造血干细胞研究进展
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CSCO 2000年第四届学术年会
造血干细胞研究进展
白 海1 达万明2 欧英贤1
关键词：造血干细胞移植
造血系统是体内高度活跃和高度新陈代高谢的系统，造血干细胞的基本特征是具有自我维持和自我更新，即干细胞通过不对称性的有丝分裂，在不断产生大量祖细胞的同时，使自已不增殖也不分化，而造血祖细胞进一步的增殖与分化是补充和维持人体外周血细胞的基础。由造血干细胞到祖细胞再到外周血细胞的这种分化调节的过程相当复杂，依赖于各种造血生长因子、造血基质细胞、细胞外基质等多种因素的相互作用与平衡，并涉及细胞的增殖分化、发育成熟、迁移定居、衰老凋亡和癌变等生命科学中的许多基本问题，这也是基础研究的主要热点。
1.造血干细胞的表面标志
, 百拇医药
CD34是人们普遍认同的造血干/祖细胞的代表性表面标志，随着细胞的分化成熟逐渐减少直至消失。在正常骨髓中，CD34+细胞约占有1%-3%。但CD34+造血细胞仍是一个异质性的细胞群体，可进一步分为CD34+CD38一和CD34+CD38+两个亚群，其中造血干细胞仅占CD34+CD38一细胞群中的很少一部分。现认为干细胞的标志为CD34+CD38一HLA-DR一Lin一Thy-1+c-kit+Scal-1+LFA-1一CD45RA一CD71一Rho dull。临床应用免疫吸附法和免疫磁珠分离法分离的CD34+细胞的造血干细胞移植也已取得了移植的成功。
然而，近年来造血干细胞的体内外研究使人们对CD34+细胞与造血干细胞的关系有了新的认识。1996年，Osawa等[1]通过一系列研究首先提出，成年小鼠骨髓造血干细胞位于CD34低表达和阴性组份(CD34low/-)，输入单个小鼠CD34low/- c-kit+ Sca-1+及系标志阴性(Lin一)细胞可使21%的受者获得长期淋巴造血系统重建。而小鼠CD34+c-kit+Sca-1+Lin一造血细胞则显示早期但不能维持的多系造血重建，提示这些细胞为具有多系分化功能而缺乏自我更新的造血祖细胞。以后的实验进一步证实了CD34一细胞的存在[2]。用荧光DNA结合染料Hoechst33342染色小鼠的骨髓细胞，然后用双波长流式细胞仪，可分离出能重建致死量照射受体小鼠造血功能的骨髓干细胞，它们是一类体积很小且均一的细胞群体，且为CD34一Lin一细胞。用同样的方法对人类、罗猴和猪骨髓细胞的研究也表明存在现尚未被认识的、缺乏CD34表面标志的造血细胞干细胞群体。另有报道提出表型为Thy-1lowLin-/lowSca-1+(TLS)的小鼠造血干/祖细胞中有15%为CD34一细胞。体外克隆分析和对经致死量照射小鼠的造血重建研究显示，上一类细胞中大约95%的CFCs、CFU-S、CAFCs是CD34+细胞，而更早期的长期建重造血细胞则同等分布于CD34+和CD34一的TLS细胞。
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现有人提出的另一种新的造血干/祖细胞的表面标志为AC133，它可与一种新的杂交瘤细胞系所产生的抗干细胞糖蛋白抗原的单克隆IgG抗体(分子量为120kD)发生特异性结合反应。AC133抗原选择性地表达于人胎肝、骨髓和外周血中的CD34+造血干/祖细胞表面，因此，AC133可替代CD34而作为选择用于分选和移植的造血干/祖细胞的标志。
2.外周血造血干细胞
由于外周血中含有极少量的造血干细胞，并且外周血中的成熟的T淋巴细胞含量大，使其作为骨髓移植的来源一直被视为不可能，所以外周血干细胞的研究未引起足够的重视。近年来，由于造血细胞因子及血液细胞分离机的广泛应用，使人们将骨髓中的造血干细胞动员进入外周血循环并进行分离浓缩成为可能。同时由于外周血干细胞在临床上的成功应用，显示了其比骨髓移植具有造血恢复快、急性排斥反应少等优点，从而引起了人们的广泛兴趣，成为临床应用和研究的热点[3]。
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在外周血造血干细胞的临床应用中，常用的动员方案为联合化疗或联合化疗加造血细胞因子或单独应用造血细胞因子，常用的细胞因子为G-CSF(常用剂量为10ug/kg/d)，并且用CD34+细胞作为反映外周血造血干细胞含量和衡量移植时造血重建能力的指标，重建长期造血的CD34+细胞的最低阈值为1-2x106/kg(自体移植)和2-3x106/kg(异基因移植)。Bender等[4]检测了化疗动员的CD34+细胞表达CD33、CD19、CD7和CD71的情况，表明化疗动员的CD34+细胞与骨髓CD34+细胞有二点主要不同，一是动员细胞中很少前B淋巴细胞，仅有少量CD34+细胞表达CD19；二是动员的CD34+细胞低水平表达CD71，rhodamin123的保留也降低，提示外周血CD34+细胞处于非增殖活化状态。另一组成10例联合化疗加G-CSF动员显示CD34+细胞表达CD33和CD71具有明显的不均一性。95%以上动员的CD34+细胞均表达CD38和HLA-DR。各种动员方案显示，G-CSF能动员出更多的CD34+CD38一细胞，说明在各种动员方案中G-CSF动员的外周血中造血干/祖细胞可能更多。另外采集的时间也与外周血中造血干/祖细胞的类型有关，CD34+Thy-1+细胞在采集的第一天最高，以后便逐日下降；CD34+Thy-1+Lin一细胞也与采集的时间相关。G-CSF动员后外周血采集到的CD34+Thy-1+细胞较同一天骨髓采集到的细胞高1.4倍。外周血与骨髓另一个不同点即是临床外周血干细胞移植发现，其免疫功能恢复明显快于骨髓移植，这可能是由于动员的外周血中含有大量成熟的T淋巴细胞或T淋巴系祖细胞所致。外周血中这种淋巴细胞及单核细胞、NK细胞等免疫细胞的数量远远高于骨髓细胞，这些辅助细胞虽不是造血重建的关键，但它们可以分泌大量的细胞因子加快造血重建，同时也是特异性免疫治疗提高自体外周血干细胞移植的效率、减少肿瘤复发的应用和研究的基础。
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3.脐血造血干细胞
1984年Boyce等发现人脐带血中含有造血干细胞，并认为脐血可能是临床上造血干细胞的一种新来源。1988年第一例HLA相全的脐血移植治疗Fanconi贫血患儿在法国巴黎获成功，从此开始了脐血干细胞研究和应用的新篇章。近年来研究表明[5]，脐血和骨髓中所含CD34+细胞的数量没什么差别，分别为1.0±0.3%和1.08±0.4%，但在质量上却有差别，CD34+细胞体外长期培养中的初始细胞CD34+CD45RO细胞在脐血中明显高于骨髓，CD34+CD38一和CD34+CD33一在脐血中的CD34+细胞中的比例都明显高于骨髓，而且脐血CD34+CD38一细胞的增殖分化能力高于骨髓，尤其加入各种细胞因子后，CFU-GEMM、BFU-E集落数都明显高于骨髓，也高于成人外周血。这也表明同样体重的患者重建造血功能所需的脐量可能要远少于骨髓量。
另外，脐血中的T淋巴细胞不同于成人的骨髓T细胞，经过继发性免疫刺激后产生一种较长期的无反应状态，这是由于脐血中主要含有不成熟表型T细胞(CD45RO+)，且以抑制性亚群为主，是脐血移植后超越MHC屏障，GVHD发生率低的原因之一。
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4.造血干细胞的体外扩增
近年，来从骨髓移植发展到外周血造血干细胞移植，以及新的造血干细胞来源的脐带血移植，移植技术和临床疗效在不断提高，同时人们对造血干细胞的研究也在不断深入。在体外模拟和部分模拟体内的造血过程，对分离的少量干细胞进行体外扩增，以期克服诸如自体移植中肿瘤细胞的污染，移植后肿瘤的复发率高；异体移植中的急性排斥反应，使移植相关死亡率高；脐血移植中由于细胞总数少只限于儿童等缺陷。各种细胞刺激因子的应用为造血干细胞体外扩增提供了保证。
现有研究认为，体外扩增造血干/祖细胞的最有效的造血刺激因子为Flt3配体和TPO，而且两者合用时对细胞的分化影响最小。Kobari等[6]应用多参数普通量分析的方法，研究了多种细胞刺激因子对造血细胞的作用，认为Flt3配体和EPO、G-CSF对晚期祖细胞群有明显的刺激作用，其中Flt3配体和EPO对CD34+细胞的扩增起很关键的作用，而Flt3配体和TPO对BFU-E扩增最重要，同时Flt3配体和TPO对获得高水平的LTC-IC扩增是必需的，即体外扩增早期造血干祖细胞需要这两种细胞因子的参与。
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由于现阶段尚缺乏有效的体外检测干细胞的方法，对细胞刺激因子的某些作用机制也缺乏全面了解，实验中使用造血细胞的来源也不一致，导致体外扩增的报道结果差别较大，尚未用于临床进行移植。同时，最近有文献报告，在体外扩增培养中只能使CD34+细胞CD34+CD38+Lin+或CFU-HPP、LTC-IC等扩增，而CD34+CD39-Lin-细胞保持不变，证明了干细胞在生成大量祖细胞时，自身的数量不增也不减，从而认为干细胞的不可扩增性。但从临床移植的经验出发，我们认为造血干细胞是可以扩增的，只不过由于干细胞在体内增殖分化的因子和细胞环境很复杂，在体外尚不能完全地或部分地进行模拟，也许随着对造血干细胞及其微环境的深入了解，能达到扩增干细胞的目的，可有效地进行干细胞的研究和临床应用。````
作者单位：1. 兰州军区总医院，兰州 730050 ；2.解放军总医院，北京 100850
参考文献:
, 百拇医药
[1] Osawa M, Hanada K, Hamada H, et al. Long-term lymphohematopietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell[J]. Science, 1996, 273(12): 242-251.
[2] Morel F, Galy A, Chen B, et al. Equal distribution of competitive long-term repopulating stem cells in the CD34+ and CD34- fractions of Thy-1iowLin-/lowScal-1+ bone marrow cells [J]. Exp Hematol, 1998, 26(5): 440-448.
[3] 达万明.自体造血干细胞移植治疗恶性肿瘤[J].西北国防医学杂志,1998,19(3):235-237.
, 百拇医药
[4] Bender JG, Unverzagt KL, Walker DE, et al. Identification and comparison of CD34+ cells and their subpopulations from normal peripheral blood and bone marrow using multicolor flow cytometry[J]. Blood, 1991,77:2591-2597.
[5] Ho AD, Young D, Maruyama M, et al. Pluripotent and lineage-committed CD34+ subsets in leukapheresis products mobilized by G-CSF, GM-CSF vs. A combination of both [J]. Exp Hematol, 1996, 24:1460-1468.
[6] Kobari L, Giarratana MC, Poloni A, et al. Flt3 ligand, MGDF, Epo and G-CSF enhance ex vivo expansion of hematopoietic cell compartments in the presence of SCF,IL-3, and IL-6[J]. Bone Marrow Transplant, 1998, 21(8): 759-767., http://www.100md.com
白 海1 达万明2 欧英贤1
关键词：造血干细胞移植
造血系统是体内高度活跃和高度新陈代高谢的系统，造血干细胞的基本特征是具有自我维持和自我更新，即干细胞通过不对称性的有丝分裂，在不断产生大量祖细胞的同时，使自已不增殖也不分化，而造血祖细胞进一步的增殖与分化是补充和维持人体外周血细胞的基础。由造血干细胞到祖细胞再到外周血细胞的这种分化调节的过程相当复杂，依赖于各种造血生长因子、造血基质细胞、细胞外基质等多种因素的相互作用与平衡，并涉及细胞的增殖分化、发育成熟、迁移定居、衰老凋亡和癌变等生命科学中的许多基本问题，这也是基础研究的主要热点。
1.造血干细胞的表面标志
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CD34是人们普遍认同的造血干/祖细胞的代表性表面标志，随着细胞的分化成熟逐渐减少直至消失。在正常骨髓中，CD34+细胞约占有1%-3%。但CD34+造血细胞仍是一个异质性的细胞群体，可进一步分为CD34+CD38一和CD34+CD38+两个亚群，其中造血干细胞仅占CD34+CD38一细胞群中的很少一部分。现认为干细胞的标志为CD34+CD38一HLA-DR一Lin一Thy-1+c-kit+Scal-1+LFA-1一CD45RA一CD71一Rho dull。临床应用免疫吸附法和免疫磁珠分离法分离的CD34+细胞的造血干细胞移植也已取得了移植的成功。
然而，近年来造血干细胞的体内外研究使人们对CD34+细胞与造血干细胞的关系有了新的认识。1996年，Osawa等[1]通过一系列研究首先提出，成年小鼠骨髓造血干细胞位于CD34低表达和阴性组份(CD34low/-)，输入单个小鼠CD34low/- c-kit+ Sca-1+及系标志阴性(Lin一)细胞可使21%的受者获得长期淋巴造血系统重建。而小鼠CD34+c-kit+Sca-1+Lin一造血细胞则显示早期但不能维持的多系造血重建，提示这些细胞为具有多系分化功能而缺乏自我更新的造血祖细胞。以后的实验进一步证实了CD34一细胞的存在[2]。用荧光DNA结合染料Hoechst33342染色小鼠的骨髓细胞，然后用双波长流式细胞仪，可分离出能重建致死量照射受体小鼠造血功能的骨髓干细胞，它们是一类体积很小且均一的细胞群体，且为CD34一Lin一细胞。用同样的方法对人类、罗猴和猪骨髓细胞的研究也表明存在现尚未被认识的、缺乏CD34表面标志的造血细胞干细胞群体。另有报道提出表型为Thy-1lowLin-/lowSca-1+(TLS)的小鼠造血干/祖细胞中有15%为CD34一细胞。体外克隆分析和对经致死量照射小鼠的造血重建研究显示，上一类细胞中大约95%的CFCs、CFU-S、CAFCs是CD34+细胞，而更早期的长期建重造血细胞则同等分布于CD34+和CD34一的TLS细胞。
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现有人提出的另一种新的造血干/祖细胞的表面标志为AC133，它可与一种新的杂交瘤细胞系所产生的抗干细胞糖蛋白抗原的单克隆IgG抗体(分子量为120kD)发生特异性结合反应。AC133抗原选择性地表达于人胎肝、骨髓和外周血中的CD34+造血干/祖细胞表面，因此，AC133可替代CD34而作为选择用于分选和移植的造血干/祖细胞的标志。
2.外周血造血干细胞
由于外周血中含有极少量的造血干细胞，并且外周血中的成熟的T淋巴细胞含量大，使其作为骨髓移植的来源一直被视为不可能，所以外周血干细胞的研究未引起足够的重视。近年来，由于造血细胞因子及血液细胞分离机的广泛应用，使人们将骨髓中的造血干细胞动员进入外周血循环并进行分离浓缩成为可能。同时由于外周血干细胞在临床上的成功应用，显示了其比骨髓移植具有造血恢复快、急性排斥反应少等优点，从而引起了人们的广泛兴趣，成为临床应用和研究的热点[3]。
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在外周血造血干细胞的临床应用中，常用的动员方案为联合化疗或联合化疗加造血细胞因子或单独应用造血细胞因子，常用的细胞因子为G-CSF(常用剂量为10ug/kg/d)，并且用CD34+细胞作为反映外周血造血干细胞含量和衡量移植时造血重建能力的指标，重建长期造血的CD34+细胞的最低阈值为1-2x106/kg(自体移植)和2-3x106/kg(异基因移植)。Bender等[4]检测了化疗动员的CD34+细胞表达CD33、CD19、CD7和CD71的情况，表明化疗动员的CD34+细胞与骨髓CD34+细胞有二点主要不同，一是动员细胞中很少前B淋巴细胞，仅有少量CD34+细胞表达CD19；二是动员的CD34+细胞低水平表达CD71，rhodamin123的保留也降低，提示外周血CD34+细胞处于非增殖活化状态。另一组成10例联合化疗加G-CSF动员显示CD34+细胞表达CD33和CD71具有明显的不均一性。95%以上动员的CD34+细胞均表达CD38和HLA-DR。各种动员方案显示，G-CSF能动员出更多的CD34+CD38一细胞，说明在各种动员方案中G-CSF动员的外周血中造血干/祖细胞可能更多。另外采集的时间也与外周血中造血干/祖细胞的类型有关，CD34+Thy-1+细胞在采集的第一天最高，以后便逐日下降；CD34+Thy-1+Lin一细胞也与采集的时间相关。G-CSF动员后外周血采集到的CD34+Thy-1+细胞较同一天骨髓采集到的细胞高1.4倍。外周血与骨髓另一个不同点即是临床外周血干细胞移植发现，其免疫功能恢复明显快于骨髓移植，这可能是由于动员的外周血中含有大量成熟的T淋巴细胞或T淋巴系祖细胞所致。外周血中这种淋巴细胞及单核细胞、NK细胞等免疫细胞的数量远远高于骨髓细胞，这些辅助细胞虽不是造血重建的关键，但它们可以分泌大量的细胞因子加快造血重建，同时也是特异性免疫治疗提高自体外周血干细胞移植的效率、减少肿瘤复发的应用和研究的基础。
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3.脐血造血干细胞
1984年Boyce等发现人脐带血中含有造血干细胞，并认为脐血可能是临床上造血干细胞的一种新来源。1988年第一例HLA相全的脐血移植治疗Fanconi贫血患儿在法国巴黎获成功，从此开始了脐血干细胞研究和应用的新篇章。近年来研究表明[5]，脐血和骨髓中所含CD34+细胞的数量没什么差别，分别为1.0±0.3%和1.08±0.4%，但在质量上却有差别，CD34+细胞体外长期培养中的初始细胞CD34+CD45RO细胞在脐血中明显高于骨髓，CD34+CD38一和CD34+CD33一在脐血中的CD34+细胞中的比例都明显高于骨髓，而且脐血CD34+CD38一细胞的增殖分化能力高于骨髓，尤其加入各种细胞因子后，CFU-GEMM、BFU-E集落数都明显高于骨髓，也高于成人外周血。这也表明同样体重的患者重建造血功能所需的脐量可能要远少于骨髓量。
另外，脐血中的T淋巴细胞不同于成人的骨髓T细胞，经过继发性免疫刺激后产生一种较长期的无反应状态，这是由于脐血中主要含有不成熟表型T细胞(CD45RO+)，且以抑制性亚群为主，是脐血移植后超越MHC屏障，GVHD发生率低的原因之一。
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4.造血干细胞的体外扩增
近年，来从骨髓移植发展到外周血造血干细胞移植，以及新的造血干细胞来源的脐带血移植，移植技术和临床疗效在不断提高，同时人们对造血干细胞的研究也在不断深入。在体外模拟和部分模拟体内的造血过程，对分离的少量干细胞进行体外扩增，以期克服诸如自体移植中肿瘤细胞的污染，移植后肿瘤的复发率高；异体移植中的急性排斥反应，使移植相关死亡率高；脐血移植中由于细胞总数少只限于儿童等缺陷。各种细胞刺激因子的应用为造血干细胞体外扩增提供了保证。
现有研究认为，体外扩增造血干/祖细胞的最有效的造血刺激因子为Flt3配体和TPO，而且两者合用时对细胞的分化影响最小。Kobari等[6]应用多参数普通量分析的方法，研究了多种细胞刺激因子对造血细胞的作用，认为Flt3配体和EPO、G-CSF对晚期祖细胞群有明显的刺激作用，其中Flt3配体和EPO对CD34+细胞的扩增起很关键的作用，而Flt3配体和TPO对BFU-E扩增最重要，同时Flt3配体和TPO对获得高水平的LTC-IC扩增是必需的，即体外扩增早期造血干祖细胞需要这两种细胞因子的参与。
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由于现阶段尚缺乏有效的体外检测干细胞的方法，对细胞刺激因子的某些作用机制也缺乏全面了解，实验中使用造血细胞的来源也不一致，导致体外扩增的报道结果差别较大，尚未用于临床进行移植。同时，最近有文献报告，在体外扩增培养中只能使CD34+细胞CD34+CD38+Lin+或CFU-HPP、LTC-IC等扩增，而CD34+CD39-Lin-细胞保持不变，证明了干细胞在生成大量祖细胞时，自身的数量不增也不减，从而认为干细胞的不可扩增性。但从临床移植的经验出发，我们认为造血干细胞是可以扩增的，只不过由于干细胞在体内增殖分化的因子和细胞环境很复杂，在体外尚不能完全地或部分地进行模拟，也许随着对造血干细胞及其微环境的深入了解，能达到扩增干细胞的目的，可有效地进行干细胞的研究和临床应用。````
作者单位：1. 兰州军区总医院，兰州 730050 ；2.解放军总医院，北京 100850
参考文献:
, 百拇医药
[1] Osawa M, Hanada K, Hamada H, et al. Long-term lymphohematopietic reconstitution by a single CD34-low/negative hematopoietic stem cell[J]. Science, 1996, 273(12): 242-251.
[2] Morel F, Galy A, Chen B, et al. Equal distribution of competitive long-term repopulating stem cells in the CD34+ and CD34- fractions of Thy-1iowLin-/lowScal-1+ bone marrow cells [J]. Exp Hematol, 1998, 26(5): 440-448.
[3] 达万明.自体造血干细胞移植治疗恶性肿瘤[J].西北国防医学杂志,1998,19(3):235-237.
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[4] Bender JG, Unverzagt KL, Walker DE, et al. Identification and comparison of CD34+ cells and their subpopulations from normal peripheral blood and bone marrow using multicolor flow cytometry[J]. Blood, 1991,77:2591-2597.
[5] Ho AD, Young D, Maruyama M, et al. Pluripotent and lineage-committed CD34+ subsets in leukapheresis products mobilized by G-CSF, GM-CSF vs. A combination of both [J]. Exp Hematol, 1996, 24:1460-1468.
[6] Kobari L, Giarratana MC, Poloni A, et al. Flt3 ligand, MGDF, Epo and G-CSF enhance ex vivo expansion of hematopoietic cell compartments in the presence of SCF,IL-3, and IL-6[J]. Bone Marrow Transplant, 1998, 21(8): 759-767., http://www.100md.com