当前位置: 首页 > 期刊 > 《中华创伤杂志》 > 2000年第7期
编号:10502418
烫伤大鼠肺组织脂多糖受体CD14基因表达的变化及其意义
http://www.100md.com 《中华创伤杂志》 2000年第7期
     烫伤大鼠肺组织脂多糖受体CD14基因表达的变化及其意义

    方文慧 姚咏明 施志国 于燕 吴叶 陆连荣 盛志勇

    摘 要 目的 观察烫伤后肺组织脂多糖受体CD14基因表达的变化规律及其与急性肺损伤发生、发展的关系。 方法 采用大鼠35%体表总面积Ⅲ度烫伤模型,分别于伤前、伤后12,24,48,72 h处死大鼠。留取肺组织标本或分离腹腔巨噬细胞,分别检测组织内毒素含量、CD14 mRNA表达及组织髓过氧化物酶(MPO)活性。 结果 烫伤后肺组织内毒素含量和MPO活性均明显增高,且一直持续至伤后72 h。相关分析显示,肺组织内毒素含量与MPO活性呈显著正相关(P<0.05)。另一方面,烫伤后肺组织CD14 mRNA水平明显增高,分别于伤后12,48 h出现两个高峰。并且伤后腹腔巨噬细胞CD14 mRNA表达也显著增强。 结论 烫伤后移位内毒素聚集于肺脏,可明显刺激机体局部组织CD14 mRNA的表达,而组织CD14表达上调与严重烫伤后急性肺损伤的发生、发展密切相关。
, 百拇医药
    关键词:烧伤;内毒素;抗原,CD14;基因表达;肺损伤,急性

    严重烧伤后肺脏易于并发感染,诱发急性肺损伤。既往的研究表明,肠源性内毒素血症与创伤后急性肺损伤的关系十分密切,但其详细的作用机制目前尚不清楚。近年来体外研究证实,脂多糖结合蛋白(LBP)和脂多糖受体CD14在内毒素识别和细胞应答中具有重要的调节作用,能明显提高多种细胞对内毒素的敏感性[1]。但迄今为止,对严重烫伤后肺组织CD14基因表达的变化规律及其在介导肠源性内毒素诱发急性肺损伤中的意义,尚缺乏了解。笔者采用大鼠急性烫伤模型,对此进行了初步探讨,旨在为阐明烧伤后急性肺损伤的分子发病机制提供新的实验依据。

    材料与方法

    1. 动物模型和分组:雄性Wistar大鼠61只,体重250~300 g。实验组大鼠麻醉、脱毛后,将其背部浸于沸水中12 s造成35%体表总面积(TBSA) Ⅲ度烫伤。本研究包括体内实验和体外实验两部分。体内实验共选用31只大鼠,随机分为正常对照组(7只)和烫伤实验组(24只),后者再按伤后时间点分为伤后12,24,48,72 h组。大鼠处死后,留取肺组织进行内毒素含量、CD14基因表达和髓过氧化物酶(MPO)活性的检测。体外实验共选用30只大鼠,随机分为正常对照组(6只)和烫伤实验组(24只),后者再分为伤后12,24,48,72 h组。分离腹腔巨噬细胞,制成细胞离心标本,检测CD14 mRNA含量。
, 百拇医药
    2. 检测指标和方法:(1) 肺组织内毒素含量:严格无菌留取肺组织,用3倍体积的无热原等渗盐水匀浆,采用改良过氯酸法预处理组织匀浆液,鲎试验基质显色法(LAL)定量测定[2]。(2) 肺组织CD14 mRNA表达:采用半定量逆转录聚合酶链反应技术检测,CD14引物合成参照文献[3]。(3) 腹腔巨噬细胞CD14 mRNA含量:采用非放射性细胞原位杂交法检测。探针序列为5'-GCA GGC ACT GGA TCT CAG TCA C-3'[3],标记生物素,以胶体金系统进行显色。同时设置系统阳性对照和系统阴性对照。 (4) 肺组织MPO活性:采用酶学分光光度法测定[4]

    3. 统计学处理:数据均以xx1.gif (881 bytes)±sxx1.gif (881 bytes)表示,应用SAS (6.04版本)统计软件包进行方差分析、相关分析及回归分析。
, http://www.100md.com
    结 果

    1. 烫伤后肺组织内毒素含量和MPO活性的改变:烫伤打击后,肺组织内毒素含量(endotoxin unit, EU)明显高于伤前值[(4.51±1.14) EU/g]。伤后12 h肺组织内毒素含量达峰值[(9.65±2.40) EU/g],然后逐渐降低,但伤后72 h仍持续于较高水平[(6.94±1.72) EU/g]。同样,烫伤后肺组织MPO活性显著增高,伤后12 h达高峰[(52.67±6.27) U/g,P<0.01],随后逐渐下降,但伤后72 h仍高于伤前值。相关分析结果表明,肺组织内毒素含量与MPO活性呈高度正相关(r=0.850 35, P=0.031 90)。

    2. 烫伤后肺组织CD14 mRNA表达的动态变化(图1):正常肺组织有少量CD14 mRNA表达。伤后12 h肺组织CD14 mRNA表达明显增多,其后CD14 mRNA水平略有下降,伤后48 h再度增高。t40901.gif (7460 bytes)
, 百拇医药
    图1 烫伤后肺组织CD14 mRNA表达的变化

    3. 烫伤后腹腔巨噬细胞CD14 mRNA表达:正常大鼠腹腔巨噬细胞有少量CD14 mRNA表达,但杂交信号较弱,并且阳性颗粒分布较少(图2)。烫伤后腹腔巨噬细胞内CD14杂交信号明显增强,胞浆内阳性颗粒亦明显增多。伤后48 h,胞浆内阳性颗粒进一步增多,约占细胞面积的1/2(图3)。伤后72 h,胞浆内阳性颗粒略为减少,但仍明显多于正常组(图4)。t40902.gif (21030 bytes)

    图2 正常大鼠腹腔巨噬细胞CD14 mRNA表达。图中阳性颗粒为黑色,位于胞浆 胶体金显色 40×10t40903.gif (20950 bytes)
, 百拇医药
    图3 烫伤后48 h腹腔巨噬细胞CD14 mRNA表达。图中阳性颗粒为黑色,位于胞浆 胶体金显色 40×10t40904.gif (12649 bytes)

    图4 烫伤后72 h腹腔巨噬细胞CD14 mRNA表达。图中阳性颗粒为黑色,位于胞浆 胶体金显色 40×10

    讨 论

    体外实验证实,LBP/CD14系统能明显提高机体多种细胞对内毒素的敏感性,可使内毒素的生物活性提高数百倍至数千倍,而CD14基因缺陷小鼠对内毒素的敏感性则降低上万倍。Leturcq等[5]报告,抗CD14抗体对内毒素引起的休克具有显著的防护作用。由于烧伤、创伤时循环内毒素含量往往处于较低水平(<1.0 ng/ml),因此,微量内毒素所介导的一系列损伤效应可能与体内LBP/CD14系统的增敏作用有关。了解该系统在严重烧伤后的变化规律,有助于阐明烧伤后器官功能损害的发病机制及临床意义。
, http://www.100md.com
    本组资料中,正常大鼠局部肺组织含有微量内毒素,低水平内毒素可能对激活机体免疫系统并使之处于“预激”状态起一定作用。烫伤后肺组织内内毒素含量明显高于伤前基础值,并且持续居高不下。同时,肺组织MPO活性显著增高,表明肺组织有大量中性粒细胞浸润。既往的研究表明,肺脏中性粒细胞浸润与肺毛细血管通透性增高密切相关[4]。而且,预先清除中性粒细胞对肠缺血再灌注所引起的肺损伤具有显著的保护效应。因此,肺组织内大量中性粒细胞聚集提示可能存在肺功能损害。本实验结果表明,肺组织内毒素蓄积与中性粒细胞浸润呈相似变化趋势,提示肺组织内毒素在诱发肺脏功能损害中可能具有重要作用。相关分析显示,肺组织MPO活性与肺组织内毒素含量呈显著正相关,进一步说明烧伤后内毒素在肺组织内的聚集与烧伤后急性肺损伤密切相关。Bahrami等[6]对失血性休克大鼠给予抗内毒素单抗治疗,观察到单抗可完全中和血浆内毒素水平,并且治疗组动物肺损伤明显减轻。据此,认为失血性休克后肠道移位的内毒素可能在肺损伤中起重要作用。但其详细的分子机制目前尚未阐明。
, 百拇医药
    本实验结果显示,正常肺组织含有少量CD14 mRNA,烫伤后肺组织CD14 mRNA显著增多,表明急性烧伤打击可明显上调机体肺组织CD14 基因表达。同时,烫伤后腹腔巨噬细胞CD14 mRNA 明显增多,且一直持续至伤后72 h。这一观察结果提示,烫伤后CD14阳性细胞表达增强。据此,笔者推测肺固有的CD14阳性细胞(肺泡巨噬细胞)表达亦应增强。

    严重烫伤后CD14诱生的机制尚不十分清楚。大量体外实验证实,CD14作为内毒素的功能受体,可能受内毒素的直接调控或内毒素介导产生的各种介质的间接调节。基于体外观察的结果,笔者推测烫伤后组织CD14基因表达上调可能与移位的内毒素有关。本组资料中,烫伤后肺组织内毒素含量与组织CD14 mRNA含量呈相似变化趋势,提示肠源性内毒素可能对肺组织CD14基因表达具有重要影响。笔者曾采用具有中和内毒素效应的重组杀菌/通透性增加蛋白(rBPI21)进行治疗,结果显示伤后12 h,BPI组动物肺组织内毒素水平较单纯烫伤组降低约1/3,同时肺组织CD14基因表达水平亦明显减少,仅为对照动物的43.2%。该结果也说明,烧伤早期肠道内毒素移位并蓄积于局部组织对上调组织CD14基因表达具有重要作用。由此可见,内毒素可引起组织CD14基因表达上调,并为进一步介导器官损伤奠定了基础。
, 百拇医药
    体外实验表明,内毒素上调单核细胞膜结合CD14表达后,细胞结合荧光素标记的内毒素亦显著增多,提示内毒素上调CD14后可能引起细胞对内毒素的敏感性增高。最近,有报道ARDS患者支气管肺泡灌洗液可溶性CD14含量与肺部炎症反应呈高度正相关,局部组织可溶性CD14大量产生、释放可能是导致急性肺损伤的重要原因之一[7]。有鉴于此,笔者认为烧伤后肺组织CD14基因表达上调对促进肠源性内毒素介导的急性肺损伤可能具有一定的临床意义。

    基金项目:国家重点基础研究发展规划资助项目(G1999054203);国家自然科学基金资助项目(39870286);军队杰出中青年人才专项基金资助项目(98J013)及中国工程院科技奖励基金资助项目

    作者单位:方文慧(100037 北京,解放军第三O四医院创伤外科中心)

    姚咏明(100037 北京,解放军第三O四医院创伤外科中心)
, http://www.100md.com
    施志国(100037 北京,解放军第三O四医院创伤外科中心)

    于燕(100037 北京,解放军第三O四医院创伤外科中心)

    陆连荣(100037 北京,解放军第三O四医院创伤外科中心)

    盛志勇(100037 北京,解放军第三O四医院创伤外科中心)

    吴叶(解放军第二O八医院外四科)

    参考文献

    1,方文慧,姚咏明,施志国. 可溶性脂多糖受体CD14研究进展. 国外医学创伤与外科基本问题分册, 1997,18:196-200.

    2,姚咏明,田惠民,王亚平,等. 过氯酸新法预处理血浆定量检测微量内毒素的鲎试验方法及其应用. 上海医学检验杂志, 1993, 8: 31-33.
, 百拇医药
    3,Galea E, Reis DJ, Fox ES, et al. CD14 mediates endotoxin induction of nitric oxide synthase in cultured brain glial cells. J Neuroimmun, 1996,64:19-28.

    4,Haziot A, Ferrero E, Kontgen F, et al. Resistance to endotoxin shock and reduced dissemination of gram-negative bacteria in CD14-deficient mice. Immunity, 1996,4:407-414.

    5,Leturcq DJ, Moriarty AM, Talbott G, et al. Antibodies against CD14 protect primates from endotoxin-induced shock. J Clin Invest, 1996,98:1533-1538.
, http://www.100md.com
    6,Bahrami S, Yao YM, Leichtfried G, et al. Monoclonal antibody to endotoxin attenuates hemorrhage-induced lung injury and mortality in rats. Crit Care Med, 1997,25:1030-1036.

    7,Martin TR, Rubenfeld GD, Ruzinski JT, et al. Relationship between soluble CD14, lipopolysaccharide binding protein, and the alveolar inflammatory response in patients with acute respiratory syndrome. Am J Respir Crit Care Med, 1997,155:937-943., 百拇医药