)说明操作，标记探针浓度分别为52ng/ml、48ng/ml和54ng/ml。
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3. HSC体外分离及培养: 雄性SD大鼠，体重450～500g，购自军事医学科学院实验动物中心。采用闭式循环低酶原位消化法分离细胞，以2×106/ml浓度悬浮于199完全培养基，接种于35mm六孔板，在37℃, 5% CO2条件下行体外培养。
4. 细胞内cAMP水平检测：参见文献[1]。
5. 细胞内蛋白激酶A(PKA)活性检测: 采用PKA Kit(Promega)，按说明书操作。6. DNA-RNA斑点杂交：采用异硫氰酸胍法提取HSC中总RNA(RNA纯度A260/A280>1.8)行杂交、洗膜和免疫显色。实验所有数据均为三复孔均数。
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二、结果
1. IFN-γ、CTX及PTX对HSC cAMP水平的影响：CTX诱导HSC cAMP水平增加最显著达(316±28)pmol/106 cells，PTX对cAMP水平的影响不受IFN-γ的影响。
2. IFN-γ、H-8及8Br-cAMP对PKA活性的影响: 8Br-cAMP可增强PKA活性，在作用30min时最强达(716±134)pmol·min-1·mg-1，H-8可抑制8Br-cAMP活化PKA达59.08%；而抑制IFN-γ活化PKA达30.64%。
3. IFN-γ、CTX、PTX、H-8及8Br-cAMP对前胶原基因表达信号传递G蛋白途径的影响：CTX浓度由50μg/L增至400μg/L, a1(Ⅰ) mRNA水平显著减少，当CTX为400μg/L时，a1(Ⅰ) mRNA为对照组的(35.3±16.7)%; 再用50 U IFN-γ作用时，a1(Ⅰ) mRNA为对照组的(31.2±5.4)%。PTX浓度由1μg/L增至10μg/L，a1(Ⅰ) mRNA水平增高，当PTX为10μg/L时，a1(Ⅰ) mRNA为对照组的(121±16)%，再用50U IFN-γ作用时，a1(Ⅰ) mRNA为对照组的(136±16)%；当PTX为15μg/L时，随作用时间的延长而增强，当作用24h时，a1(Ⅰ) mRNA为对照组的(243.6±46.2)%。当IFN-g为50U时，a1(Ⅰ) mRNA为对照组的(56.7±10.3)%。8Br-cAMP为1mmol/L, a1(Ⅰ) mRNA为对照组的(40.6±3.6)%。H-8为50mmol/L, a1(Ⅰ) mRNA为对照组的(90.6±20.3)%。两者分别再用50U IFN-γ作用时，a1(Ⅰ) mRNA分别为对照组的(34.7±9.2)%和(76±11.2)%。
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三、讨论
我们曾证实IFN-γ可抑制HSC合成胶原和非胶原基质，但关于IFN-γ抑制胶原表达的第二信使和信号传递途径知之较少，在G蛋白信号传递途径中，Gs蛋白对CTX敏感，抑制G蛋白对PTX敏感，利用CTX及PTX对G蛋白信号传递途径中不同蛋白的敏感性，研究G蛋白在IFN-γ影响HSC表达a1(Ⅰ) mRNA信号传递中的作用。研究结果示CTX可显著减少a1(Ⅰ) mRNA水平，使HSC内cAMP浓度明显增加，当加入IFN-γ作用HSC时，不改变细胞内cAMP含量；而a1(Ⅰ) mRNA水平更为降低。8Br-cAMP及H-8作用与CTX类似。提示CTX、8Br-cAMP及H-8敏感蛋白系统可能不参与IFN-γ影响HSC前胶原a1(Ⅰ) mRNA表达的信号传递途径。而PTX影响IFN-γ抑制HSC a1(Ⅰ) mRNA表达，随作用时间和浓度的增加，抑制IFN-γ对HSC a1(Ⅰ) mRNA表达的影响增强，诱导cAMP的作用远没有CTX显著，且PTX对cAMP水平的影响不受IFN-γ的影响，提示PTX敏感的抑制G蛋白可能是IFN-γ影响HSC前胶原a1(Ⅰ) mRNA表达的重要信号传递途径。
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研究表明IFN-γ抑制HSC前胶原a1(Ⅰ) mRNA表达受PTX敏感的抑制G蛋白调节，没有充分证据提示CTX敏感蛋白、cAMP及PKA也参与该调节。
全军九.五攻关课题
杨永平,男,35岁,副主任医师,主要从事肝纤维化基础和临床研究,发表30余篇论文
杨永平(100039 北京，解放军第三○二医院)
陈德永(100039 北京，解放军第三○二医院)
孔宪涛(上海，第二军医大学附属长征医院免疫中心)
张世兰(100039 北京，解放军第三○二医院)
张伟(100039 北京，解放军第三○二医院)
宋喜秀(100039 北京，解放军第三○二医院)
参考文献
[1]杨永平，周艳贤，陈德永，等. 肝细胞生长素，胰岛素对肝细胞cAMP/cGMP系统的影响. 中华肝脏病杂志，1998, 6: 115., http://www.100md.com