角膜缘干细胞移植的进展
角膜缘干细胞移植的进展
郭萍(综述) 谢立信 董晓光(审校)
关键词：角膜缘干细胞；细胞移植；细胞培养
角膜上皮的完整和无血管状态对维持角膜生理功能和透明性至关重要。各种致病因素造成反复上皮缺损、糜烂、溃疡、新生血管长入，导致假性胬肉形成。角膜上皮病变正成为角膜病主要致盲因素，其根本原因仍是角膜缘干细胞功能缺陷或数量不足。解决问题的根本方法是采用角膜缘含干细胞组织移植术重建角膜上皮。本文就近年来角膜缘移植方面的最新进展做一综述。
1 自体角膜缘干细胞移植
为了修复由于化学伤、热烧伤等引起的持续性角膜上皮缺损，Thoft[1]于1977年设计了自体结膜移植术，并取得一定疗效。然而角膜上皮细胞和结膜上皮细胞毕竟是2种不同源性细胞群，修复后的角膜表面为结膜细胞表型，生化和生理特点不同于角膜细胞表型，细胞粘附不牢，容易脱落，因而角膜透明性也受到影响。随着角膜缘干细胞理论的建立和发展[2-4]，结膜上皮移植术逐渐被角膜缘移植术所代替。现代角膜缘移植术的理论是1989年Kenyon等[5]在总结Thoft结膜移植术经验的基础上提出来的，该手术是将自体健眼包括角膜缘含干细胞组织在内的球结膜片移植到患者受损的角膜缘部，术后取得良好效果。Tsai等[6]通过实验表明：在促进眼表面愈合、减少角膜新生血管长入和假性胬肉形成方面，角膜缘移植明显优于球结膜移植，这进一步证明角膜缘移植的有效性。自体移植不存在免疫排斥，成功率高，日益成为临床上一种成熟的手术方式。但是对于双眼伤患者或相对健康眼实则为亚临床状态的患者，自体健眼干细胞移植将造成唯一有用眼视力不可逆的下降[7，8]，这是大多数患者难以接受以及临床医师所禁忌的。自体角膜缘干细胞移植适应证的限制迫使人们寻取另外的方法，因此注意力转移到异体角膜缘干细胞移植上。
, 百拇医药
2 同种异体角膜缘干细胞移植
Tsai等[6]报道了应用同种异体角膜缘移植获得成功的病例：16只眼随访6～25mo，13只眼视力增进，10只眼上皮迅速愈合，12只眼角膜血管消失。这组患者术前和术后都适当应用免疫抑制剂，无1例发生急性排斥。Tan等[8]在异体角膜缘移植报道，术前术后适当使用免疫抑制剂，9例患者有7例早期即获得稳定的眼表面，视力部分恢复以及症状减轻。平均随访14.7mo，有1例在早期停用激素后发生急性排斥，另1例因细菌感染而移植失败。Coster等[9]报道了5例异体干细胞移植行眼表面重建的病例，术后随访7～29mo均收到良好的效果。稳定的眼表面，持续性的上皮完整性，新生血管的消退，患者症状的消失，以及部分患者有用视力的恢复都证明了这种方法的可靠性。然而角膜缘丰富的血管和淋巴细胞，使角膜缘不再是免疫赫免区；角膜缘部密集的郎格罕细胞可以把异体抗原提呈给T淋巴细胞，同时又增强了干细胞表面HLA-Ⅱ类抗原的表达，所以角膜缘为免疫排斥的高危区域，免疫排斥仍是异体角膜缘移植面临的最大难题。William等[10]曾用DNA多形态性和PCR技术对异体角膜缘组织移植术后患者角膜上皮进行检测：术后12wk周边角膜检测不到异体源性上皮，而仅中央可检测到供体上皮；术后20wk时，周边部和中央部都检测不到异体源性上皮，意味着可能是排斥反应引起的异体干细胞的死亡。异体干细胞移植片的命运令人担忧；异体干细胞能否存活，存活多长时间，何为干细胞的排斥反应，如何监控这种排斥反应，以及术前术后如何合理使用免疫抑制剂，通过何种方法降低异体干细胞移植排斥反应的发生率等一系列问题，都是大家所关注的问题，要求异体角膜缘干细胞移植有较长一段时间的随访观察。
, 百拇医药
李群等报道：成人角膜HLA-DR抗原主要分布于角膜下及其基质深层，且HLA-DR抗原在角膜移植排斥反应中起主要作用，故HLA-DR抗原在角膜缘上皮移植中的作用尤其重要，为了进一步降低异体角膜缘移植排斥反应的发生率，可试用HLA-DR抗原相同或相近的异体间移植。Kenyon等[11]第一次描述了用亲属间HLA-DR抗原相同或相近的角膜缘干细胞行异体干细胞的移植。结果8人中6人视力增加，其中5人视力≥20/80，另外2人视力无改善，同期或2次有4个人行LKP或PKP；8人中有6人有持续性的眼表面稳定性。这一研究无疑为异体干细胞的移植带来了曙光。HLA-DR相近的异体干细胞间的移植降低了免疫排斥的发生率，不失为有前途的研究方向，但毕竟仍是同种异体间的移植，不可避免地存在着一定的排斥反应。是否有另外的方法既能解决自体干细胞来源有限的问题，又避免了异体间移植的排斥，人们的注意力转移到自体干细胞的培养和移植上。
3 自体角膜缘干细胞培养和移植
, 百拇医药 Lindberg等[12]的实验中，取1mm×1mm大小含角膜缘干细胞组织，用组织培养法获得角膜上皮融合单细胞层，成功地移植到裸鼠皮下，4d内移植上皮形成5～6层较原始角膜上皮细胞，并牢固地粘附在植床上。用免疫组化方法证明，培养的细胞能够产生正常基底膜所具有的胶原蛋白Ⅵ型和Ⅶ型以及层粘连蛋白。Pellaegrini等[13]和Tsubota[14]报道了2例完全角膜缘干细胞缺乏患者，用自体健眼角膜缘干细胞培养后形成的细胞层移植到患眼角膜表面，成功实现眼表面重建。它是以软性接触镜为载体，将培养后分成2～3层原代自体上皮细胞放在去除新生血管膜的受眼上，术后2a仍有持续性上皮完整性。印迹细胞学表明上皮细胞的角膜表型。其中1例患者，术后4mo 2次行PKP术，随访16mo无改变。征得患者同意的前提下，取活检行组织学检查，结果在囊样的基底膜上可见分层的鳞状上皮，AE-5单抗染色阳性，这与正常角膜无明显差别。这意味着自体角膜缘组织培养后移植成功。Tsai等[15]将3例患者自体角膜缘干细胞培养到羊膜载体上进行自体患眼眼表移植，术后观察4mo可见角膜上皮完整性以及新生血管消退，这吸引眼科医师进行大量这方面的临床和试验研究。
, 百拇医药
这种方法仅需用1mm×1mm角膜缘组织块培养后移植，既解决了异体间移植的排斥反应，同时又培养出足够多供移植的细胞层，并通过一定的保存手段，如冷冻或湿房，储存以备后用，解决了自体干细胞来源受限的问题，这将成为角膜缘移植较理想和有前途的一种方法。
4 展望
角膜缘干细胞培养后移植尚处于实验研究阶段，其中自体角膜缘干细胞培养后移植已初步获得成功，然而这种移植术后上皮眼表贴附移行的能力、上皮分化、细胞的存活及术后上皮功能、特性的检测都尚待进一步研究。对没有任何自体角膜缘干细胞来源双眼伤患者可否行同种异体角膜缘干细胞培养后移植?是否通过培养角膜缘干细胞的抗原性可能发生改变从而可以降低排斥反应的发生率呢?这将是最有前途和最有吸引力的发展方向。
作者单位：郭萍(山东省医学科学院眼科研究所 山东省青岛市，266071)
谢立信(山东省医学科学院眼科研究所 山东省青岛市，266071)
, 百拇医药
董晓光(山东省医学科学院眼科研究所 山东省青岛市，266071)
参考文献
1，Thoft RA. Conjuntival transplantation[J]. Arch Ophthalmol 1977;95∶1425-1427.
2，Schermer A,Galvin S,Sun TT.Differentiation-related expression of a major 64k corneal keratin in vivo and in culture suggests limal location of cornea epithelial stem cells[J]. J Cell Biol l986;103∶49-62.
3，Cotsarelis G, Cheng SZ, Dong G, et al. Existence of stem-cycling limal epithelial basal cells that can be preferentially stimulated to proliferate：Implications on epithelial stem cells[J]. Cell 1989;57∶201-209.
, 百拇医药
4，Huang AJW, Tseng SCG. Corneal epithelial wound healing in the absence of limal epithelial[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci 1991;32∶96-105.
5，Kenyon KR,Tseng SCG.Limal autograft transplantation for ocular surface disorders[J]. Ophthalmology 1986;96∶709-723.
6，Tsai RJF, Tseng SCG. Human allograft limal transplantation of corneal surface reconstructions[J]. Cornea 1994;13∶389-340.
7，Jenkins C, Tuft S, Liu C, et al. Limal transplantation in the management of chronic contact lens-associated epitheliopathy[J]. Eye 1993;7∶629-633.
, 百拇医药
8，Tan DTH, FRCS, FRCOphth, et al. Limal transplantation[J]. Ophthalmology 1996;103∶29-36.
9，Coster DJ, Aggarwal RK, Williams KA. Surgical management of ocular surface disorders using conjuntival and stem cell allograft[J]. Br J Ophthalmol 1995;79∶977-982.
10，Williams KA, Brerton HM, Arrarwal R, et al. Use of DNA polymorphisms and the polymerase chain reaction to examine the survival of a human limal stem cell allograft[J]. Am J Ophthalmol 1995;120∶342-350.
, 百拇医药
11，Kenyon KR, Rapoza PA. Limal allograft transplantation for ocular surface disorders[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci 1990;31∶1301-1314.
12，Lindberg KL, Brown MZ, Chaves HV, et al. In vitro propagation of human ocular surface epithelial cells for transplantation[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci 1993;34∶2672-2679.
13，Pellegrini G, Traverso CE, Franzi AT, et al. Long-term restoration of damaged corneal surface with autologous cultivated corneal epithelium[J]. Lancet 1997;349∶990-993.
14，Tsubota K. Corneal epithelial stem cell transplantation[J]. Lancet 1997;349∶1556.
15，Tsai RJF. Corneal reconstruction by ammiotic membrane with cultivated autologous limbo-corneal epithelium[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci 1998;39(4)∶s429., 百拇医药
郭萍(综述) 谢立信 董晓光(审校)
关键词：角膜缘干细胞；细胞移植；细胞培养
角膜上皮的完整和无血管状态对维持角膜生理功能和透明性至关重要。各种致病因素造成反复上皮缺损、糜烂、溃疡、新生血管长入，导致假性胬肉形成。角膜上皮病变正成为角膜病主要致盲因素，其根本原因仍是角膜缘干细胞功能缺陷或数量不足。解决问题的根本方法是采用角膜缘含干细胞组织移植术重建角膜上皮。本文就近年来角膜缘移植方面的最新进展做一综述。
1 自体角膜缘干细胞移植
为了修复由于化学伤、热烧伤等引起的持续性角膜上皮缺损，Thoft[1]于1977年设计了自体结膜移植术，并取得一定疗效。然而角膜上皮细胞和结膜上皮细胞毕竟是2种不同源性细胞群，修复后的角膜表面为结膜细胞表型，生化和生理特点不同于角膜细胞表型，细胞粘附不牢，容易脱落，因而角膜透明性也受到影响。随着角膜缘干细胞理论的建立和发展[2-4]，结膜上皮移植术逐渐被角膜缘移植术所代替。现代角膜缘移植术的理论是1989年Kenyon等[5]在总结Thoft结膜移植术经验的基础上提出来的，该手术是将自体健眼包括角膜缘含干细胞组织在内的球结膜片移植到患者受损的角膜缘部，术后取得良好效果。Tsai等[6]通过实验表明：在促进眼表面愈合、减少角膜新生血管长入和假性胬肉形成方面，角膜缘移植明显优于球结膜移植，这进一步证明角膜缘移植的有效性。自体移植不存在免疫排斥，成功率高，日益成为临床上一种成熟的手术方式。但是对于双眼伤患者或相对健康眼实则为亚临床状态的患者，自体健眼干细胞移植将造成唯一有用眼视力不可逆的下降[7，8]，这是大多数患者难以接受以及临床医师所禁忌的。自体角膜缘干细胞移植适应证的限制迫使人们寻取另外的方法，因此注意力转移到异体角膜缘干细胞移植上。
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2 同种异体角膜缘干细胞移植
Tsai等[6]报道了应用同种异体角膜缘移植获得成功的病例：16只眼随访6～25mo，13只眼视力增进，10只眼上皮迅速愈合，12只眼角膜血管消失。这组患者术前和术后都适当应用免疫抑制剂，无1例发生急性排斥。Tan等[8]在异体角膜缘移植报道，术前术后适当使用免疫抑制剂，9例患者有7例早期即获得稳定的眼表面，视力部分恢复以及症状减轻。平均随访14.7mo，有1例在早期停用激素后发生急性排斥，另1例因细菌感染而移植失败。Coster等[9]报道了5例异体干细胞移植行眼表面重建的病例，术后随访7～29mo均收到良好的效果。稳定的眼表面，持续性的上皮完整性，新生血管的消退，患者症状的消失，以及部分患者有用视力的恢复都证明了这种方法的可靠性。然而角膜缘丰富的血管和淋巴细胞，使角膜缘不再是免疫赫免区；角膜缘部密集的郎格罕细胞可以把异体抗原提呈给T淋巴细胞，同时又增强了干细胞表面HLA-Ⅱ类抗原的表达，所以角膜缘为免疫排斥的高危区域，免疫排斥仍是异体角膜缘移植面临的最大难题。William等[10]曾用DNA多形态性和PCR技术对异体角膜缘组织移植术后患者角膜上皮进行检测：术后12wk周边角膜检测不到异体源性上皮，而仅中央可检测到供体上皮；术后20wk时，周边部和中央部都检测不到异体源性上皮，意味着可能是排斥反应引起的异体干细胞的死亡。异体干细胞移植片的命运令人担忧；异体干细胞能否存活，存活多长时间，何为干细胞的排斥反应，如何监控这种排斥反应，以及术前术后如何合理使用免疫抑制剂，通过何种方法降低异体干细胞移植排斥反应的发生率等一系列问题，都是大家所关注的问题，要求异体角膜缘干细胞移植有较长一段时间的随访观察。
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李群等报道：成人角膜HLA-DR抗原主要分布于角膜下及其基质深层，且HLA-DR抗原在角膜移植排斥反应中起主要作用，故HLA-DR抗原在角膜缘上皮移植中的作用尤其重要，为了进一步降低异体角膜缘移植排斥反应的发生率，可试用HLA-DR抗原相同或相近的异体间移植。Kenyon等[11]第一次描述了用亲属间HLA-DR抗原相同或相近的角膜缘干细胞行异体干细胞的移植。结果8人中6人视力增加，其中5人视力≥20/80，另外2人视力无改善，同期或2次有4个人行LKP或PKP；8人中有6人有持续性的眼表面稳定性。这一研究无疑为异体干细胞的移植带来了曙光。HLA-DR相近的异体干细胞间的移植降低了免疫排斥的发生率，不失为有前途的研究方向，但毕竟仍是同种异体间的移植，不可避免地存在着一定的排斥反应。是否有另外的方法既能解决自体干细胞来源有限的问题，又避免了异体间移植的排斥，人们的注意力转移到自体干细胞的培养和移植上。
3 自体角膜缘干细胞培养和移植
, 百拇医药 Lindberg等[12]的实验中，取1mm×1mm大小含角膜缘干细胞组织，用组织培养法获得角膜上皮融合单细胞层，成功地移植到裸鼠皮下，4d内移植上皮形成5～6层较原始角膜上皮细胞，并牢固地粘附在植床上。用免疫组化方法证明，培养的细胞能够产生正常基底膜所具有的胶原蛋白Ⅵ型和Ⅶ型以及层粘连蛋白。Pellaegrini等[13]和Tsubota[14]报道了2例完全角膜缘干细胞缺乏患者，用自体健眼角膜缘干细胞培养后形成的细胞层移植到患眼角膜表面，成功实现眼表面重建。它是以软性接触镜为载体，将培养后分成2～3层原代自体上皮细胞放在去除新生血管膜的受眼上，术后2a仍有持续性上皮完整性。印迹细胞学表明上皮细胞的角膜表型。其中1例患者，术后4mo 2次行PKP术，随访16mo无改变。征得患者同意的前提下，取活检行组织学检查，结果在囊样的基底膜上可见分层的鳞状上皮，AE-5单抗染色阳性，这与正常角膜无明显差别。这意味着自体角膜缘组织培养后移植成功。Tsai等[15]将3例患者自体角膜缘干细胞培养到羊膜载体上进行自体患眼眼表移植，术后观察4mo可见角膜上皮完整性以及新生血管消退，这吸引眼科医师进行大量这方面的临床和试验研究。
, 百拇医药
这种方法仅需用1mm×1mm角膜缘组织块培养后移植，既解决了异体间移植的排斥反应，同时又培养出足够多供移植的细胞层，并通过一定的保存手段，如冷冻或湿房，储存以备后用，解决了自体干细胞来源受限的问题，这将成为角膜缘移植较理想和有前途的一种方法。
4 展望
角膜缘干细胞培养后移植尚处于实验研究阶段，其中自体角膜缘干细胞培养后移植已初步获得成功，然而这种移植术后上皮眼表贴附移行的能力、上皮分化、细胞的存活及术后上皮功能、特性的检测都尚待进一步研究。对没有任何自体角膜缘干细胞来源双眼伤患者可否行同种异体角膜缘干细胞培养后移植?是否通过培养角膜缘干细胞的抗原性可能发生改变从而可以降低排斥反应的发生率呢?这将是最有前途和最有吸引力的发展方向。
作者单位：郭萍(山东省医学科学院眼科研究所 山东省青岛市，266071)
谢立信(山东省医学科学院眼科研究所 山东省青岛市，266071)
, 百拇医药
董晓光(山东省医学科学院眼科研究所 山东省青岛市，266071)
参考文献
1，Thoft RA. Conjuntival transplantation[J]. Arch Ophthalmol 1977;95∶1425-1427.
2，Schermer A,Galvin S,Sun TT.Differentiation-related expression of a major 64k corneal keratin in vivo and in culture suggests limal location of cornea epithelial stem cells[J]. J Cell Biol l986;103∶49-62.
3，Cotsarelis G, Cheng SZ, Dong G, et al. Existence of stem-cycling limal epithelial basal cells that can be preferentially stimulated to proliferate：Implications on epithelial stem cells[J]. Cell 1989;57∶201-209.
, 百拇医药
4，Huang AJW, Tseng SCG. Corneal epithelial wound healing in the absence of limal epithelial[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci 1991;32∶96-105.
5，Kenyon KR,Tseng SCG.Limal autograft transplantation for ocular surface disorders[J]. Ophthalmology 1986;96∶709-723.
6，Tsai RJF, Tseng SCG. Human allograft limal transplantation of corneal surface reconstructions[J]. Cornea 1994;13∶389-340.
7，Jenkins C, Tuft S, Liu C, et al. Limal transplantation in the management of chronic contact lens-associated epitheliopathy[J]. Eye 1993;7∶629-633.
, 百拇医药
8，Tan DTH, FRCS, FRCOphth, et al. Limal transplantation[J]. Ophthalmology 1996;103∶29-36.
9，Coster DJ, Aggarwal RK, Williams KA. Surgical management of ocular surface disorders using conjuntival and stem cell allograft[J]. Br J Ophthalmol 1995;79∶977-982.
10，Williams KA, Brerton HM, Arrarwal R, et al. Use of DNA polymorphisms and the polymerase chain reaction to examine the survival of a human limal stem cell allograft[J]. Am J Ophthalmol 1995;120∶342-350.
, 百拇医药
11，Kenyon KR, Rapoza PA. Limal allograft transplantation for ocular surface disorders[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci 1990;31∶1301-1314.
12，Lindberg KL, Brown MZ, Chaves HV, et al. In vitro propagation of human ocular surface epithelial cells for transplantation[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci 1993;34∶2672-2679.
13，Pellegrini G, Traverso CE, Franzi AT, et al. Long-term restoration of damaged corneal surface with autologous cultivated corneal epithelium[J]. Lancet 1997;349∶990-993.
14，Tsubota K. Corneal epithelial stem cell transplantation[J]. Lancet 1997;349∶1556.
15，Tsai RJF. Corneal reconstruction by ammiotic membrane with cultivated autologous limbo-corneal epithelium[J]. Invest Ophthalmol Vis Sci 1998;39(4)∶s429., 百拇医药