我国分子流行病学研究进展
我国分子流行病学研究进展
俞顺章 陈声林
关键词：分子流行病学 近50年来，分子生物学的突飞猛进发展，极大地提高和加深了人们对生命现象本质的认识。流行病学吸收分子生物学的研究成果，不断利用分子生物学的新理论、新技术、新方法，从分子或基因水平上，研究疾病和健康状况在人群中的分布和影响因素，以及预防和控制疾病，从而为流行病学研究提供了新的方法和新的起点，大大丰富了流行病学研究内容。20多年来，流行病学和分子生物学的相互融合，逐渐衍生出分子流行病学这门新兴的分支学科。国内分子流行病学的起步虽然较国外晚，但经过不断努力，已取得了一定的发展。
一、国内分子流行病学研究状况
国内自1985年开始，将分子生物学中的探针杂交、限制性内切酶图谱分析等技术，应用于流行病中疾病诊断以及追踪传染源的调查研究。1990年后在流行病学教材中正式列入分子流行病学一章，并认为分子流行病学是将传统的流行病学原理和方法与现代分子生物学技术相结合，将人群中疾病和健康与实验室中各种检验方法相结合的一门科学。从1992年第4期起，《中华流行病学杂志》连续7期发表文章，介绍分子流行病学的产生、定义、研究内容、研究手段及其应用。1995年后，有关分子流行病学研究的报道逐渐增多。
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经过短短15年左右时间，国内分子流行病学经历了从产生到起步发展的过程, 成立了分子流行病学学术组，并召开了学术会议，出版了专集；由第四军医大学出版了国内专家编写的《分子流行病学》专著；出现了有一定规模的从事分子流行病学研究工作的队伍；研究内容由传染病病原体研究，到疾病的传播途径和规律，再到肿瘤等慢性病研究，研究领域逐渐扩展。
分子流行病学的发展使流行病学从发病或死亡的统计，传染病三环节二因素调查，进一步发展到为打开“黑匣子”的阶段，研究了解暴露、易感和体内变化的实质。
1.病原体分型和检测：分子流行病学研究最早开始用于对传染病的病原体基因分型，并调查病原体的分布规律。在传染病流行中，对病原体进行准确的分型，对疾病的防治十分重要。由于病原体表型特征的不稳定性和易变性，以表型特征研究的分型方法，如血清学、生化学等，就存在缺陷。而基因型是遗传特征，相当稳定可靠，可以作为病原体鉴定和诊断的重要依据。细菌的产毒、耐药特性都与细菌质粒有关，徐兆炜等(1986年)对在同一地区分离的134株痢疾杆菌进行质粒图谱分析，发现虽然部分菌株耐药谱不同，但仍可呈现为相同的质粒图谱，这对于鉴定菌株，追踪耐药菌株来源极有帮助。rRNA基因是细菌染色体上编码rRNA的DNA序列，属保守基因序列。徐文斌等(1996年)对不同地区、不同时间分离到的119株伤寒沙门氏菌进行rRNA(RTs)的基因多态性分析，119株细菌可分为38个RTs，其中RT9和RT11是造成我国伤寒流行的主要RTs。对于病毒的分型，可以采取先进行病毒的细胞培养，病毒增殖到一定程度后，提取病毒DNA，再进行限制性内切图谱分析。
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PCR技术的出现，使对病原体分析过程更加简化、快捷。首先设计引物，PCR扩增病原体DNA中一段保守的基因片段，然后进行酶切分析。例如，苏虹等(1997年)利用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)和限制性片段长度多态性(RFLP)分析安徽HCV基因型的分布，结果表明，安徽HCV感染以Ⅱ型为主，其中北部地区Ⅲ型感染多于南部，而Ⅱ型北部少于南部。对病原体的基因型、多态性、变异性可以应用单链构象多态性 (SSCP)、脉冲场电泳(PFGE)以及序列分析等多种方法进行分析。
基因的多态性也表现为酶分子的多态性，对酶分子的多态性的研究，也可了解不同病原体间遗传关系、分类分型。段广才等(1996年)应用多位点酶电泳法(MEE)对471株霍乱弧菌进行分类，结果证实古典型和埃尔托型流行株遗传关系紧密；非流行株相互间流行关系较远。O139群与O1群流行株有相同的霍乱毒素(CT)片段，应按流行株对待。
对病原体的检测，以往多使用病原体培养、生化分析、血清学和免疫学检测等，上述方法都存在各种缺陷，如检测时间长、灵敏度、特异度不高等。利用放射性同位素标记探针检测病原体，是一种灵敏、特异的检测方法。除用同位素标记探针外，更多的使用非同位素如地高辛、生物素等标记探针，增加了安全性。核酸分子杂交方法检测病原体，在流行病学研究中应用日益增多。王云飞等(1994年)对不同基因型人乳头瘤病毒(HPV)在宫颈癌、尖锐湿疣等中起不同作用进行了研究，证明HPV 11/6型引起性传播的尖锐湿疣；而HPV 16/18型则与宫颈癌关系密切，HPV 52/58型与宫颈癌关系还有待证实。
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PCR不仅可以用于基因分离、克隆和序列分析，还可用于检测病原体。蔡庆等(1997年)在产毒大肠杆菌(ETEL)肠毒素基因内设计3对引物，1次PCR可扩增3种肠毒素基因片段，可同时检测5种基因型的ETEL。另外，多基因PCR法选择高度保守区、特异、稳定、不重复的引物可以同时检测多种病原体。
2.人群中疾病流行规律、传播机制研究：目前疾病在人群中流行的现象比以往更加复杂，已由三环节二因素向三要素，甚至四要素发展。病因已由单病因、单效应，向多病因、单效应，甚至多病因、多效应发展。传播机制也由水平传播、垂直传播(母婴传播)到混合传播。疾病侵入人体途径亦日益复杂。疾病中隐性病例与显性病例的比例不断上升，非典型和隐性感染者越来越多。传染病的潜伏期和非传染病的潜隐期也越来越长了，而发病的频率则越来越低。因此，使用传统的检测方法，调查传染源、传播途径，确定疾病流行规律，就往往存在一定的困难。
解决上述困难的主要途径之一是发展分子流行病学。使检测手段更加先进、敏感度和特异度更高。HBV的垂直传播一直是人们关注的问题, 既往的有关研究，都缺乏直接的证据，证明垂直传播的存在。唐时幸等(1991年)使用核酸分子杂交法，从胎儿胎盘组织中检测到HBV DNA，说明HBV可通过胎盘屏障感染胎儿，而且调查还发现，母亲HBV DNA阳性，胎儿宫内感染的机会大大增加。HBV可以通过母亲传染给胎儿, 还可能由父亲传染给后代。王培林等(1998年)对乙型肝炎患者家系进行分子流行病学调查，比较男性患者病前所生子女HBV DNA U5样序列片段检出率及HBsAg、HBeAg 和抗-HBc阳性率，都显著低于男性患者病后所生子女，提示HBV 可能通过HBV DNA 整合的精子，使后代感染HBV。
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分析病原体，分离鉴定其亚型，对于追踪传染源和传播途径，采取相应的预防措施，有重要意义。李允文等(1997年)对湖北省20例经血感染HIV的感染者携带的病毒株进行基因序列测定和亚型分析，分析结果显示，20例感染者携带的都是HIV-1 B亚型，彼此间基因离散率1.9%, 毒株与云南静脉吸毒者及河南、四川的经血感染人群中HIV-1 B亚型密切相关，提示艾滋病在我国有从沿海边境地区向中部地区逐渐蔓延的趋势。
3.在慢性病研究中的应用：随着生活水平的提高，以及疫苗的广泛使用，传染病的发病率和死亡率逐渐降低，而心血管病、肿瘤等慢性疾病的发病率和死亡率在不断上升，成为威胁人类健康的主要疾病。因此，对慢性病的病因研究有重要意义。
肿瘤的产生和发展与癌基因、抗癌基因激活或失活有关。P53基因是一种作用广泛的抑癌基因, 该基因的突变导致肿瘤。高振强等(1997年)用PCR结合单链构象多态性(SSCP)技术分析原发非小细胞肺癌中P53基因的突变谱，发现128例中94例发生突变，其中86例为点突变，点突变以G→T和T→G为主，占63.9%,不同致癌物可能引起特异的碱基突变，芳香烃类致癌物易导致G→T和T→G突变，因此，推论该地区居民肺癌可能主要由芳香烃类致癌物引起。为探索肿瘤的病因，筛选高危人群和肿瘤的早期诊断，应用随机引物聚合酶链反应(AP-PCR)和差异杂交等方法，寻找肿瘤发生的相关基因，亦是目前研究的一个热点。
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传统流行病学对肿瘤的研究，往往局限于对环境因素的大体观察，而对其在体内的转归和其他因素的影响，则研究较少。例如，大量的流行病学调查研究表明，黄曲霉毒素(AFT)与肝癌的发生密切相关，食用受黄曲霉毒素污染粮食越多的地区，其肝癌的发病率也越高。尔后对AFT在体内的暴露生物标志物后效应标志物的分子流行病学研究发现，AFT在体内氧化酶的作用下，形成AFT环氧化物，此环氧化物易与DNA分子N7鸟嘌呤残基结合，造成DNA的损伤。另外，肝癌的发生与人体解毒酶系统某些解毒酶缺陷有关，其中研究较多的是谷胱甘肽转硫酶(GST)。董传辉等(1997年)检测比较病例和对照血标本组织中GSTT1基因缺失，对照人群中GSTT1基因缺失比例为35%，肝癌病例该基因缺失比例为55%，OR值2.30，比较肝癌病例和对照GSTT1与GSTM1联合基因型的分布情况发现，至少有一种基因缺失者较两种基因均存在者患肝癌危险增加了3.7倍。作者认为GSTT1基因缺失可能导致机体对黄曲霉毒素 和其他化学致癌物解毒能力下降。除谷胱甘肽转硫酶外，细胞色素酶(P450)、微粒体中环氧化酶等代谢酶的基因多态性与肿瘤的关系的分子流行病学研究，也有大量报道。
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心血管疾病包括高血压、冠心病和动脉粥样硬化等，其病因可能与多种因素，如饮食、紧张焦虑、遗传等有关。而分子流行病学则进一步从基因水平对其病因进行研究。脂蛋白脂酶(LPL)能促进乳糜微粒和极低密度脂蛋白中甘油三酯(TG)分解，如果LPL活性降低，TG含量增高，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-L)降低，导致冠心病的产生。钱卫冲等(1998年)对106例冠心病病例的病例对照研究发现，LPL PVUⅡ(--)基因型和单倍体基因型H+P-是冠心病的危险因素，HDL-C和APO A/B是保护因素，LPL PVUⅡ(--)基因型与非LPL PVUⅡ(--)基因型的OR值是17.18。H+P-基因型与非H+P-基因型OR值为3.67。
除肿瘤和心血管疾病外，分子流行病学还更广泛研究其他慢性疾病，如糖尿病、自身免疫疾病等疾病的病因、高危人群的筛选及早期诊断等。
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4.在遗传性疾病研究中的应用：非传染病80%～90%与环境因素有关，但外因如何通过内因起作用，仍然是尚待进一步研究的领域。分子流行病学在非传染病研究中阐明遗传易感性方面发挥了极大的作用。血管紧张素转化酶基因(ACE)位于染色体17q23，包括26个外显子和25个内含子，16内含子中的一段287 bp的插入/缺失(I/D)多态性，导致3种基因型：插入纯合子型(Ⅱ)、缺失纯合子型(DD)和杂合子型(ID)。ACE基因缺失型与冠心病、心肌梗死等发病显著相关。沈丹等(1998年)研究ACE基因多态性发现，高血压合并脑梗死的DD基因型频率29.6% 及D等位基因频率56.8%，都显著高于正常组12.9%和38.7%，以及高血压组12.8%和46%，ACE基因缺失型可能是造成中国人高血压合并脑梗死发病的重要遗传易感因素。遗传易感因素的研究，为筛选高危人群提供了线索。
还有一些单基因遗传性疾病更需要从群体遗传学角度研究，其发病机理是单个基因或1对等位基因缺陷或发生突变所引起的, 如果能从群体角度研究其遗传规律，将有重要意义。视网膜母细胞瘤是单基因遗传病，是由于位于13q14的Rb基因的突变或失活所致，目前公认生殖细胞起源的Rb基因的突变决定了患者发生视网膜母细胞瘤的遗传易感性。黄倩等(1998年)利用分子生物学方法，做染色体单体型分析及Rb基因点突变的直接检测，79个有Rb基因突变的视网膜母细胞瘤家系中，25例查出体细胞起源的Rb基因突变，其余54例为生殖细胞起源的Rb基因突变，其中36例突变是新生的，15例突变由亲代遗传，3例为基因突变嵌合体。
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5.应用分子标志物进行筛查和危险度鉴别、评估：高危人群的筛查、群体或个体健康状况的调查和评估，是流行病学研究中一项重要内容。利用分子生物学方法检测一些标志物，使这一研究更加早期、客观和精细。
疾病的自然史是一个从外暴露到内暴露(其中可能包括基因的作用)，再到疾病症状的发展过程，在疾病的不同阶段，可以检测不同的生物标志物。生物标志物可分成基因毒性和非基因毒性两个大类。前者作用于DNA上包括组织、淋巴细胞、尿和蛋白中的加合物，如多环芳烃血红蛋白加合物，人体血清白蛋白黄曲霉毒素加合物等。基因毒性可以通过细胞毒、染色体损伤、姊妹染色体交换、微核或Down氏症的非整倍体、突变等进行鉴定。
危险度鉴别指目标人群暴露于某病原或因素时对健康影响的大小。在研究危险度时要防止偏倚和混杂因素的影响。特别要注意危险度强度、暴露与危险度间时间效应和剂量效应关系以及各不同地区、时间、方法与危险度间的持续联系，以及生物学上的合理性。
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经十几年流行病学研究表明，原发性肝癌主要环境危险因素为HBV感染、黄曲霉毒素和饮用沟塘水。为对肝癌进行社区和个体危险度评估，俞顺章、董传辉等(1997年)对苏北4市13个乡中，每乡抽样50人，测定上述3个指标(HBsAg、黄曲霉毒素白蛋白加合物和饮沟塘水年份)，计算出肝癌综合危险指数、高危个体比例，结果显示各乡肝癌综合危险指数和高危个体比例与当地1991～1993年肝癌死亡率呈明显等级相关(Rs=0.835 2和0.785 7)。说明环境中三大危险因素(乙型肝炎、黄曲霉毒素和饮水中藻类毒素)可能反映肝癌的流行程度。控制某一指标后，生物标志物亦有下降趋势。生物标志物还可用于生物监测、早期发现和早期诊断、预后估计、治疗评估等。
6.在疾病防治方面的应用：进行疫苗的预防接种，是保护易感人群最有效、最经济的方法。使用灭活或减毒活疫苗，存在免疫原性差、毒力回复，疫苗需冷冻或冷藏等缺点。利用分子生物学技术，将DNA重组，构建载体，利用细菌等表达大量的蛋白质作为疫苗，如目前广泛应用的乙型肝炎(乙肝)疫苗，就是将乙肝表面抗原基因连接到适当的载体上，然后在酵母或哺乳动物细胞中表达而得到，通过基因工程生产的乙肝疫苗成本大大低于血源性乙肝疫苗。利用基因工程生产其他疫苗，痢疾、霍乱、疟疾等亦受到人们关注。基因工程疫苗的安全性较灭活或减毒活疫苗提高，但由于基因疫苗大多为高度纯化的小分子蛋白质或多肽，免疫原性差，免疫效果有时不理想。核酸疫苗是第三代预防接种用疫苗，该种疫苗是在质粒DNA上携带编码特定抗原蛋白的基因序列，通过皮内或肌肉注射方式，进入体内。核酸疫苗无需复杂的纯化过程，可诱导机体产生细胞免疫和体液免疫反应，无需冷冻或冷藏, 是有广阔应用前景的疫苗。有关核酸疫苗目前大多在动物中进行，经过安全、有效检验后，有望进行临床试验。
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二、存在的问题
作为流行病学的一门新兴分支学科，国内分子流行病学的发展已初具雏形，但是目前仍然存在一些问题，有待于克服。
首先，各专业期刊中，有关分子流行病学研究的最新进展综述、讲座等方面的文章太少，对介绍分子生物学新理论、新技术和新方法的应用重视不够，因此，应加强分子流行病学知识的宣传和普及。
其次，与传统流行病学的大体观察和表型研究不同，分子流行病学研究首先建立在一定的分子生物学实验条件之上，必须有分子生物学实验室的建立、仪器设备的购置、试剂的使用和实验操作人员的培养，这些都需进行大量经费投入，从而决定了分子流行病学研究特点就是高投入、花费大，如果没有充裕的研究经费的支持，分子流行病学研究的开展普及，也就无从谈起。因此，应加大有关分子流行病学研究课题项目的经费资助力度。
第三，分子生物学技术和方法大多建立在实验室检测基础上，目前，在流行病学研究中则直接借用这些技术和方法，进行人群中的检测，往往未对该技术或方法进行有效性、可信性的评估，因而所下结论有偏倚性。在分子流行病学研究中，为保证检测结果的真实、可靠，所使用的技术或方法首先必须是行之有效、可信, 有一定的有效度和可信度。要经常由权威部门公布和校正分子生物学方法的信度和效度、准确度和精密度、正常范围和可信区间。
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第四，分子流行病学研究开展主要局限于高等院校和科研单位，而基层单位对其的掌握和应用，基本处于空白。高等院校和科研机构有责任有义务，在现有分子生物学技术和检测方法基础上，进行消化、创新，建立符合我国国情的简单易行、快速的分子生物学检测技术和方法，并向基层单位推广普及。
第五，分子流行病学研究内容非常广泛，从病原体到人体，从传染病到慢性病、遗传病等，无所不包，而分子流行病学研究中一个非常重要的内容，就是在群体研究基础上，从分子或基因水平探索疾病的病因和发病机理，打开“黑匣子”，但是，目前分子流行病学研究无论从广度和深度来看，都有待于进一步拓展。
第六，分子流行病学作为流行病学的一门新兴分支学科，它与传统流行病学、统计学等诸多学科间的关系，以及由于分子流行病学的产生，可能导致一些概念、定义上的矛盾、冲突，或可能衍生出新的流行病学研究方法，应引起人们的重视，在理论上进行探讨。例如，疾病的自然史是一个从外暴露到内暴露(其中可能包括基因的作用)，再到疾病症状的发展过程，囿于检测手段，传统流行病学研究的病人是出现临床症状的“病人”，而所谓“正常人”是无临床症状的人，但是分子流行病学通过对生物标志物检测，可以了解机体已出现的损害，在被调查者出现临床症状前，分子流行病学调查就能够观察和确定无症状的隐性“病人”，因此，分子流行病学将对传统上“病人”和“正常人”的概念，提出挑战, 而且，由于使用在疾病发展过程中不同阶段的标志物，搞清疾病的自然史，提出病人早期诊断的新概念，这些必将促使流行病学中横断面研究、病人对照研究以及队列研究的设计、调查实施和统计分析，作出相应调整和改变，以适应这种变化。
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三、展望
毫无疑问，越来越多的分子生物学新技术、新方法应用于流行病学研究，一些经实践证明的具有高灵敏度、特异度的分子生物学检测方法，将逐渐取代旧的传统检测方法，成为新的“金标准”, 在提高灵敏度、特异度的同时，分子流行病学中所应用检测方法，也逐渐趋于快速、简便，向标准化、自动化、定量化方向发展。
不久将绘制出人类基因组。由于基因组计划所使用的调查对象大多来源于家系或选择性人群，检测方法也仅限于实验室中的方法，其结果有待于在不同人群中进行进一步验证。因此，将基因组计划中的发现应用于临床和预防，仍有许多工作要做，而分子流行病学是架接基础研究与临床、预防应用间的桥梁。分子流行病学研究方面包括：评价检测方法的信度、效度和预测值，在不同人群中使用产生的影响；调查不同人群中基因型出现频率；不同人群中基因型与疾病的关系，包括相对危险度、绝对危险度和归因危险度；调查不同人群中不同基因间、基因与环境间、不同环境因素间在疾病发生中的作用。分子流行病学将大有作为。
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作为流行病学的一个分支，分子流行病学调查着重于群体中的个体内暴露、基因型，追寻传染源、传播途径、易感人群。但是，分子流行病学未来发展趋势，并不是将个体从群体中割裂出来，只见树木不见森林，毕竟个体具有一定社会、经济背景，是处于一定环境下的群体中的个体。分子流行病学必须与传统流行病学相结合，既将宏观和微观相结合，将表型观察和基因型、内暴露检测相结合，既见森林又见树木，全面、详尽了解疾病和健康状况在人群中的分布和影响因素，提出相应的预防和控制疾病的措施和策略，这是分子流行病学发展的必由之路。
本文为我刊庆祝建国50周年特邀系列综述第36篇
【作者简介】 俞顺章，男，1932年出生于上海市医学世家。自1956年起，在导师苏德隆教授指导下，从事消灭血吸虫病工作。1971年上海郊县基本消灭血吸虫病后，开始转向从事肝癌流行病学研究。80年代初，以访问学者身份，在加拿大癌症研究所流行病学部工作2年，回国后继续从事癌症防治研究。80年代中期起曾任上海医科大学公共卫生学院院长和预防医学研究所所长。现任中华预防医学会流行病学分会和上海预防医学会副主任委员。在消灭血吸虫病工作中深入现场和实际，做出贡献，被上海市人民政府记大功，所从事的教学工作和科研项目曾获得国家教委教学特等奖和一、三等奖，以及国家科技进步三等奖及上海市科委科技进步二、三等奖等多项。1991年获国务院给予突出贡献表彰。
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作者单位：俞顺章(200032 上海医科大学预防医学研究所)
陈声林(200032 上海医科大学预防医学研究所)
参考文献
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经过短短15年左右时间，国内分子流行病学经历了从产生到起步发展的过程, 成立了分子流行病学学术组，并召开了学术会议，出版了专集；由第四军医大学出版了国内专家编写的《分子流行病学》专著；出现了有一定规模的从事分子流行病学研究工作的队伍；研究内容由传染病病原体研究，到疾病的传播途径和规律，再到肿瘤等慢性病研究，研究领域逐渐扩展。
分子流行病学的发展使流行病学从发病或死亡的统计，传染病三环节二因素调查，进一步发展到为打开“黑匣子”的阶段，研究了解暴露、易感和体内变化的实质。
1.病原体分型和检测：分子流行病学研究最早开始用于对传染病的病原体基因分型，并调查病原体的分布规律。在传染病流行中，对病原体进行准确的分型，对疾病的防治十分重要。由于病原体表型特征的不稳定性和易变性，以表型特征研究的分型方法，如血清学、生化学等，就存在缺陷。而基因型是遗传特征，相当稳定可靠，可以作为病原体鉴定和诊断的重要依据。细菌的产毒、耐药特性都与细菌质粒有关，徐兆炜等(1986年)对在同一地区分离的134株痢疾杆菌进行质粒图谱分析，发现虽然部分菌株耐药谱不同，但仍可呈现为相同的质粒图谱，这对于鉴定菌株，追踪耐药菌株来源极有帮助。rRNA基因是细菌染色体上编码rRNA的DNA序列，属保守基因序列。徐文斌等(1996年)对不同地区、不同时间分离到的119株伤寒沙门氏菌进行rRNA(RTs)的基因多态性分析，119株细菌可分为38个RTs，其中RT9和RT11是造成我国伤寒流行的主要RTs。对于病毒的分型，可以采取先进行病毒的细胞培养，病毒增殖到一定程度后，提取病毒DNA，再进行限制性内切图谱分析。
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PCR技术的出现，使对病原体分析过程更加简化、快捷。首先设计引物，PCR扩增病原体DNA中一段保守的基因片段，然后进行酶切分析。例如，苏虹等(1997年)利用逆转录-多聚酶链反应(RT-PCR)和限制性片段长度多态性(RFLP)分析安徽HCV基因型的分布，结果表明，安徽HCV感染以Ⅱ型为主，其中北部地区Ⅲ型感染多于南部，而Ⅱ型北部少于南部。对病原体的基因型、多态性、变异性可以应用单链构象多态性 (SSCP)、脉冲场电泳(PFGE)以及序列分析等多种方法进行分析。
基因的多态性也表现为酶分子的多态性，对酶分子的多态性的研究，也可了解不同病原体间遗传关系、分类分型。段广才等(1996年)应用多位点酶电泳法(MEE)对471株霍乱弧菌进行分类，结果证实古典型和埃尔托型流行株遗传关系紧密；非流行株相互间流行关系较远。O139群与O1群流行株有相同的霍乱毒素(CT)片段，应按流行株对待。
对病原体的检测，以往多使用病原体培养、生化分析、血清学和免疫学检测等，上述方法都存在各种缺陷，如检测时间长、灵敏度、特异度不高等。利用放射性同位素标记探针检测病原体，是一种灵敏、特异的检测方法。除用同位素标记探针外，更多的使用非同位素如地高辛、生物素等标记探针，增加了安全性。核酸分子杂交方法检测病原体，在流行病学研究中应用日益增多。王云飞等(1994年)对不同基因型人乳头瘤病毒(HPV)在宫颈癌、尖锐湿疣等中起不同作用进行了研究，证明HPV 11/6型引起性传播的尖锐湿疣；而HPV 16/18型则与宫颈癌关系密切，HPV 52/58型与宫颈癌关系还有待证实。
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PCR不仅可以用于基因分离、克隆和序列分析，还可用于检测病原体。蔡庆等(1997年)在产毒大肠杆菌(ETEL)肠毒素基因内设计3对引物，1次PCR可扩增3种肠毒素基因片段，可同时检测5种基因型的ETEL。另外，多基因PCR法选择高度保守区、特异、稳定、不重复的引物可以同时检测多种病原体。
2.人群中疾病流行规律、传播机制研究：目前疾病在人群中流行的现象比以往更加复杂，已由三环节二因素向三要素，甚至四要素发展。病因已由单病因、单效应，向多病因、单效应，甚至多病因、多效应发展。传播机制也由水平传播、垂直传播(母婴传播)到混合传播。疾病侵入人体途径亦日益复杂。疾病中隐性病例与显性病例的比例不断上升，非典型和隐性感染者越来越多。传染病的潜伏期和非传染病的潜隐期也越来越长了，而发病的频率则越来越低。因此，使用传统的检测方法，调查传染源、传播途径，确定疾病流行规律，就往往存在一定的困难。
解决上述困难的主要途径之一是发展分子流行病学。使检测手段更加先进、敏感度和特异度更高。HBV的垂直传播一直是人们关注的问题, 既往的有关研究，都缺乏直接的证据，证明垂直传播的存在。唐时幸等(1991年)使用核酸分子杂交法，从胎儿胎盘组织中检测到HBV DNA，说明HBV可通过胎盘屏障感染胎儿，而且调查还发现，母亲HBV DNA阳性，胎儿宫内感染的机会大大增加。HBV可以通过母亲传染给胎儿, 还可能由父亲传染给后代。王培林等(1998年)对乙型肝炎患者家系进行分子流行病学调查，比较男性患者病前所生子女HBV DNA U5样序列片段检出率及HBsAg、HBeAg 和抗-HBc阳性率，都显著低于男性患者病后所生子女，提示HBV 可能通过HBV DNA 整合的精子，使后代感染HBV。
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分析病原体，分离鉴定其亚型，对于追踪传染源和传播途径，采取相应的预防措施，有重要意义。李允文等(1997年)对湖北省20例经血感染HIV的感染者携带的病毒株进行基因序列测定和亚型分析，分析结果显示，20例感染者携带的都是HIV-1 B亚型，彼此间基因离散率1.9%, 毒株与云南静脉吸毒者及河南、四川的经血感染人群中HIV-1 B亚型密切相关，提示艾滋病在我国有从沿海边境地区向中部地区逐渐蔓延的趋势。
3.在慢性病研究中的应用：随着生活水平的提高，以及疫苗的广泛使用，传染病的发病率和死亡率逐渐降低，而心血管病、肿瘤等慢性疾病的发病率和死亡率在不断上升，成为威胁人类健康的主要疾病。因此，对慢性病的病因研究有重要意义。
肿瘤的产生和发展与癌基因、抗癌基因激活或失活有关。P53基因是一种作用广泛的抑癌基因, 该基因的突变导致肿瘤。高振强等(1997年)用PCR结合单链构象多态性(SSCP)技术分析原发非小细胞肺癌中P53基因的突变谱，发现128例中94例发生突变，其中86例为点突变，点突变以G→T和T→G为主，占63.9%,不同致癌物可能引起特异的碱基突变，芳香烃类致癌物易导致G→T和T→G突变，因此，推论该地区居民肺癌可能主要由芳香烃类致癌物引起。为探索肿瘤的病因，筛选高危人群和肿瘤的早期诊断，应用随机引物聚合酶链反应(AP-PCR)和差异杂交等方法，寻找肿瘤发生的相关基因，亦是目前研究的一个热点。
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传统流行病学对肿瘤的研究，往往局限于对环境因素的大体观察，而对其在体内的转归和其他因素的影响，则研究较少。例如，大量的流行病学调查研究表明，黄曲霉毒素(AFT)与肝癌的发生密切相关，食用受黄曲霉毒素污染粮食越多的地区，其肝癌的发病率也越高。尔后对AFT在体内的暴露生物标志物后效应标志物的分子流行病学研究发现，AFT在体内氧化酶的作用下，形成AFT环氧化物，此环氧化物易与DNA分子N7鸟嘌呤残基结合，造成DNA的损伤。另外，肝癌的发生与人体解毒酶系统某些解毒酶缺陷有关，其中研究较多的是谷胱甘肽转硫酶(GST)。董传辉等(1997年)检测比较病例和对照血标本组织中GSTT1基因缺失，对照人群中GSTT1基因缺失比例为35%，肝癌病例该基因缺失比例为55%，OR值2.30，比较肝癌病例和对照GSTT1与GSTM1联合基因型的分布情况发现，至少有一种基因缺失者较两种基因均存在者患肝癌危险增加了3.7倍。作者认为GSTT1基因缺失可能导致机体对黄曲霉毒素 和其他化学致癌物解毒能力下降。除谷胱甘肽转硫酶外，细胞色素酶(P450)、微粒体中环氧化酶等代谢酶的基因多态性与肿瘤的关系的分子流行病学研究，也有大量报道。
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心血管疾病包括高血压、冠心病和动脉粥样硬化等，其病因可能与多种因素，如饮食、紧张焦虑、遗传等有关。而分子流行病学则进一步从基因水平对其病因进行研究。脂蛋白脂酶(LPL)能促进乳糜微粒和极低密度脂蛋白中甘油三酯(TG)分解，如果LPL活性降低，TG含量增高，高密度脂蛋白胆固醇(HDL-L)降低，导致冠心病的产生。钱卫冲等(1998年)对106例冠心病病例的病例对照研究发现，LPL PVUⅡ(--)基因型和单倍体基因型H+P-是冠心病的危险因素，HDL-C和APO A/B是保护因素，LPL PVUⅡ(--)基因型与非LPL PVUⅡ(--)基因型的OR值是17.18。H+P-基因型与非H+P-基因型OR值为3.67。
除肿瘤和心血管疾病外，分子流行病学还更广泛研究其他慢性疾病，如糖尿病、自身免疫疾病等疾病的病因、高危人群的筛选及早期诊断等。
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4.在遗传性疾病研究中的应用：非传染病80%～90%与环境因素有关，但外因如何通过内因起作用，仍然是尚待进一步研究的领域。分子流行病学在非传染病研究中阐明遗传易感性方面发挥了极大的作用。血管紧张素转化酶基因(ACE)位于染色体17q23，包括26个外显子和25个内含子，16内含子中的一段287 bp的插入/缺失(I/D)多态性，导致3种基因型：插入纯合子型(Ⅱ)、缺失纯合子型(DD)和杂合子型(ID)。ACE基因缺失型与冠心病、心肌梗死等发病显著相关。沈丹等(1998年)研究ACE基因多态性发现，高血压合并脑梗死的DD基因型频率29.6% 及D等位基因频率56.8%，都显著高于正常组12.9%和38.7%，以及高血压组12.8%和46%，ACE基因缺失型可能是造成中国人高血压合并脑梗死发病的重要遗传易感因素。遗传易感因素的研究，为筛选高危人群提供了线索。
还有一些单基因遗传性疾病更需要从群体遗传学角度研究，其发病机理是单个基因或1对等位基因缺陷或发生突变所引起的, 如果能从群体角度研究其遗传规律，将有重要意义。视网膜母细胞瘤是单基因遗传病，是由于位于13q14的Rb基因的突变或失活所致，目前公认生殖细胞起源的Rb基因的突变决定了患者发生视网膜母细胞瘤的遗传易感性。黄倩等(1998年)利用分子生物学方法，做染色体单体型分析及Rb基因点突变的直接检测，79个有Rb基因突变的视网膜母细胞瘤家系中，25例查出体细胞起源的Rb基因突变，其余54例为生殖细胞起源的Rb基因突变，其中36例突变是新生的，15例突变由亲代遗传，3例为基因突变嵌合体。
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5.应用分子标志物进行筛查和危险度鉴别、评估：高危人群的筛查、群体或个体健康状况的调查和评估，是流行病学研究中一项重要内容。利用分子生物学方法检测一些标志物，使这一研究更加早期、客观和精细。
疾病的自然史是一个从外暴露到内暴露(其中可能包括基因的作用)，再到疾病症状的发展过程，在疾病的不同阶段，可以检测不同的生物标志物。生物标志物可分成基因毒性和非基因毒性两个大类。前者作用于DNA上包括组织、淋巴细胞、尿和蛋白中的加合物，如多环芳烃血红蛋白加合物，人体血清白蛋白黄曲霉毒素加合物等。基因毒性可以通过细胞毒、染色体损伤、姊妹染色体交换、微核或Down氏症的非整倍体、突变等进行鉴定。
危险度鉴别指目标人群暴露于某病原或因素时对健康影响的大小。在研究危险度时要防止偏倚和混杂因素的影响。特别要注意危险度强度、暴露与危险度间时间效应和剂量效应关系以及各不同地区、时间、方法与危险度间的持续联系，以及生物学上的合理性。
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经十几年流行病学研究表明，原发性肝癌主要环境危险因素为HBV感染、黄曲霉毒素和饮用沟塘水。为对肝癌进行社区和个体危险度评估，俞顺章、董传辉等(1997年)对苏北4市13个乡中，每乡抽样50人，测定上述3个指标(HBsAg、黄曲霉毒素白蛋白加合物和饮沟塘水年份)，计算出肝癌综合危险指数、高危个体比例，结果显示各乡肝癌综合危险指数和高危个体比例与当地1991～1993年肝癌死亡率呈明显等级相关(Rs=0.835 2和0.785 7)。说明环境中三大危险因素(乙型肝炎、黄曲霉毒素和饮水中藻类毒素)可能反映肝癌的流行程度。控制某一指标后，生物标志物亦有下降趋势。生物标志物还可用于生物监测、早期发现和早期诊断、预后估计、治疗评估等。
6.在疾病防治方面的应用：进行疫苗的预防接种，是保护易感人群最有效、最经济的方法。使用灭活或减毒活疫苗，存在免疫原性差、毒力回复，疫苗需冷冻或冷藏等缺点。利用分子生物学技术，将DNA重组，构建载体，利用细菌等表达大量的蛋白质作为疫苗，如目前广泛应用的乙型肝炎(乙肝)疫苗，就是将乙肝表面抗原基因连接到适当的载体上，然后在酵母或哺乳动物细胞中表达而得到，通过基因工程生产的乙肝疫苗成本大大低于血源性乙肝疫苗。利用基因工程生产其他疫苗，痢疾、霍乱、疟疾等亦受到人们关注。基因工程疫苗的安全性较灭活或减毒活疫苗提高，但由于基因疫苗大多为高度纯化的小分子蛋白质或多肽，免疫原性差，免疫效果有时不理想。核酸疫苗是第三代预防接种用疫苗，该种疫苗是在质粒DNA上携带编码特定抗原蛋白的基因序列，通过皮内或肌肉注射方式，进入体内。核酸疫苗无需复杂的纯化过程，可诱导机体产生细胞免疫和体液免疫反应，无需冷冻或冷藏, 是有广阔应用前景的疫苗。有关核酸疫苗目前大多在动物中进行，经过安全、有效检验后，有望进行临床试验。
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二、存在的问题
作为流行病学的一门新兴分支学科，国内分子流行病学的发展已初具雏形，但是目前仍然存在一些问题，有待于克服。
首先，各专业期刊中，有关分子流行病学研究的最新进展综述、讲座等方面的文章太少，对介绍分子生物学新理论、新技术和新方法的应用重视不够，因此，应加强分子流行病学知识的宣传和普及。
其次，与传统流行病学的大体观察和表型研究不同，分子流行病学研究首先建立在一定的分子生物学实验条件之上，必须有分子生物学实验室的建立、仪器设备的购置、试剂的使用和实验操作人员的培养，这些都需进行大量经费投入，从而决定了分子流行病学研究特点就是高投入、花费大，如果没有充裕的研究经费的支持，分子流行病学研究的开展普及，也就无从谈起。因此，应加大有关分子流行病学研究课题项目的经费资助力度。
第三，分子生物学技术和方法大多建立在实验室检测基础上，目前，在流行病学研究中则直接借用这些技术和方法，进行人群中的检测，往往未对该技术或方法进行有效性、可信性的评估，因而所下结论有偏倚性。在分子流行病学研究中，为保证检测结果的真实、可靠，所使用的技术或方法首先必须是行之有效、可信, 有一定的有效度和可信度。要经常由权威部门公布和校正分子生物学方法的信度和效度、准确度和精密度、正常范围和可信区间。
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第四，分子流行病学研究开展主要局限于高等院校和科研单位，而基层单位对其的掌握和应用，基本处于空白。高等院校和科研机构有责任有义务，在现有分子生物学技术和检测方法基础上，进行消化、创新，建立符合我国国情的简单易行、快速的分子生物学检测技术和方法，并向基层单位推广普及。
第五，分子流行病学研究内容非常广泛，从病原体到人体，从传染病到慢性病、遗传病等，无所不包，而分子流行病学研究中一个非常重要的内容，就是在群体研究基础上，从分子或基因水平探索疾病的病因和发病机理，打开“黑匣子”，但是，目前分子流行病学研究无论从广度和深度来看，都有待于进一步拓展。
第六，分子流行病学作为流行病学的一门新兴分支学科，它与传统流行病学、统计学等诸多学科间的关系，以及由于分子流行病学的产生，可能导致一些概念、定义上的矛盾、冲突，或可能衍生出新的流行病学研究方法，应引起人们的重视，在理论上进行探讨。例如，疾病的自然史是一个从外暴露到内暴露(其中可能包括基因的作用)，再到疾病症状的发展过程，囿于检测手段，传统流行病学研究的病人是出现临床症状的“病人”，而所谓“正常人”是无临床症状的人，但是分子流行病学通过对生物标志物检测，可以了解机体已出现的损害，在被调查者出现临床症状前，分子流行病学调查就能够观察和确定无症状的隐性“病人”，因此，分子流行病学将对传统上“病人”和“正常人”的概念，提出挑战, 而且，由于使用在疾病发展过程中不同阶段的标志物，搞清疾病的自然史，提出病人早期诊断的新概念，这些必将促使流行病学中横断面研究、病人对照研究以及队列研究的设计、调查实施和统计分析，作出相应调整和改变，以适应这种变化。
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三、展望
毫无疑问，越来越多的分子生物学新技术、新方法应用于流行病学研究，一些经实践证明的具有高灵敏度、特异度的分子生物学检测方法，将逐渐取代旧的传统检测方法，成为新的“金标准”, 在提高灵敏度、特异度的同时，分子流行病学中所应用检测方法，也逐渐趋于快速、简便，向标准化、自动化、定量化方向发展。
不久将绘制出人类基因组。由于基因组计划所使用的调查对象大多来源于家系或选择性人群，检测方法也仅限于实验室中的方法，其结果有待于在不同人群中进行进一步验证。因此，将基因组计划中的发现应用于临床和预防，仍有许多工作要做，而分子流行病学是架接基础研究与临床、预防应用间的桥梁。分子流行病学研究方面包括：评价检测方法的信度、效度和预测值，在不同人群中使用产生的影响；调查不同人群中基因型出现频率；不同人群中基因型与疾病的关系，包括相对危险度、绝对危险度和归因危险度；调查不同人群中不同基因间、基因与环境间、不同环境因素间在疾病发生中的作用。分子流行病学将大有作为。
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作为流行病学的一个分支，分子流行病学调查着重于群体中的个体内暴露、基因型，追寻传染源、传播途径、易感人群。但是，分子流行病学未来发展趋势，并不是将个体从群体中割裂出来，只见树木不见森林，毕竟个体具有一定社会、经济背景，是处于一定环境下的群体中的个体。分子流行病学必须与传统流行病学相结合，既将宏观和微观相结合，将表型观察和基因型、内暴露检测相结合，既见森林又见树木，全面、详尽了解疾病和健康状况在人群中的分布和影响因素，提出相应的预防和控制疾病的措施和策略，这是分子流行病学发展的必由之路。
本文为我刊庆祝建国50周年特邀系列综述第36篇
【作者简介】 俞顺章，男，1932年出生于上海市医学世家。自1956年起，在导师苏德隆教授指导下，从事消灭血吸虫病工作。1971年上海郊县基本消灭血吸虫病后，开始转向从事肝癌流行病学研究。80年代初，以访问学者身份，在加拿大癌症研究所流行病学部工作2年，回国后继续从事癌症防治研究。80年代中期起曾任上海医科大学公共卫生学院院长和预防医学研究所所长。现任中华预防医学会流行病学分会和上海预防医学会副主任委员。在消灭血吸虫病工作中深入现场和实际，做出贡献，被上海市人民政府记大功，所从事的教学工作和科研项目曾获得国家教委教学特等奖和一、三等奖，以及国家科技进步三等奖及上海市科委科技进步二、三等奖等多项。1991年获国务院给予突出贡献表彰。
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作者单位：俞顺章(200032 上海医科大学预防医学研究所)
陈声林(200032 上海医科大学预防医学研究所)
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