鼠视网膜感光细胞移植术后超微结构观察
鼠视网膜感光细胞移植术后超微结构观察
王薇 马美云 张惠蓉 白芳
摘 要 目的 以遗传性视细胞变性动物RCS鼠为受体，Wistar鼠为供体，观察纯视锥、杆细胞移植术后RCS鼠视网膜外层超微结构的变化。方法 应用视网膜板层切削技术或准分子激光技术制备供体层状视细胞；视网膜板层外路移植技术，获得视网膜移植动物模型。术后2周及4周时处死动物，眼球常规切片后于光镜及透射电镜下观察受体视网膜。结果 移植的视细胞大多成层排列于受体鼠的视网膜色素上皮层及内颗粒层之间。重新出现的外网状层内可见较完整的神经突触及突触间连接。结论 纯视细胞移植术后，可以在受体视网膜外层观察到较完整的神经突触结构。
关键词：细胞；移植；视网膜；动物，实验
, http://www.100md.com
由于视网膜神经元直接或间接受损造成的眼部疾病，如年龄相关性黄斑变性、遗传性视网膜色素变性等，仍是目前临床上很难治疗的疾患。神经盲的复明也因此成为跨学科的前沿课题。1997年首次由美国医生报道将视网膜移植应用于临床的2例患者[1]，尽管未能获得光感，但对该手术的安全性和可靠性予以探讨。视细胞的移植大多仍只是处在实验室阶段，部分作者亦试图将视细胞移植到神经组织内[2]或脉络膜内，研究视神经的发育或修复[3]。我们利用板层视网膜移植技术[4]，将正常成年鼠的纯视细胞定向移植到RCS鼠视网膜下腔，观察移植后的RCS鼠视网膜外网织层，视锥、杆细胞层与内颗粒层神经元间突触结构的特点。
材料与方法
一、材料
1.供体动物：选择成年Wistar鼠2只，处死即刻剥离双眼视网膜，贴于明胶托上，纯视细胞制备采用视网膜切削及准分子激光技术[5，6]。美蓝染色，分割成小块，置于细胞培养液中备用。
, 百拇医药
2. 受体动物：RCS鼠，全身麻醉，利用移植器，取外路手术方法将小块纯视细胞层植入受体鼠视网膜下腔。动物于正常光线环境存活1个月。
3.对照组：选择同鼠龄Wistar鼠、RCS鼠及接受纯视细胞移植的RCS鼠各1只眼为1组(单眼接受视细胞移植的动物，另眼可作为同龄鼠视网膜萎缩眼的对照)，共5组，10只眼被选择为电子显微镜观察标本。
二、方法
在处死动物的同时取眼球，于手术显微镜下小心沿睫状体平坦部剪开眼球，寻找视网膜移植部位，将该部位带巩膜分切成3 mm×5 mm小块，分别置4%戊二醛中固定，磷酸缓冲液冲洗，锇酸再固定，0.5 μm切片用复合甲苯胺蓝染色，光镜下定位，选择视细胞移植部位，定位以视网膜外层为中心。超薄切片，铅、铀双染色，电子显微镜下观察。
结果
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一、定位片观察
0.5 μm切片显示，2只眼视网膜下腔内未见成层排列的移植视细胞，其中1只眼视细胞移植到脉络膜内；其余眼视网膜下腔内可见不同数量的移植视细胞，细胞核较内核层者为小，较不规则纵向排列呈嗜碱染色(图1)。
二、电镜下观察
移植细胞核同正常外颗粒层具有较高的电子密度。可见移植细胞与内颗粒层间存在有结构组织，即外网层结构，其中有少量不完整的膜样物。移植的外颗粒层细胞数少，外网层较薄。移植区内未见炎性细胞浸润(图2)。
移植细胞的内节结构略紊乱，内界膜排列不齐，但或可见视细胞外节与视网膜色素上皮间形成联系(图3)，视细胞间较多神经胶质成分。同龄对照RCS鼠视网膜外颗粒层仅存部分视细胞残体，并可见固缩的细胞核及凋亡小体(图4)。
视细胞间及其与双极细胞、水平细胞间突触连接丰富(图5)，其中大部分为视杆细胞突触。外网层中可见较多完整的化学性突触终端存在，大多为轴-树突触、轴-体突触，多为I型(对称型)化学性突触，少见有II型者。部分突触为多个轴突与树突的连接。移植视细胞轴突内及与之形成突触连接的次级神经元突触内均可见多量突触小泡，其中约1/2为空心球型小泡，亦有F型小泡(扁平突触小泡)。突触小带相对较少。在突触小带周围，突触小泡密集(图6)。在移植的视细胞及内颗粒层之间，还可见到比较典型的突触三联体，即视细胞、水平细胞及双极细胞形成的突触连接等。同龄对照RCS鼠视网膜原外网层部分为较多量的空泡结构占据，其中可见血管及变形的色素细胞(图4)。该区域内未见完整的突触连接。双极细胞体内细胞器稀少，可见线粒体脱脊，树突数量少且走行短，其内尚有少量结构不清楚的小泡结构。
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讨论
我们利用异种异体纯视细胞层对位移植，将视细胞层定向移植到患有遗传性视锥、杆层萎缩的RCS鼠视网膜下，以便了解视网膜移植细胞层及受体神经元神经突触结构与其间的关系。对于移植视网膜的结构特点，包括超微结构，各文献报道中有不同的描述。因为移植视网膜的结构，除与其所处的位置有关外，部分还与移植物本身的结构有关。例如，将胚胎视网膜神经层全层移入视网膜下腔[7]，神经上皮可在原处存活，但大多数呈团样生长(玫瑰花环)或示不典型的视网膜结构，不与其上、下神经元构成关系。有人将供体视细胞移植到脑或其他神经组织内[2]，观察神经突触的生长状况。尽管各实验设计不同，但其目的均为了解视觉通路的结构重建及功能。90年代以后，人们对神经性复明的可能性进行了大量的研究，视网膜移植技术亦倍受重视，且被许多作者用不同的方式重复，但终因条件的限制，其临床应用尚有一定困难。
本实验旨在观察视网膜移植后视路中神经突触的结构变化，以更进一步探讨视网膜神经介质的定位及功能，因此着重于观察视网膜外网层的结构变化及视细胞传出突触与双极细胞突触间的重新连接。由于移植片在移植过程中有细胞损失，因而移植的视网膜外颗粒层及外网层均较原供体鼠视网膜外网层为薄，当然也不能排除移植后部分细胞发生变性死亡的可能性。在移植部位视锥细胞较少，可能与所选实验动物的种属特异性有关。
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在新生的外网层中，可见较完整的化学性突触及由视细胞轴突与水平细胞、双极细胞树突间形成的突触连接。在供体纯视细胞层的制作过程中，为了使之仅提供视锥、杆体，我们有意将此层削切得较薄，这样尽管移植的细胞较少，但却避免了同时移植供体的外网层，使确认新生的突触连接更为可靠。
利用纯视细胞定向移植，可使移植的视细胞与周围组织建立相对正常的解剖学关系。其间的神经传导行为，需更进一步的实验来证明。
图1 移植视细胞核较内核层者为小，较不规则纵向排列。移植视细胞与内颗粒层间存在有结构组织，即外网层。 =1 示移植细胞核， =( 示
外网层， 71 示内核层(下同) 复合甲苯胺蓝染色×100
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图2 电镜下观察×2700
图3 视细胞外节(OC)与视网膜色素上皮(RPE)间
形成联系 ×1400
图4 同龄对照 6:> 鼠视网膜外颗粒层仅存部分视细胞残体(箭头)×2700
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图5 视细胞间及其与双极细胞、水平细胞间突触连接(箭头)丰富 ×1400
图6 移植视细胞轴突及与之形成突触连接的次级神经元突触内均可见多量突触小泡，在突触
小带(箭头)周围，突触小泡密集×10000
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39870847)
作者单位：王薇(100083 北京医科大学第三医院眼科)
马美云(100083 北京医科大学第三医院眼科)
张惠蓉(100083 北京医科大学第三医院眼科)
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白芳(100083 北京医科大学第三医院眼科)
参考文献
1，Kaplan HJ, Tezel TH, Berger AS, et al. Human photoreceptor transplantation in retinitis pigmentosa: a safety study. Arch Ophthalmol, 1997,115:1168-1172.
2，Horsburgh GM, Lund RD, Hankin MH. Retinal transplants in congenitally blind mice:patterns of projection and synaptic connectivity. J Comp Neurol, 1993, 327:323-340.
3，Bergstrom A. Embryonic rabbit retinal transplants survie and differentiate in the choroid. Exp Eye Res, 1994, 59:281-289.
, http://www.100md.com
4，Silverman MS, Hughes SE, Valentino TL, et al. Photoreceptor transplantation: anatomic, electrophysiologic, and behavioral evidence for the functional reconstruction of retinal lacking photoreceptors. Exp Neurol, 1992,115:87-94.
5，王薇，马美云，白芳，等.鼠光感受器细胞层移植的方法及观察. 中华眼科杂志,1999,35:443-445.
6，马美芸，王薇，陈跃国,等.准分子激光切削视网膜板层移植术. 中华眼底病杂志,1998,14:209-211.
7，Adolph AR, Zucker CL, Ehinger B, et al. Function and structure in retinal transplants. J Neural Transplant Plast, 1994, 5:147-161., 百拇医药
王薇 马美云 张惠蓉 白芳
摘 要 目的 以遗传性视细胞变性动物RCS鼠为受体，Wistar鼠为供体，观察纯视锥、杆细胞移植术后RCS鼠视网膜外层超微结构的变化。方法 应用视网膜板层切削技术或准分子激光技术制备供体层状视细胞；视网膜板层外路移植技术，获得视网膜移植动物模型。术后2周及4周时处死动物，眼球常规切片后于光镜及透射电镜下观察受体视网膜。结果 移植的视细胞大多成层排列于受体鼠的视网膜色素上皮层及内颗粒层之间。重新出现的外网状层内可见较完整的神经突触及突触间连接。结论 纯视细胞移植术后，可以在受体视网膜外层观察到较完整的神经突触结构。
关键词：细胞；移植；视网膜；动物，实验
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由于视网膜神经元直接或间接受损造成的眼部疾病，如年龄相关性黄斑变性、遗传性视网膜色素变性等，仍是目前临床上很难治疗的疾患。神经盲的复明也因此成为跨学科的前沿课题。1997年首次由美国医生报道将视网膜移植应用于临床的2例患者[1]，尽管未能获得光感，但对该手术的安全性和可靠性予以探讨。视细胞的移植大多仍只是处在实验室阶段，部分作者亦试图将视细胞移植到神经组织内[2]或脉络膜内，研究视神经的发育或修复[3]。我们利用板层视网膜移植技术[4]，将正常成年鼠的纯视细胞定向移植到RCS鼠视网膜下腔，观察移植后的RCS鼠视网膜外网织层，视锥、杆细胞层与内颗粒层神经元间突触结构的特点。
材料与方法
一、材料
1.供体动物：选择成年Wistar鼠2只，处死即刻剥离双眼视网膜，贴于明胶托上，纯视细胞制备采用视网膜切削及准分子激光技术[5，6]。美蓝染色，分割成小块，置于细胞培养液中备用。
, 百拇医药
2. 受体动物：RCS鼠，全身麻醉，利用移植器，取外路手术方法将小块纯视细胞层植入受体鼠视网膜下腔。动物于正常光线环境存活1个月。
3.对照组：选择同鼠龄Wistar鼠、RCS鼠及接受纯视细胞移植的RCS鼠各1只眼为1组(单眼接受视细胞移植的动物，另眼可作为同龄鼠视网膜萎缩眼的对照)，共5组，10只眼被选择为电子显微镜观察标本。
二、方法
在处死动物的同时取眼球，于手术显微镜下小心沿睫状体平坦部剪开眼球，寻找视网膜移植部位，将该部位带巩膜分切成3 mm×5 mm小块，分别置4%戊二醛中固定，磷酸缓冲液冲洗，锇酸再固定，0.5 μm切片用复合甲苯胺蓝染色，光镜下定位，选择视细胞移植部位，定位以视网膜外层为中心。超薄切片，铅、铀双染色，电子显微镜下观察。
结果
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一、定位片观察
0.5 μm切片显示，2只眼视网膜下腔内未见成层排列的移植视细胞，其中1只眼视细胞移植到脉络膜内；其余眼视网膜下腔内可见不同数量的移植视细胞，细胞核较内核层者为小，较不规则纵向排列呈嗜碱染色(图1)。
二、电镜下观察
移植细胞核同正常外颗粒层具有较高的电子密度。可见移植细胞与内颗粒层间存在有结构组织，即外网层结构，其中有少量不完整的膜样物。移植的外颗粒层细胞数少，外网层较薄。移植区内未见炎性细胞浸润(图2)。
移植细胞的内节结构略紊乱，内界膜排列不齐，但或可见视细胞外节与视网膜色素上皮间形成联系(图3)，视细胞间较多神经胶质成分。同龄对照RCS鼠视网膜外颗粒层仅存部分视细胞残体，并可见固缩的细胞核及凋亡小体(图4)。
视细胞间及其与双极细胞、水平细胞间突触连接丰富(图5)，其中大部分为视杆细胞突触。外网层中可见较多完整的化学性突触终端存在，大多为轴-树突触、轴-体突触，多为I型(对称型)化学性突触，少见有II型者。部分突触为多个轴突与树突的连接。移植视细胞轴突内及与之形成突触连接的次级神经元突触内均可见多量突触小泡，其中约1/2为空心球型小泡，亦有F型小泡(扁平突触小泡)。突触小带相对较少。在突触小带周围，突触小泡密集(图6)。在移植的视细胞及内颗粒层之间，还可见到比较典型的突触三联体，即视细胞、水平细胞及双极细胞形成的突触连接等。同龄对照RCS鼠视网膜原外网层部分为较多量的空泡结构占据，其中可见血管及变形的色素细胞(图4)。该区域内未见完整的突触连接。双极细胞体内细胞器稀少，可见线粒体脱脊，树突数量少且走行短，其内尚有少量结构不清楚的小泡结构。
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讨论
我们利用异种异体纯视细胞层对位移植，将视细胞层定向移植到患有遗传性视锥、杆层萎缩的RCS鼠视网膜下，以便了解视网膜移植细胞层及受体神经元神经突触结构与其间的关系。对于移植视网膜的结构特点，包括超微结构，各文献报道中有不同的描述。因为移植视网膜的结构，除与其所处的位置有关外，部分还与移植物本身的结构有关。例如，将胚胎视网膜神经层全层移入视网膜下腔[7]，神经上皮可在原处存活，但大多数呈团样生长(玫瑰花环)或示不典型的视网膜结构，不与其上、下神经元构成关系。有人将供体视细胞移植到脑或其他神经组织内[2]，观察神经突触的生长状况。尽管各实验设计不同，但其目的均为了解视觉通路的结构重建及功能。90年代以后，人们对神经性复明的可能性进行了大量的研究，视网膜移植技术亦倍受重视，且被许多作者用不同的方式重复，但终因条件的限制，其临床应用尚有一定困难。
本实验旨在观察视网膜移植后视路中神经突触的结构变化，以更进一步探讨视网膜神经介质的定位及功能，因此着重于观察视网膜外网层的结构变化及视细胞传出突触与双极细胞突触间的重新连接。由于移植片在移植过程中有细胞损失，因而移植的视网膜外颗粒层及外网层均较原供体鼠视网膜外网层为薄，当然也不能排除移植后部分细胞发生变性死亡的可能性。在移植部位视锥细胞较少，可能与所选实验动物的种属特异性有关。
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在新生的外网层中，可见较完整的化学性突触及由视细胞轴突与水平细胞、双极细胞树突间形成的突触连接。在供体纯视细胞层的制作过程中，为了使之仅提供视锥、杆体，我们有意将此层削切得较薄，这样尽管移植的细胞较少，但却避免了同时移植供体的外网层，使确认新生的突触连接更为可靠。
利用纯视细胞定向移植，可使移植的视细胞与周围组织建立相对正常的解剖学关系。其间的神经传导行为，需更进一步的实验来证明。
图1 移植视细胞核较内核层者为小，较不规则纵向排列。移植视细胞与内颗粒层间存在有结构组织，即外网层。 =1 示移植细胞核， =( 示
外网层， 71 示内核层(下同) 复合甲苯胺蓝染色×100
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图2 电镜下观察×2700
图3 视细胞外节(OC)与视网膜色素上皮(RPE)间
形成联系 ×1400
图4 同龄对照 6:> 鼠视网膜外颗粒层仅存部分视细胞残体(箭头)×2700
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图5 视细胞间及其与双极细胞、水平细胞间突触连接(箭头)丰富 ×1400
图6 移植视细胞轴突及与之形成突触连接的次级神经元突触内均可见多量突触小泡，在突触
小带(箭头)周围，突触小泡密集×10000
基金项目：国家自然科学基金资助项目(39870847)
作者单位：王薇(100083 北京医科大学第三医院眼科)
马美云(100083 北京医科大学第三医院眼科)
张惠蓉(100083 北京医科大学第三医院眼科)
, http://www.100md.com
白芳(100083 北京医科大学第三医院眼科)
参考文献
1，Kaplan HJ, Tezel TH, Berger AS, et al. Human photoreceptor transplantation in retinitis pigmentosa: a safety study. Arch Ophthalmol, 1997,115:1168-1172.
2，Horsburgh GM, Lund RD, Hankin MH. Retinal transplants in congenitally blind mice:patterns of projection and synaptic connectivity. J Comp Neurol, 1993, 327:323-340.
3，Bergstrom A. Embryonic rabbit retinal transplants survie and differentiate in the choroid. Exp Eye Res, 1994, 59:281-289.
, http://www.100md.com
4，Silverman MS, Hughes SE, Valentino TL, et al. Photoreceptor transplantation: anatomic, electrophysiologic, and behavioral evidence for the functional reconstruction of retinal lacking photoreceptors. Exp Neurol, 1992,115:87-94.
5，王薇，马美云，白芳，等.鼠光感受器细胞层移植的方法及观察. 中华眼科杂志,1999,35:443-445.
6，马美芸，王薇，陈跃国,等.准分子激光切削视网膜板层移植术. 中华眼底病杂志,1998,14:209-211.
7，Adolph AR, Zucker CL, Ehinger B, et al. Function and structure in retinal transplants. J Neural Transplant Plast, 1994, 5:147-161., 百拇医药