三种不同波长激光猴眼小梁成形术的组织学观察和比较
三种不同波长激光猴眼小梁成形术的组织学观察和比较
孙静芬 叶纹 钟一声 王康孙
摘 要 目的 研究激光小梁成形术机理，进一步推广其在临床的应用。方法 对氩激光、倍频Nd：YAG激光、半导体激光小梁成形术后10d、1mo、6mo的猴眼房角进行组织学观察和比较。结果 激光小梁成形术后光凝区的小梁被破坏，前房侧小梁表面 出现一从角膜内皮细胞延伸过来的细胞层。三种波长激光都能有效地进行小梁成形术，其中半导体激光所造成的损伤较其他2种大。结论 房水流出阻力下降，房水流出量的增加可能与光凝区前房侧小梁网表面的细胞层和非光凝区小梁间隙增大、Schlemm管扩张有关。
关键词：原发性开角型青光眼；氩激光；半导体激光；倍频Nd:YAG激光；激光小梁成形术；组织病理学
, 百拇医药
激光小梁成形术治疗原发性开角型青光眼的临床疗效已得到众多作者的证实，而且得到广泛应用，成为治疗早期原发性开角型青光眼的方法之一。许多学者对其降眼压机制进行过研究[1]，但至今尚未完全明确。本实验应用了不同的激光器对激光小梁成形术后组织学变化进行观察比较，试图解释激光小梁成形术可能的降压机理。
1 材料和方法
1.1 材料 (1)实验动物：成年健康恒河猴4只，雄性，体重约6kg。由西普尔-必凯实验动物公司提供；(2)仪器设备：半导体激光器(OculightTMSIX,Iris medical Instrumen
ts,Inc.USA)、氩激光器(Ultina,2000.Coherent,Inc.USA)、“532”激光(Ophthalas“532”，Alcon Surgical,Inc.USA)。
, 百拇医药
1.2 方法
1.2.1 按每公斤体重1～2mg肌注氯氨酮，将猴全身麻醉后进行激光小梁成形术。1号、2号猴双眼上方180°房角半导体激光照射，下方180°房角“532”激光照射。3号猴双眼下方、4号猴右眼下方180°房角均做氩激光照射。4号猴左眼未做照射，留作对照。参数：氩激光：平均功率0.85W,曝光时间0.1s，光斑直径50μm；“532”激光：平均功率0.9W，曝光时间0.1s,光斑直径50μm；半导体激光：平均功率1.0W，曝光时间0.2～0.3s，光斑直径75μm。点数：上下房角各50点。击射部位：前部无色素小梁和后部色素小梁交界处。局部组织反应：小梁变苍白或有小气泡产生。
1.2.2 术后10d、1mo、6mo，将猴全麻后分别摘出眼球。摘出前在12点、6点子午线，角巩缘后4mm处做一缝线标记。把摘出的眼球分别沿3～9点子午线和12～6点子午线切成4个象限，分别浸泡于福尔马林、戊二醛溶液中。按常规进行切片、染色、镜下观察、照相。
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2 结果
2.1 光镜检查 正常猴眼房角可见房角开放、Schlemm管开放。小梁从前房到Schlemm管之间的宽度较窄。非功能性小梁比例较小，基本上属于功能性小梁。激光小梁成形术后10d，3种波长激光小梁成形术后10d均可见光凝处小梁间隙变窄，胶原纤维断裂、融合或排列紊乱(图1)。激光小梁成形术后1mo，3种波长激光光凝处小梁前房侧有一从角膜内皮细胞延伸过来的单细胞层覆盖小梁网，部分遮挡了小梁网。小梁间隙无扩大。激光小梁成形术后6mo，小梁间隙变窄，胶原纤维融合。仍可见从角膜内皮细胞延伸过来的单细胞层覆盖在前房侧小梁网(图2)。
Figure 1 The anterior chamber angle of argon laser
, 百拇医药
trabeculoplasty for photocoagulation 10 days.
The arrow indicated the collagen fusion(20×)
氩激光小梁成形术后10d的猴眼房角，箭头所指为胶原融合(20×).
Figure 2 The anterior chamber angle of “532” laser trabeculoplasty for
photocoagulation 6 months.The arrow indicated the extended cellular sheet(40×).
, 百拇医药
“532”激光小梁成形术后6mo的猴眼房角，箭头所指为单细胞层(40×).
非光凝区的小梁网(术后10d)：小梁间隙增大，胶原纤维排列整齐，Schlemm管轻度扩张。
2.2 电镜检查 正常猴眼小梁由基质、胶原纤维、弹性纤维和内皮细胞组成。中心为胶原纤维，埋于均匀基质中。胶原纤维间有少量弹性纤维。小梁网的表面覆盖一层内皮细胞。内皮细胞宽而扁平，有突起，有的突起很长，与相邻细胞连接成单层网状。内皮细胞中含有丰富的膜样细胞器。
激光小梁成形术后6mo：一部分小梁组织和细胞结构正常，但也有一些变性和坏死。3种波长激光光凝后电镜所见如下：(1)氩激光：胶原纤维排列紊乱，有变性和轻度肿胀。部分细胞浆内线粒体空泡样变，细胞间隙变窄(图3);(2)“532”激光：胶原纤维肿胀、变性、融合成电子密度较高的团块。有的细胞线粒体肿胀、空泡样变；(3)半导体激光：胶原纤维排列紊乱、变性、融合。黑色素变性，形成电子密度很高的短棒状物质，并且被上皮细胞吞噬。有的上皮细胞内的线粒体空泡样变，甚至细胞坏死(图4)。
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Figure 3 The disorder arrangement of the collagenous fibers with denaturing and
lightly swelling.Parts of chondriosomes in the cytoplasm are vacuolsted degeneration(4 000×)
胶原纤维排列紊乱，有变性和轻度肿胀，部分细胞浆内线粒体空泡样变，细胞间隙变窄(4 000×).
Figure 4 Melanotic denatination,formed the short stick structure
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with a higher electronic density,which have been engulfed
by the epithelial cells(8 000×)
黑色素变性，形成电子密度很高的短棒状物质，并且被上皮细胞吞噬(8 000×).
3 讨论
3.1 3种激光小梁成形术后小梁组织学变化 本研究采用恒河猴眼，其小梁较人眼短而粗，虽然与人眼有些差别，但与人眼小梁有相似的超微结构。
光凝后10d的小梁组织，在光镜标本中发现3种波长激光照射后均有Schlemm管的扩张，小梁间隙变窄，胶原断裂、融合或排列紊乱。此时已没有明显的炎症反应。光凝后1mo，3种波长激光光凝处小梁前房侧有一从角膜内皮细胞延伸过来的单细胞层，覆盖前房侧小梁网，部分遮盖了小梁网。Merlyn等[1]在术后晚期观察到这一细胞层，并用透射电镜进一步观察和分析，认为这是一种不寻常的角膜内皮细胞或小梁内皮细胞。Shlomo等[2]也在术后1mo观察到这一细胞层。本实验术后3mo仍能观察到这一细胞层。Bylsma等[3]用放射自显影技术，发现光凝小梁后，许氏线附近的小梁干细胞发生分裂增殖，向光凝区移行，这些分裂增殖的细胞具有正常小梁组织细胞的功能，如吞噬，产生细胞外基质，维持适宜的房水外流阻力等。这一细胞层可能与此有关。
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3.2 激光小梁成形术可能的机理 激光小梁成形术的机理目前还不十分清楚。有几种学说，Wise和Witter[4]提出机械效应学说，认为激光热效应使小梁纤维板层收缩，加宽了小梁间隙，同时打开了Schlemm管。Brancato等[5]也持这种观点。De Concini等[6]在给一位开角型青光眼患者做了180°激光小梁成形术后不久，发现该眼脉络膜恶性黑色素瘤，做了眼球摘除，用显微尺测量了小梁间隙宽度、Schlemm管的管径，并和同一眼的未做治疗部分对照，证明了这个机械学说。Acott等[7]提出生物学学说，认为激光刺激了细胞的分裂和移行，修复了细胞外基质，复原了小梁结构。这些分裂增殖的细胞具有正常小梁组织细胞的功能，如吞噬、产生细胞外基质、维持适宜的房水外流阻力等。此外还有体液学说，认为激光小梁成形术后，小梁组织发生炎症反应，生成前列腺素增加[8]，前列腺素有较强的降眼压作用。本实验发现术后在非光凝区小梁间隙增大，Schlemm管扩张，而不是在光凝区。在光凝区，小梁网遭到破坏，出现不同程度的胶原断裂、排列紊乱、小梁间隙变窄。术后6mo的透射电镜检查仍发现变性和破坏，说明激光损害是不可逆的。所以小梁成形术后房水流畅系数的提高，不可能在光凝区得到，只能在非光凝区得到。可能通过：(1)非光凝区小梁网间隙增加，Schlemm管扩张，其代偿功能超过了小梁成形术造成的光凝区的小梁网的损失；(2)受激光刺激后分裂增殖的小梁干细胞参与了非光凝区小梁结构的重建，并发挥了正常小梁组织的功能。
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在半导体激光术后6mo，黑色素形成电子密度很高的短棒状物质，并被上皮细胞吞噬，这可能与半导体激光的黑色素吸收率低、波长较长、穿透性强、引起的损伤较深有关。
基金项目：上海市科委科研基金资助(编号974119013)
作者简介：孙静芬，女，1967年9月出生，上海市人，汉族。1991年毕业于上海第二医科大学，获医学学士学位；1999年上海第二医科大学硕士毕业。在读硕士研究生期间1996年和1997年在法国巴黎Cochin医院眼科任住院医师。现任上海第二医科大学附属瑞金医院眼科主治医师。主要从事青光眼的基础和临床研究，并在激光治疗青光眼和眼底病方面有特长。
作者单位：孙静芬(上海第二医科大学附属瑞金医院眼科 200025)
叶纹(上海第二医科大学附属瑞金医院眼科 200025)
, 百拇医药
钟一声(上海第二医科大学附属瑞金医院眼科 200025)
王康孙(上海第二医科大学附属瑞金医院眼科 200025)
参考文献
1，Merlyn M,Rodrigue MM,Georgel L,et al.Electron microscopy of Argon laser therapy in phakic open angle glaucoma[J].Ophthalmology 1982;83(3)∶198-210.
2，Shlomo M,Jean Pei,David L,et al.Delayed response to argon laser trabeculoplasty in monkeys morphological and morphometric analysis[J].Acta Ophthalmol 1986;104(7)∶1078-1083.
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3，Bylsma SB,Samples JR,Acott TS,et al.Trabecular cell division after Argon laser trabeculoplasty[J].Acta Ophthalmol 1988;106∶544-547.
4，Wise JB,Witter SL.Argon laser therapy for open angle glaucoma:A pilot study [J].Arch Ophthalmol 1979;97∶319-322.
5，Brancato R,Menchini U,Pece A,et al.Aspects microscopigues de l'angle camerulaire humain apres photocoagulation au laser a l'argon[J].Men Soc Fr Ophthalmol 1981;93∶109-113.
, 百拇医药
6，De Concini M,Boi S,Detassis C.Microscopical study of trabeculum after laser cyclotrabeculospasis case report[J].Pathologica 1993;85(1099)∶563-567.
7，Acott TS,Samples JS,Bradley JM,et al.Trabecular repopulaion by anterior trabecular meshwork cells after laser trabeculoplasy[J].Am J Ophthalmol 1989;107∶1-6.
8，Coaks R,Laser trabeculoplasty[J].Br J Ophthalmol 1992;76∶624-626., 百拇医药
孙静芬 叶纹 钟一声 王康孙
摘 要 目的 研究激光小梁成形术机理，进一步推广其在临床的应用。方法 对氩激光、倍频Nd：YAG激光、半导体激光小梁成形术后10d、1mo、6mo的猴眼房角进行组织学观察和比较。结果 激光小梁成形术后光凝区的小梁被破坏，前房侧小梁表面 出现一从角膜内皮细胞延伸过来的细胞层。三种波长激光都能有效地进行小梁成形术，其中半导体激光所造成的损伤较其他2种大。结论 房水流出阻力下降，房水流出量的增加可能与光凝区前房侧小梁网表面的细胞层和非光凝区小梁间隙增大、Schlemm管扩张有关。
关键词：原发性开角型青光眼；氩激光；半导体激光；倍频Nd:YAG激光；激光小梁成形术；组织病理学
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激光小梁成形术治疗原发性开角型青光眼的临床疗效已得到众多作者的证实，而且得到广泛应用，成为治疗早期原发性开角型青光眼的方法之一。许多学者对其降眼压机制进行过研究[1]，但至今尚未完全明确。本实验应用了不同的激光器对激光小梁成形术后组织学变化进行观察比较，试图解释激光小梁成形术可能的降压机理。
1 材料和方法
1.1 材料 (1)实验动物：成年健康恒河猴4只，雄性，体重约6kg。由西普尔-必凯实验动物公司提供；(2)仪器设备：半导体激光器(OculightTMSIX,Iris medical Instrumen
ts,Inc.USA)、氩激光器(Ultina,2000.Coherent,Inc.USA)、“532”激光(Ophthalas“532”，Alcon Surgical,Inc.USA)。
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1.2 方法
1.2.1 按每公斤体重1～2mg肌注氯氨酮，将猴全身麻醉后进行激光小梁成形术。1号、2号猴双眼上方180°房角半导体激光照射，下方180°房角“532”激光照射。3号猴双眼下方、4号猴右眼下方180°房角均做氩激光照射。4号猴左眼未做照射，留作对照。参数：氩激光：平均功率0.85W,曝光时间0.1s，光斑直径50μm；“532”激光：平均功率0.9W，曝光时间0.1s,光斑直径50μm；半导体激光：平均功率1.0W，曝光时间0.2～0.3s，光斑直径75μm。点数：上下房角各50点。击射部位：前部无色素小梁和后部色素小梁交界处。局部组织反应：小梁变苍白或有小气泡产生。
1.2.2 术后10d、1mo、6mo，将猴全麻后分别摘出眼球。摘出前在12点、6点子午线，角巩缘后4mm处做一缝线标记。把摘出的眼球分别沿3～9点子午线和12～6点子午线切成4个象限，分别浸泡于福尔马林、戊二醛溶液中。按常规进行切片、染色、镜下观察、照相。
, http://www.100md.com
2 结果
2.1 光镜检查 正常猴眼房角可见房角开放、Schlemm管开放。小梁从前房到Schlemm管之间的宽度较窄。非功能性小梁比例较小，基本上属于功能性小梁。激光小梁成形术后10d，3种波长激光小梁成形术后10d均可见光凝处小梁间隙变窄，胶原纤维断裂、融合或排列紊乱(图1)。激光小梁成形术后1mo，3种波长激光光凝处小梁前房侧有一从角膜内皮细胞延伸过来的单细胞层覆盖小梁网，部分遮挡了小梁网。小梁间隙无扩大。激光小梁成形术后6mo，小梁间隙变窄，胶原纤维融合。仍可见从角膜内皮细胞延伸过来的单细胞层覆盖在前房侧小梁网(图2)。
Figure 1 The anterior chamber angle of argon laser
, 百拇医药
trabeculoplasty for photocoagulation 10 days.
The arrow indicated the collagen fusion(20×)
氩激光小梁成形术后10d的猴眼房角，箭头所指为胶原融合(20×).
Figure 2 The anterior chamber angle of “532” laser trabeculoplasty for
photocoagulation 6 months.The arrow indicated the extended cellular sheet(40×).
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“532”激光小梁成形术后6mo的猴眼房角，箭头所指为单细胞层(40×).
非光凝区的小梁网(术后10d)：小梁间隙增大，胶原纤维排列整齐，Schlemm管轻度扩张。
2.2 电镜检查 正常猴眼小梁由基质、胶原纤维、弹性纤维和内皮细胞组成。中心为胶原纤维，埋于均匀基质中。胶原纤维间有少量弹性纤维。小梁网的表面覆盖一层内皮细胞。内皮细胞宽而扁平，有突起，有的突起很长，与相邻细胞连接成单层网状。内皮细胞中含有丰富的膜样细胞器。
激光小梁成形术后6mo：一部分小梁组织和细胞结构正常，但也有一些变性和坏死。3种波长激光光凝后电镜所见如下：(1)氩激光：胶原纤维排列紊乱，有变性和轻度肿胀。部分细胞浆内线粒体空泡样变，细胞间隙变窄(图3);(2)“532”激光：胶原纤维肿胀、变性、融合成电子密度较高的团块。有的细胞线粒体肿胀、空泡样变；(3)半导体激光：胶原纤维排列紊乱、变性、融合。黑色素变性，形成电子密度很高的短棒状物质，并且被上皮细胞吞噬。有的上皮细胞内的线粒体空泡样变，甚至细胞坏死(图4)。
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Figure 3 The disorder arrangement of the collagenous fibers with denaturing and
lightly swelling.Parts of chondriosomes in the cytoplasm are vacuolsted degeneration(4 000×)
胶原纤维排列紊乱，有变性和轻度肿胀，部分细胞浆内线粒体空泡样变，细胞间隙变窄(4 000×).
Figure 4 Melanotic denatination,formed the short stick structure
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with a higher electronic density,which have been engulfed
by the epithelial cells(8 000×)
黑色素变性，形成电子密度很高的短棒状物质，并且被上皮细胞吞噬(8 000×).
3 讨论
3.1 3种激光小梁成形术后小梁组织学变化 本研究采用恒河猴眼，其小梁较人眼短而粗，虽然与人眼有些差别，但与人眼小梁有相似的超微结构。
光凝后10d的小梁组织，在光镜标本中发现3种波长激光照射后均有Schlemm管的扩张，小梁间隙变窄，胶原断裂、融合或排列紊乱。此时已没有明显的炎症反应。光凝后1mo，3种波长激光光凝处小梁前房侧有一从角膜内皮细胞延伸过来的单细胞层，覆盖前房侧小梁网，部分遮盖了小梁网。Merlyn等[1]在术后晚期观察到这一细胞层，并用透射电镜进一步观察和分析，认为这是一种不寻常的角膜内皮细胞或小梁内皮细胞。Shlomo等[2]也在术后1mo观察到这一细胞层。本实验术后3mo仍能观察到这一细胞层。Bylsma等[3]用放射自显影技术，发现光凝小梁后，许氏线附近的小梁干细胞发生分裂增殖，向光凝区移行，这些分裂增殖的细胞具有正常小梁组织细胞的功能，如吞噬，产生细胞外基质，维持适宜的房水外流阻力等。这一细胞层可能与此有关。
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3.2 激光小梁成形术可能的机理 激光小梁成形术的机理目前还不十分清楚。有几种学说，Wise和Witter[4]提出机械效应学说，认为激光热效应使小梁纤维板层收缩，加宽了小梁间隙，同时打开了Schlemm管。Brancato等[5]也持这种观点。De Concini等[6]在给一位开角型青光眼患者做了180°激光小梁成形术后不久，发现该眼脉络膜恶性黑色素瘤，做了眼球摘除，用显微尺测量了小梁间隙宽度、Schlemm管的管径，并和同一眼的未做治疗部分对照，证明了这个机械学说。Acott等[7]提出生物学学说，认为激光刺激了细胞的分裂和移行，修复了细胞外基质，复原了小梁结构。这些分裂增殖的细胞具有正常小梁组织细胞的功能，如吞噬、产生细胞外基质、维持适宜的房水外流阻力等。此外还有体液学说，认为激光小梁成形术后，小梁组织发生炎症反应，生成前列腺素增加[8]，前列腺素有较强的降眼压作用。本实验发现术后在非光凝区小梁间隙增大，Schlemm管扩张，而不是在光凝区。在光凝区，小梁网遭到破坏，出现不同程度的胶原断裂、排列紊乱、小梁间隙变窄。术后6mo的透射电镜检查仍发现变性和破坏，说明激光损害是不可逆的。所以小梁成形术后房水流畅系数的提高，不可能在光凝区得到，只能在非光凝区得到。可能通过：(1)非光凝区小梁网间隙增加，Schlemm管扩张，其代偿功能超过了小梁成形术造成的光凝区的小梁网的损失；(2)受激光刺激后分裂增殖的小梁干细胞参与了非光凝区小梁结构的重建，并发挥了正常小梁组织的功能。
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在半导体激光术后6mo，黑色素形成电子密度很高的短棒状物质，并被上皮细胞吞噬，这可能与半导体激光的黑色素吸收率低、波长较长、穿透性强、引起的损伤较深有关。
基金项目：上海市科委科研基金资助(编号974119013)
作者简介：孙静芬，女，1967年9月出生，上海市人，汉族。1991年毕业于上海第二医科大学，获医学学士学位；1999年上海第二医科大学硕士毕业。在读硕士研究生期间1996年和1997年在法国巴黎Cochin医院眼科任住院医师。现任上海第二医科大学附属瑞金医院眼科主治医师。主要从事青光眼的基础和临床研究，并在激光治疗青光眼和眼底病方面有特长。
作者单位：孙静芬(上海第二医科大学附属瑞金医院眼科 200025)
叶纹(上海第二医科大学附属瑞金医院眼科 200025)
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钟一声(上海第二医科大学附属瑞金医院眼科 200025)
王康孙(上海第二医科大学附属瑞金医院眼科 200025)
参考文献
1，Merlyn M,Rodrigue MM,Georgel L,et al.Electron microscopy of Argon laser therapy in phakic open angle glaucoma[J].Ophthalmology 1982;83(3)∶198-210.
2，Shlomo M,Jean Pei,David L,et al.Delayed response to argon laser trabeculoplasty in monkeys morphological and morphometric analysis[J].Acta Ophthalmol 1986;104(7)∶1078-1083.
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4，Wise JB,Witter SL.Argon laser therapy for open angle glaucoma:A pilot study [J].Arch Ophthalmol 1979;97∶319-322.
5，Brancato R,Menchini U,Pece A,et al.Aspects microscopigues de l'angle camerulaire humain apres photocoagulation au laser a l'argon[J].Men Soc Fr Ophthalmol 1981;93∶109-113.
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6，De Concini M,Boi S,Detassis C.Microscopical study of trabeculum after laser cyclotrabeculospasis case report[J].Pathologica 1993;85(1099)∶563-567.
7，Acott TS,Samples JS,Bradley JM,et al.Trabecular repopulaion by anterior trabecular meshwork cells after laser trabeculoplasy[J].Am J Ophthalmol 1989;107∶1-6.
8，Coaks R,Laser trabeculoplasty[J].Br J Ophthalmol 1992;76∶624-626., 百拇医药