转化生长因子β1在超压力负荷肥厚心肌中的表达及Losartan干预
转化生长因子β1在超压力负荷肥厚心肌中的表达及Losartan干预
唐兵 刘世玉 速晓华 肖东 褚桂珍 周兴文
摘 要 本研究旨在探讨转化生长因子β1(TGF-β1)在左室肥厚发生、发展中的作用及与血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)关系，以及Losartan对左室肥厚的干预作用。应用放射免疫分析法及免疫组化方法测定腹主动脉缩窄后心肌组织AngⅡ水平、TGF-β1的表达变化。发现腹主动脉缩窄后心肌组织AngⅡ水平及血管紧张素转换酶(ACE)活性升高(P<0.01)，TGF-β1在心肌细胞胞浆中的表达显著增加(P<0.01)，术后第7天达最高峰，在胞核的表达显著减少(P<0.01)，术后第14天时核表达阴性，左室肥厚病理改变明显。应用AngⅡⅠ型受体拮抗剂Losartan后，胞浆TGF-β1表达下降，核表达增加，阳性率由术前的23%增加到43%，左室肥厚被抑制。提示TGF-β1参与左室肥厚的发生、发展，在胞浆的表达可能促进肥厚，在胞核的表达可能抑制肥厚，并受血管紧张素Ⅱ调控，应用Losartan能有效抑制左室肥厚。
, 百拇医药
关键词：转化生长因子β1；左室肥厚；血管紧张素Ⅱ；受体
左室肥厚是高血压、冠心病、心力衰竭的重要病理生理改变，与心血管疾病预后密切相关[1]。对其发生机制及防治的研究就显得尤为重要。当前关于左室肥厚与心肌局部的肾素-血管紧张素系统关系的研究颇多，但其中具体的信号传递系统尚不清楚。本研究通过观察TGF-β1在超压力负荷肥厚心肌中的表达变化及血管紧张素ⅡⅠ型受体拮抗剂Losartan对其的影响，探讨TGF-β1在左室肥厚发生、发展中的作用及与血管紧张素Ⅱ的关系，以及Losartan对左室肥厚的干预作用，这在国内鲜有报道。
材料与方法
一、主要材料
Losartan(科素亚，美国默沙东公司)，转化生长因子β1多克隆抗体(购于北京中山生物公司，Santa Cruz公司产品)，Spkit试剂盒(购于迈新公司，Zymed公司产品)，血管紧张素Ⅱ测定试剂盒(购于北方生物技术研究所)，血管紧张素转换酶(ACE)活性测定试剂盒(购于海军总医院)，其它试剂为国产分析纯。
, 百拇医药
二、动物模型及分组
超压力负荷肥厚心肌模型采用腹主动脉缩窄法[2]。雌雄各半的Wistar大鼠，体重250～300g，4%戊巴比妥(40mg/kg)腹腔麻醉，在左上腹膈肌下，双侧肾动脉上方游离腹主动脉，沿腹主动脉长轴置直径为0.7mm的小圆棒(7号针头磨制)，用“3-0”号丝线结扎腹主动脉及小圆棒，再抽出小圆棒，使腹主动脉残留直径为0.7mm残腔，造成腹主动脉狭窄。假手术组动物除不用丝线结扎外，所有步骤均与手术组相同。将72只动物随机分为假手术组(对照组)、手术组和给药组(Losartan 5mg/kg*d-1灌胃给药从术前4天至术后2周)，分别有术后3天、7天、14天组，每组8只。
三、检测指标
(一)标本制备 大鼠称重、麻醉，颈动脉插管记录颈动脉内压力，取血2ml置入盛有2-巯基丙醇20ul、8-羟基喹啉10ul、10%依地酸二钠20ul的抗凝试管，测定血浆Ang Ⅱ。大鼠断头处死后，开胸取出心脏，立即用0.02M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)灌洗至流出液无血色为止，沿房室环剪去心房，沿室间隔剪去右心室，保留室间隔，左心室肌以滤纸吸干，称重后置液氮罐。左室重量指数=左室重量(mg)/体重(g)。
, 百拇医药
(二)生化测定 心肌组织Ang Ⅱ含量测定采用放射免疫分析法，按试剂盒说明书操作。心肌组织ACE活性测定采用紫外分光光度法，按试剂盒说明书操作。
(三)TGF-β1免疫组化染色及其结果半定量 4%多聚甲醛固定好的左心室肌标本用石蜡包埋后连续取2张切片(厚5μm)分别HE染色及TGF-β1免疫组化染色(ABC法)。步骤：脱蜡、水化。0.3%过氧化氢甲醇液灭活内源性过氧化物酶。抗原热修复后10%正常山羊血清封闭非特异性染色。滴加适当稀释的第一抗体(1∶100稀释)，4℃过夜。滴加生物素标记的第二抗体(1∶300稀释)，37℃孵育30min。滴加辣根过氧化物酶标记的链霉亲合素(1∶300稀释)，37℃孵育30min。滴加DAB-H2O2显色液，于显微镜下监测显色。最后苏木素复染，常规封片。在图像分析仪上测定TGF-β1阳性信号面积和阳性信号平均灰度值(取5个高倍视野)，计算阳性信号指数。阳性信号指数=阳性信号面积×阳性信号平均灰度/测定面积×100，并计算每个视野中TGF-β1核表达阳性的计数，取均数。
, 百拇医药
(四)病理学检查 常规HE染色，光镜下观察心肌细胞变性、坏死、增生，淋巴、单核细胞浸润及肉芽肿形成、间质增生情况。
四、统计学分析 数据以平均数±标准差(X±s)表示，组间比较采用t检验。
结 果
一、血压、左室重量指数的变化 手术组术后3天、7天、14天血压水平、左室重量指数均显著高于对照组(P<0.01)，表明超压力负荷肥厚心肌模型建成。给药组3天、7天的血压水平较手术组无显著下降(P>0.05)，14天时血压水平较手术组显著下降(P<0.01)；而给药组3天、7天、14天的左室重量指数较手术组显著下降(P<0.05,0.01)，见表1。
二、心肌组织AngⅡ水平和ACE活性变化 手术组术后3天、7天、14天心肌组织AngⅡ水平和ACE活性显著高于对照组(P<0.01)，给药组7天、14天时心肌组织AngⅡ水平和ACE活性显著高于手术组(P<0.05,0.01)，见表2。血浆AngⅡ水平各组间无显著差异，仅14天时，给药组的血浆AngⅡ水平显著高于对照组(P<0.01)。
, 百拇医药
表1 术后颈动脉血压、左室重量指数的变化(X±s,n=8)
项目
血压(kPa)
左室重量指数(mg/g)
对照组
手术组
给药组
对照组
手术组
给药组
3天
13.8±1.54
, 百拇医药
23.5±1.84*
23.5±1.69
2.02±0.07
2.22±0.06*
2.12±0.08☆
7天
16.4±1.56
28.0±1.63*
27.5±1.68
1.89±0.08
, 百拇医药
2.68±0.09*
2.46±0.07▲
14天
16.4±1.42
35.1±1.78*
26.4±1.53△
1.93±0.08
2.97±0.07*
1.99±0.06△
注：与对照组比较：*P<0.01；与手术组术后3天比较：☆P<0.05;与手术组术后7天比较：▲P<0.01；与手术组术后14天比较：△P<0.01表2 术后心肌组织AngⅡ水平ACE活性的变化(X±s,n=8)
, 百拇医药
项目
AngⅡ水平(pg/g.wet mass)
ACE活性(u/g.Wet mass)
对照组
手术组
给药组
对照组
手术组
给药组
3天
279±18.4
307±19.0*
, 百拇医药
316±18.7
53.8±11.3
76.4±11.8*
87.3±14.3
7天
281±17.7
322±17.3*
336±19.8
57.4±11.0
93.2±11.5*
108.4±13.3☆
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14天
277±18.8
356±13.9*
388±14.5△
57.7±12.1
117.4±11.5*
141.9±11.6△
注：与对照组比较：*P<0.01；与手术组术后7天比较：☆P<0.05;与手术组术后14天比较：△P<0.01
三、心肌组织TGF-β1的表达变化 手术组心肌细胞胞浆TGF-β1表达较对照组显著增加(P<0.01)，高峰在术后7天、14天时回到对照组水平；核表达术后显著减少(P<0.01)，14天时核表达阴性。给药组的胞浆表达较手术组显著下降(P<0.01)，核表达较手术组显著增加(P<0.01)，核表达阳性率由对照组的23%增加到43%，见表3。
, 百拇医药
表3 术后心肌细胞TGF-β1表达变化(X±s,n=8)
项目
阳性信号指数
核表达阳性计数(个/视野)
对照组
手术组
给药组
对照组
手术组
给药组
3天
33.29±2.44
, 百拇医药
38.75±2.74*
36.59±2.66
9.4±1.1
5.4±1.1**
8.3±1.2☆
7天
33.56±2.39
55.75±3.02**
44.63±2.67▲
8.8±1.4
, 百拇医药 4.0±1.2**
12±1.2▲
14天
33.96±2.56
34.99±2.46
34.16±2.14
9.5±1.2
0**
17.5±1.2△
注：与对照组比较：*P<0.05；**P<0.01;与手术组术后3天比较：☆P<0.01;与手术组术后7天比较：▲P<0.01；与手术组术后14天比较：△P<0.01
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四、心肌组织的病理改变 手术组术后3天时心肌有点灶坏死，肌纤维断裂及明显的淋巴、单核细胞浸润；术后7天时这些病变呈多灶性分布，肌纤维增粗，核增大，形态不规则，核仁浓染；术后14天时有多灶肉芽肿形成，间质增生。给药组的上述病理改变明显减轻。
讨 论
在本实验中，我们应用小剂量Losartan在无明显降压条件下，左室重量指数显著下降，左室肥厚的病理改变明显减轻，说明Losartan能有效抑制左室肥厚，也更进一步证实左室肥厚与心肌局部的血管紧张素系统有关[3]。
TGF-β1是多功能调节因子，调节细胞的增殖、分化，参与胞外基质的合成及降解，与心脏的生长、发育、修复有关[4，5]。本实验结果表明，腹主动脉缩窄后，心肌局部的血管紧张素系统激活，TGF-β1在心肌细胞胞浆的表达明显增加，在胞核表达明显减少，左室肥厚的病理改变明显。应用小剂量血管紧张素ⅡⅠ型受体拮抗剂Losartan在无明显降压条件下，TGF-β1在胞浆的表达明显减少，在胞核的表达明显增加，左室肥厚被显著抑制。TGF-β1的这种表达变化说明其参与左室肥厚的发生、发展。在胞浆的表达可能促进肥厚，在胞核的表达可能抑制肥厚，且血管紧张素Ⅱ可能通过其Ⅰ型受体调控TGF-β1表达而致左室肥厚。
, 百拇医药
唐兵(成都军区总医院 心内科 610083)
刘世玉(成都军区总医院 心内科 610083)
速晓华(成都军区总医院 心内科 610083)
肖东(成都军区总医院 心内科 610083)
褚桂珍(成都军区总医院 心内科 610083)
周兴文(成都军区总医院 心内科 610083)
参考文献
1，Kannel WB.Epidemiology and prevention of cardiac failure:Framingham study insights.Eur Heart J,1987,8:23～26.
, 百拇医药
2，Benazk M.Chenges in heart weight and blood pressure following aortic constriction in rats.Can J Biochem Physiol,1995,33:995～1002.
3，张琪，丁金风，任兵，等.心脏血管组织肾素血管紧张素系统在自发性高血压大鼠发病中的作用.中国高血压杂志，1994，2(1)：24～26.
4，Thompson NL,Flanders KC,Smith JM,et al.Expression of transforming growth factor-β1 in specific cells and tissues of adult and neonatal mice.J Cell Biol,1989,108:66～669.
5，Sharma HS,Wunsch M,Kandolf R.Angiogenesis by slow coronary artery occlusion in the pig heart:expression of different growth factors mRNA'S.J Moll Cell Cardiol,1989,21:S24., http://www.100md.com
唐兵 刘世玉 速晓华 肖东 褚桂珍 周兴文
摘 要 本研究旨在探讨转化生长因子β1(TGF-β1)在左室肥厚发生、发展中的作用及与血管紧张素Ⅱ(AngⅡ)关系，以及Losartan对左室肥厚的干预作用。应用放射免疫分析法及免疫组化方法测定腹主动脉缩窄后心肌组织AngⅡ水平、TGF-β1的表达变化。发现腹主动脉缩窄后心肌组织AngⅡ水平及血管紧张素转换酶(ACE)活性升高(P<0.01)，TGF-β1在心肌细胞胞浆中的表达显著增加(P<0.01)，术后第7天达最高峰，在胞核的表达显著减少(P<0.01)，术后第14天时核表达阴性，左室肥厚病理改变明显。应用AngⅡⅠ型受体拮抗剂Losartan后，胞浆TGF-β1表达下降，核表达增加，阳性率由术前的23%增加到43%，左室肥厚被抑制。提示TGF-β1参与左室肥厚的发生、发展，在胞浆的表达可能促进肥厚，在胞核的表达可能抑制肥厚，并受血管紧张素Ⅱ调控，应用Losartan能有效抑制左室肥厚。
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关键词：转化生长因子β1；左室肥厚；血管紧张素Ⅱ；受体
左室肥厚是高血压、冠心病、心力衰竭的重要病理生理改变，与心血管疾病预后密切相关[1]。对其发生机制及防治的研究就显得尤为重要。当前关于左室肥厚与心肌局部的肾素-血管紧张素系统关系的研究颇多，但其中具体的信号传递系统尚不清楚。本研究通过观察TGF-β1在超压力负荷肥厚心肌中的表达变化及血管紧张素ⅡⅠ型受体拮抗剂Losartan对其的影响，探讨TGF-β1在左室肥厚发生、发展中的作用及与血管紧张素Ⅱ的关系，以及Losartan对左室肥厚的干预作用，这在国内鲜有报道。
材料与方法
一、主要材料
Losartan(科素亚，美国默沙东公司)，转化生长因子β1多克隆抗体(购于北京中山生物公司，Santa Cruz公司产品)，Spkit试剂盒(购于迈新公司，Zymed公司产品)，血管紧张素Ⅱ测定试剂盒(购于北方生物技术研究所)，血管紧张素转换酶(ACE)活性测定试剂盒(购于海军总医院)，其它试剂为国产分析纯。
, 百拇医药
二、动物模型及分组
超压力负荷肥厚心肌模型采用腹主动脉缩窄法[2]。雌雄各半的Wistar大鼠，体重250～300g，4%戊巴比妥(40mg/kg)腹腔麻醉，在左上腹膈肌下，双侧肾动脉上方游离腹主动脉，沿腹主动脉长轴置直径为0.7mm的小圆棒(7号针头磨制)，用“3-0”号丝线结扎腹主动脉及小圆棒，再抽出小圆棒，使腹主动脉残留直径为0.7mm残腔，造成腹主动脉狭窄。假手术组动物除不用丝线结扎外，所有步骤均与手术组相同。将72只动物随机分为假手术组(对照组)、手术组和给药组(Losartan 5mg/kg*d-1灌胃给药从术前4天至术后2周)，分别有术后3天、7天、14天组，每组8只。
三、检测指标
(一)标本制备 大鼠称重、麻醉，颈动脉插管记录颈动脉内压力，取血2ml置入盛有2-巯基丙醇20ul、8-羟基喹啉10ul、10%依地酸二钠20ul的抗凝试管，测定血浆Ang Ⅱ。大鼠断头处死后，开胸取出心脏，立即用0.02M磷酸盐缓冲液(pH 7.4)灌洗至流出液无血色为止，沿房室环剪去心房，沿室间隔剪去右心室，保留室间隔，左心室肌以滤纸吸干，称重后置液氮罐。左室重量指数=左室重量(mg)/体重(g)。
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(二)生化测定 心肌组织Ang Ⅱ含量测定采用放射免疫分析法，按试剂盒说明书操作。心肌组织ACE活性测定采用紫外分光光度法，按试剂盒说明书操作。
(三)TGF-β1免疫组化染色及其结果半定量 4%多聚甲醛固定好的左心室肌标本用石蜡包埋后连续取2张切片(厚5μm)分别HE染色及TGF-β1免疫组化染色(ABC法)。步骤：脱蜡、水化。0.3%过氧化氢甲醇液灭活内源性过氧化物酶。抗原热修复后10%正常山羊血清封闭非特异性染色。滴加适当稀释的第一抗体(1∶100稀释)，4℃过夜。滴加生物素标记的第二抗体(1∶300稀释)，37℃孵育30min。滴加辣根过氧化物酶标记的链霉亲合素(1∶300稀释)，37℃孵育30min。滴加DAB-H2O2显色液，于显微镜下监测显色。最后苏木素复染，常规封片。在图像分析仪上测定TGF-β1阳性信号面积和阳性信号平均灰度值(取5个高倍视野)，计算阳性信号指数。阳性信号指数=阳性信号面积×阳性信号平均灰度/测定面积×100，并计算每个视野中TGF-β1核表达阳性的计数，取均数。
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(四)病理学检查 常规HE染色，光镜下观察心肌细胞变性、坏死、增生，淋巴、单核细胞浸润及肉芽肿形成、间质增生情况。
四、统计学分析 数据以平均数±标准差(X±s)表示，组间比较采用t检验。
结 果
一、血压、左室重量指数的变化 手术组术后3天、7天、14天血压水平、左室重量指数均显著高于对照组(P<0.01)，表明超压力负荷肥厚心肌模型建成。给药组3天、7天的血压水平较手术组无显著下降(P>0.05)，14天时血压水平较手术组显著下降(P<0.01)；而给药组3天、7天、14天的左室重量指数较手术组显著下降(P<0.05,0.01)，见表1。
二、心肌组织AngⅡ水平和ACE活性变化 手术组术后3天、7天、14天心肌组织AngⅡ水平和ACE活性显著高于对照组(P<0.01)，给药组7天、14天时心肌组织AngⅡ水平和ACE活性显著高于手术组(P<0.05,0.01)，见表2。血浆AngⅡ水平各组间无显著差异，仅14天时，给药组的血浆AngⅡ水平显著高于对照组(P<0.01)。
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表1 术后颈动脉血压、左室重量指数的变化(X±s,n=8)
项目
血压(kPa)
左室重量指数(mg/g)
对照组
手术组
给药组
对照组
手术组
给药组
3天
13.8±1.54
, 百拇医药
23.5±1.84*
23.5±1.69
2.02±0.07
2.22±0.06*
2.12±0.08☆
7天
16.4±1.56
28.0±1.63*
27.5±1.68
1.89±0.08
, 百拇医药
2.68±0.09*
2.46±0.07▲
14天
16.4±1.42
35.1±1.78*
26.4±1.53△
1.93±0.08
2.97±0.07*
1.99±0.06△
注：与对照组比较：*P<0.01；与手术组术后3天比较：☆P<0.05;与手术组术后7天比较：▲P<0.01；与手术组术后14天比较：△P<0.01表2 术后心肌组织AngⅡ水平ACE活性的变化(X±s,n=8)
, 百拇医药
项目
AngⅡ水平(pg/g.wet mass)
ACE活性(u/g.Wet mass)
对照组
手术组
给药组
对照组
手术组
给药组
3天
279±18.4
307±19.0*
, 百拇医药
316±18.7
53.8±11.3
76.4±11.8*
87.3±14.3
7天
281±17.7
322±17.3*
336±19.8
57.4±11.0
93.2±11.5*
108.4±13.3☆
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14天
277±18.8
356±13.9*
388±14.5△
57.7±12.1
117.4±11.5*
141.9±11.6△
注：与对照组比较：*P<0.01；与手术组术后7天比较：☆P<0.05;与手术组术后14天比较：△P<0.01
三、心肌组织TGF-β1的表达变化 手术组心肌细胞胞浆TGF-β1表达较对照组显著增加(P<0.01)，高峰在术后7天、14天时回到对照组水平；核表达术后显著减少(P<0.01)，14天时核表达阴性。给药组的胞浆表达较手术组显著下降(P<0.01)，核表达较手术组显著增加(P<0.01)，核表达阳性率由对照组的23%增加到43%，见表3。
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表3 术后心肌细胞TGF-β1表达变化(X±s,n=8)
项目
阳性信号指数
核表达阳性计数(个/视野)
对照组
手术组
给药组
对照组
手术组
给药组
3天
33.29±2.44
, 百拇医药
38.75±2.74*
36.59±2.66
9.4±1.1
5.4±1.1**
8.3±1.2☆
7天
33.56±2.39
55.75±3.02**
44.63±2.67▲
8.8±1.4
, 百拇医药 4.0±1.2**
12±1.2▲
14天
33.96±2.56
34.99±2.46
34.16±2.14
9.5±1.2
0**
17.5±1.2△
注：与对照组比较：*P<0.05；**P<0.01;与手术组术后3天比较：☆P<0.01;与手术组术后7天比较：▲P<0.01；与手术组术后14天比较：△P<0.01
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四、心肌组织的病理改变 手术组术后3天时心肌有点灶坏死，肌纤维断裂及明显的淋巴、单核细胞浸润；术后7天时这些病变呈多灶性分布，肌纤维增粗，核增大，形态不规则，核仁浓染；术后14天时有多灶肉芽肿形成，间质增生。给药组的上述病理改变明显减轻。
讨 论
在本实验中，我们应用小剂量Losartan在无明显降压条件下，左室重量指数显著下降，左室肥厚的病理改变明显减轻，说明Losartan能有效抑制左室肥厚，也更进一步证实左室肥厚与心肌局部的血管紧张素系统有关[3]。
TGF-β1是多功能调节因子，调节细胞的增殖、分化，参与胞外基质的合成及降解，与心脏的生长、发育、修复有关[4，5]。本实验结果表明，腹主动脉缩窄后，心肌局部的血管紧张素系统激活，TGF-β1在心肌细胞胞浆的表达明显增加，在胞核表达明显减少，左室肥厚的病理改变明显。应用小剂量血管紧张素ⅡⅠ型受体拮抗剂Losartan在无明显降压条件下，TGF-β1在胞浆的表达明显减少，在胞核的表达明显增加，左室肥厚被显著抑制。TGF-β1的这种表达变化说明其参与左室肥厚的发生、发展。在胞浆的表达可能促进肥厚，在胞核的表达可能抑制肥厚，且血管紧张素Ⅱ可能通过其Ⅰ型受体调控TGF-β1表达而致左室肥厚。
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唐兵(成都军区总医院 心内科 610083)
刘世玉(成都军区总医院 心内科 610083)
速晓华(成都军区总医院 心内科 610083)
肖东(成都军区总医院 心内科 610083)
褚桂珍(成都军区总医院 心内科 610083)
周兴文(成都军区总医院 心内科 610083)
参考文献
1，Kannel WB.Epidemiology and prevention of cardiac failure:Framingham study insights.Eur Heart J,1987,8:23～26.
, 百拇医药
2，Benazk M.Chenges in heart weight and blood pressure following aortic constriction in rats.Can J Biochem Physiol,1995,33:995～1002.
3，张琪，丁金风，任兵，等.心脏血管组织肾素血管紧张素系统在自发性高血压大鼠发病中的作用.中国高血压杂志，1994，2(1)：24～26.
4，Thompson NL,Flanders KC,Smith JM,et al.Expression of transforming growth factor-β1 in specific cells and tissues of adult and neonatal mice.J Cell Biol,1989,108:66～669.
5，Sharma HS,Wunsch M,Kandolf R.Angiogenesis by slow coronary artery occlusion in the pig heart:expression of different growth factors mRNA'S.J Moll Cell Cardiol,1989,21:S24., http://www.100md.com