细胞外La3+对内向整流钾通道(IRK1)的阻断作用

http://www.100md.com 《心肺血管病杂志》 2000年第4期

     细胞外La³⁺对内向整流钾通道(IRK1)的阻断作用

    谢安 臧益民 朱妙章

    摘 要 本文采用双微电极电压钳(TEV)法研究细胞外La³⁺对非洲爪蟾卵母细胞表达的内向整流钾通道(IRK1)的阻断作用。细胞外La³⁺浓度分别为0，0.1，0.3，1，3和10mmol/L，K⁺浓度为90mmol/L，可见La³⁺对IRK1的瞬间电流(施加电压后1.5ms)具有La³⁺浓度依赖性、时间依赖性和电压依赖性阻断作用；阻断剂La³⁺对IRK1的门控特性和外向电流几乎无影响作用；细胞外加La³⁺后反转电位没有变化，因而IRK1对之不通透。细胞外La³⁺在减少IRK1电导的同时增加IRK1的归一化电导。三级指数拟合的结果表明：拟合的时间常数不随La³⁺浓度的增减而增减，这表明细胞外La³⁺对IRK1的抑制作用可能通过了表面电荷机制或La³⁺在通道中的阻断位点在通道表面。因为La³⁺浓度较低时，阻断的效力与La³⁺浓度较高时的差异不大，所以La³⁺不会通过表面电荷机制进行IRK1阻断的，因此La³⁺是IRK1的一种快速开通道阻断剂，其阻断位点在通道表面。
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    关键词：La³⁺；内向整流钾通道；电压钳；爪蟾卵母细胞

    探讨La³⁺对IRK1的阻断作用不仅在三价阳离子对IRK1阻断的分子机制的研究中有重要意义，而且对于了解IRK1的通道结构和功能有很大帮助。以往的研究由于技术水平有限，对通道瞬间电流的分析不够准确(施加电压后10ms)^[1]，而且采用的数据分析方法也不够准确^[2]。已知La³⁺对IRK1的阻断作用主要表现在La³⁺可以加快IRK1内向电流的失活过程，尤其在失活的开始部分。本文使用高质量电流曲线对La³⁺的阻断作用做了较精确的评价，以其得出最准确的分析结论。

    材料与方法

    本文使用的IRK的cDNA(大鼠巨噬细胞系)是L.Y.Jan博士(加利福尼亚大学)赠与的。mRNA的线性化由XhoⅠ酶完成，转录过程使用mCAP^TMmRNA capping试剂盒(Stratagene Inc,La,Jolla,CA)，由T3聚合酶转录。mRNA的检测用凝胶电泳；其浓度测量用光谱仪，并于-80℃贮存。使用第Ⅴ和Ⅵ期的非州爪蟾卵母细胞；在无钙的Barth液中使用胶原酶Ⅰ(SIGMA，10mg/10ml)处理1.5h，温度20℃，用钠升注射器(Drummond Scientific)将mRNA(浓度：1.85ng/nl，注射30ng)注入细胞内；在正常带有抗菌素的Barth液中孵育24h后使用。
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    全细胞电流记录使用双微电极电压钳(TEV)法，放大器为CA-1B(Dagan Corp)。用2个有3M KCl的微电极刺入细胞中，一个(尖端电阻0.2～0.3MΩ)做为电流注射电极，另一个(尖端电阻约0.5MΩ)做为电压记录电极，2个电极尖端的形态特别重要，并且镀上Sylgard。第三个电极置于细胞1mm左右的距离用于感受细胞膜外的钳制电压。为了测量串联电阻，一个微电极置于细胞上前方约5μm处，串联电阻一般小于0.2KΩ，在需要的时候使用串联电阻补偿。使用一接地的金属板置于微电极之间以减少电容耦合干扰。另一个电流电极用于进行电容补偿，旋转三个时间常数和三个相位延迟可以很好地进行电容补偿。漏电流在分析数据时再除去。

    对照浴液中含有(mmol/L):90 KCl,5HEPES,3Mg,0.1 EGTA和0.2 Niflumic酸(用于阻断内源性Cl^-电流)，pH7.4。再使用氯化盐将对照浴液的游离La³⁺浓度加至0，0.1,0.3,1,3和10mmol/L。游离的La³⁺浓度的计算见文献3。
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    换浴液时连续灌流速率约2.5～3ml/min。接触电位用盐桥进行修正。电压波形由486计算机与Digi Data 1200(Axon Instruments)产生。电流滤波频率为2kHz，采样频率为10kHz，Data的获取由pCLAMP6(axon)完成。

    实验时室内温度为23～25℃。

    数据分析采用pCLAMP6,Excel 97与Origin完成。阳离子剂量依赖性阻断数据用下式拟合

    I/I₀=(1-U){1+[X]/K_d)}+U (1)

    其中I/I₀为阻断剂浓度为[X]时电流残留分数，K_d为平衡解离常数，U是在饱和的[X]时电流不可阻断的分数。

    对La³⁺阻断动力学分析是先采用三个指数函数的拟合
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    I=A₁e^-(t-k)/τ1+A₂e^-(t-k)/τ2+A₃e^-(t-k)/τ3 (2)

    其中τ为时间常数，最长的τ为阻断的时间常数，A为指数函数的权，K为进行拟合的起始时间。

    数据由X±s表示，每组数据例数为3例。

    结 果

    1.La³⁺对IRK1的阻断作用 细胞外La³⁺对外向电流几乎无作用；这时反转电位没有变化，因而IRK1对La³⁺不通透(图1上，下和图2)。La³⁺对IRK1的门控特性几乎没有影响，在减少IRK1电导的同时增加IRK1的归一化电导(图3)。La³⁺对IRK1瞬间内向电流有La³⁺浓度依赖性阻断作用(图2)，细胞外La³⁺浓度越大，IRK1电流越小；这种阻断也同时具有电压依赖性，膜电位越大，阻断越明显(图2)。
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    图1 La³⁺对IRK1有浓度依赖性阻断作用

    注：上图为未加La³⁺时的宏电流。下图为La³⁺浓度为10mmol/L时的IRK1电流。电压波宽为500ms，幅度从+40mV至-140mV，增量为-10mV，保持电压为-0mV

    图2 IRK1瞬间I-V曲线(电压加上1.5ms时)，数据为图1中电流

    2.La³⁺对IRK1的阻断机制 La³⁺几乎不影响IRK1的失活过程。加上不同浓度的La³⁺后，IRK1电流拟合的时间常数和权几乎不变(图4)；La³⁺浓度较低时，阻断的效力与La³⁺浓度较高时的差异不大(图5)。
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    图3 IRK1的电导和规一化的IRK1电导，数据为图1中电流

    讨 论

    内向整流钾通道(inward rectifier potassium channel 1,IRK1)广泛存在于骨骼肌细胞、心肌细胞、神经细胞、胶质细胞、血细胞和内皮细胞等，可维持细胞的静息电位和控制细胞的兴奋性。La³⁺对IRK1的阻断作用的研究对于La³⁺参与静息电位和细胞兴奋性的控制有一定的贡献。以往所取得的通道电流在电压加上几个ms后才能避开电容电流的影响，进而进行瞬间电流的分析；而且以往对通道电流进行的拟合也采用的是单指数函数的拟合，对La³⁺对瞬间内向电流的抑制作用不能很好地拟合^[1，2]。通过减小电流电极尖端阻抗，用Sylgard涂电极尖端等多方改进，我们得到了施加电压下1.5ms的高质量电流曲线，并用三个指数函数对电流曲线进行了准确的拟合，分析的准确性大大提高。
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    图4 拟合得出的阻断的时间常数和权，各曲线为公式(2)拟合得出的

    通过分析证实了La³⁺对IRK1的阻断不仅是La³⁺浓度和电压依赖性的，而且还是时间依赖性的。IRK1对La³⁺不通透，细胞外La³⁺可增加IRK1的归一化电导，La³⁺对IRK1的门控特性也无影响，细胞外La³⁺对外向电流几乎无作用。La³⁺几乎不影响IRK1的失活过程；加上不同浓度的La³⁺后，IRK1电流时间常数几乎不变，表明La³⁺对IRK1的阻断作用可能通过两种不同的机制。一是通过表面电荷机制进行IRK1阻断的^[4]，因为细胞外La³⁺在低浓度时对IRK1抑制作用的增加并不比高浓度时的增加强，所以这一作用机制几乎不存在^[5]；从而说明：La³⁺对IRK1阻断作用的机制是细胞外La³⁺是IRK1的一种快速开通道阻断剂^[6]，La³⁺在IRK1表面与K⁺竞争同一结合位点^[7]。
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    图5 细胞外K⁺浓度为90mmol/L时，La³⁺对IRK1有浓度依赖性阻断作用

    左图为浓度依赖性La³⁺阻断。曲线为公式(1)的拟合曲线，右图为电压依赖性平衡解离常数，由左图数据得出

    感谢日本国立生理学研究所的冈田泰伸教授提供资助并提供实验场所，感谢老木成念教授对本文工作的指导，感谢三轮晃子小姐，Ravshan Z.S.和名古屋大学的鱼助信之副教授在分子生物学技术上的帮助。感谢加尼弗尼亚大学的Lilly Y.J.教授提供的IRK1克隆。

    谢安(西安第四军医大学 基础部生理学教研室 710032)

    臧益民(西安第四军医大学 基础部生理学教研室 710032)

    朱妙章(西安第四军医大学 基础部生理学教研室 710032)
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    参考文献

    1，Kubo Y,Timothy J,Jan YN,et al.Primary structure and functional expression of a mouse inward rectifier potassium channel.Nature,1993,362(11):127～131.

    2，Ravshan ZS,Tominaga T,Miwa A,et al.A conserved arginine residue in the preregion of an inward rectifier K channel (IRK1) as an external barrier for cationic blockers.J Gen Physiol,1997,110:665～667.

    3，Oiki S,Yamamoto T,Okada Y.Apparent stability constants and purity of Cachelating agents evaluated using Ca-selective electrodes by the double-log optimization method.Cell Calcium,1994,15:209～216.
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    4，Block BM,Stacey WC.Jones SW.Surface charge and lanthanum block of calcium current in bullfrog sympathetic neurons.Biophysical Journal,1997,74:2278～2284.

    5，Mackinnon R.Latorre R,Miller C.Role of surface electrostatics in the operation of a high conductance Ca²⁺ activated K⁺ channel.Biochemistry,1989,28:8092～8099.

    6，Hill B.Ionic channels of excitable membranes.Sinauer Sunderland MA ed2,1992,350～361.

    7，Doyle DA,Cabra JM,Richard A,et al.The structure of the potassium channel:molecular Basis of K⁺ conduction and selectivity.Science,1998,280(3):69～74., 百拇医药(细胞外La3+对内向整流钾通道(IRK1)的阻断作用)

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