高压氧对脑缺血致记忆障碍大鼠脑内钙分布及生长抑素含量的影响
高压氧对脑缺血致记忆障碍大鼠脑内钙分布及生长抑素含量的影响
王伯平 于涛 孙长丰 冯增文 贾钢锐
关键词：高压氧；脑缺血；大鼠；脑；钙；生长抑素
材料和方法
成年雄性健康SD大鼠30只，体重250～300 g，由北京中国医学科学院动物研究所提供。随机分为3组，包括正常不缺血高压氧(HBO)作用组(对照组)，缺血后HBO未作用组(模型组)，缺血HBO作用组(HBO组)。
动物模型制备：用0.5%氯胺酮(0.3 ml/100 g Wt.I.P)腹腔内注射。先头顶部正中切口，暴露第1颈椎横突翼小孔，用直径0.5 mm电凝针插入每一侧翼小孔中，烧灼双侧椎动脉，造成永久性闭塞，缝合创口，避光保温饲养。24 h 后，再暴露双侧颈总动脉，用微动脉夹可逆性夹闭双侧颈总动脉5 min，反复3次，每次间隔1 h，恢复供血，缝合创口饲养。对照组手术后步骤同上，但不做脑缺血处理。
, 百拇医药
动物学习、记忆训练及测试：动物模型制作前，首先对所有动物进行水迷宫和跳台试验的训练及测试，每天训练5～7次，连续5 d，同时记录成绩。水迷宫及跳台仪由中国医学科学院药物所提供。
病理观察：快速将动物断头处死，迅速取额、颞叶皮质，将组织切成1～2 mm3的组织块，置于0～4℃的3%戊二醛-90 mmol/L草酸钾溶液中，固定2 h。用7.5%蔗糖-90 mmol/L草酸钾溶液振荡浸洗3次，1%OS4，2%焦锑酸钾溶液室温下固定1 h。经过脱水、浸透与包埋后，超薄切片，日本H 500型电镜下观察，放大倍数为10 000～60 000。
部分脑区标本的生长抑素(SS)测定：快速断头取全脑，置沸腾生理盐水中煮5 min后，分离海马、丘脑等脑区，称重后，移入含1 NHCl 1 ml的匀浆管内充分匀浆，室温搁置100 min，再加入1 ml 1NNaOH，3 000r/min离心20 min取上清液置入-80℃冰箱内保存待测。用上海第二军医大学神经生物学教研室提供的SS放射性核素测定试剂盒进行检测。HBO动物实验舱由全军航海病专科中心提供。将对照组和治疗组大鼠同时放入动物舱内，用纯氧加压至0.18 MPa，然后减压，连续洗舱3次，再用纯氧加压至0.25 MPa，持续吸氧90 min，20 min匀速减压出舱。每天1次，10次1个疗程，共2个疗程。两个疗程间隔5 d。每个疗程结束后，立即进行学习、记忆能力的测试。
, 百拇医药
统计学处理：对所测数据取均值(X±s)，用方差分析判断差异程度。
结果
水迷宫试验结果：缺血后30 d，模型组动物在水迷宫中游全程的时间比对照组明显延长(F＝4.09，P<0.05)，进入盲端的错误次数比对照组明显增多(F＝4.37，P<0.05)。经HBO治疗后，HBO组大鼠游全程的时间比模型组有明显缩短(F＝3.74，P<0.05)。进入盲端的错误次数比模型组明显减少(F＝3.89，P<0.05)，见表1，2。
跳台试验结果：缺血后30 d模型组动物在跳台试验中的潜伏期比对照组明显缩短(F＝4.86，P<0.05)，错误次数比对照组明显增多(F＝4.58，P<0.05)。经HBO治疗后HBO组动物错误次数比模型组有明显减少(F＝3.66，P<0.05)，见表3。
电镜所见：模型组动物额、颞叶皮质神经元和胶质细胞的核膜结构不清，线粒体明显肿胀，内质网扩张并脱颗粒，胞质出现空泡。并见钙颗粒分布于损伤细胞的线粒体及胞浆空泡内，钙颗粒增多的程度与细胞损伤程度相符(图略)，经HBO治疗后，HBO组动物皮质神经元和胶质细胞的结构正常，核膜结构清晰，胞质内粗面内质网丰富(图略)。
, 百拇医药
部分脑区标本SS测定结果：模型组海马区SS含量与HBO组比较明显减少(F＝3.91，P<0.05)，而丘脑区SS含量与HBO组差异无显著性(F＝2.86，P>0.05)。
表1 HBO作用前后大鼠在水迷宫试验中游全程的时间(X±s，s，n＝10)
组别及时间
测 试 时 间
第1 d
第2 d
第3 d
第4 d
实验前 对照组
53.0± 5.9
, 百拇医药
47.9±10.1
51.0± 9.5
41.9± 6.4
模型组
33.2± 7.3
49.5±10.9
44.5± 7.0
40.5± 7.9
HBO组
46.5± 8.3
46.2±11.0
32.7± 6.2
, 百拇医药
45.2± 7.7
缺血30 d对照组
44.8± 8.1
41.2±11.3
40.0± 7.5
41.2± 5.6
模型组
89.3±16.5
88.2±13.7
79.4±13.8
82.4±14.0
HBO组
, 百拇医药
117.5±14.8
98.2±17.8
86.3±12.2
80.8±14.4
HBO-2个疗程对照组
38.7±13.3
44.9±13.0
40.5± 6.7
38.9± 7.2
模型组
43.1± 8.6
50.0±22.9
, 百拇医药
34.4±13.6
26.6±12.2
HBO组
111.3±13.1
108.2±14.5
81.2±14.9
97.6±14.2
表2 HBO作用前后大鼠在水迷宫试验中错误次数(X±s，s,n＝10)
组别及时间
测 试 时 间
第1 d
, 百拇医药
第2 d
第3 d
第4 d
实验前 对照组
2.2±0.3
2.8±0.6
2.7±0.5
1.9±0.3
模型组
1.9±0.3
2.1±0.4
2.3±0.3
, 百拇医药 1.8±0.4
HBO组
2.3±0.2
2.0±0.3
2.3±0.5
2.3±0.5
缺血30 d对照组
1.8±0.3
2.5±0.5
2.2±0.4
2.8±0.5
模型组
, 百拇医药
3.8±0.8
4.6±0.7
5.0±1.0
5.6±0.8
HBO组
6.8±1.4
5.1±0.8
5.6±0.8
5.9±1.0
HBO-2个疗程对照组
2.3±0.5
2.3±0.5
, http://www.100md.com
2.3±0.7
3.2±0.6
模型组
5.9±1.3
5.9±1.3
5.0±1.0
5.5±0.8
HBO组
2.1±0.7
2.1±0.7
2.4±0.8
2.0±0.8
, http://www.100md.com
表3 HBO作用前后大鼠在跳台试验中学习记忆成绩(X±s，s,n＝10)
组别及时间
第1 d测试
第2 d测试
第3 d测试
潜伏期(s)
错误次数
潜伏期(s)
错误次数
潜伏期(s)
错误次数
实验前 对照组
, 百拇医药
22.1±17.6
3.6±0.7
164.0±16.0
0.4±0.4
151.5±19.0
0.4±0.3
模型组
23.7±17.4
2.9±0.7
149.0±20.8
0.2±0.1
146.0±22.7
, http://www.100md.com
0.3±0.2
HBO组
25.6±17.2
3.1±0.8
133.0±24.0
0.7±0.4
150.7±19.9
0.2±0.1
缺血30 d对照组
125.4±22.8
0.4±0.2
146.4±22.4
, 百拇医药
0.2±0.1
164.1±15.9
0.1±0.1
模型组
35.5±16.5
3.0±0.9
25.4±17.2
1.5±0.3
56.5±21.3
1.3±0.4
HBO组
76.7±28.1
, 百拇医药
1.2±0.5
65.0±25.1
1.6±0.5
77.9±23.0
1.1±0.4
HBO-2个疗程对照组
170.5± 9.5
0.2±0.2
145.8±22.9
0.4±0.3
145.8±0.20
0.2±0.1
, http://www.100md.com
模型组
69.9±24.1
3.3±0.8
64.7±25.3
2.0±0.6
84.6±0.82
2.3±0.8
HBO组
92.3±31.2
1.1±0.7
61.3±30.8
0.9±0.3
, 百拇医药
65.1±0.71
0.8±0.2
讨论 本实验采用Pulsinelli、贾健民等的方法[1，2]，建立大鼠反复脑缺血致学习记忆障碍的动物模型。实验证明，经过反复脑缺血再灌注后，模型组大鼠的学习记忆能力较对照组发生明显障碍(P<0.05)，与文献报道相符[2]。反复脑缺血再灌注后第30 d神经元超微结构仍有明显损伤，钙颗粒分布于损伤细胞的线粒体及胞浆空泡内，主要由于缺氧使钙泵运转停止、钙通道开放引起细胞内钙超载[3]。SS与认知功能有关，可能参与知觉和智能高级神经活动。已有实验证明，中枢胆碱能系统破坏后，脑内SS含量明显减少[4]。本研究证明，反复脑缺血再灌注后，模型组动物海马区SS的含量比对照组动物明显减少(P<0.05)。学习记忆障碍可能与此有关。HBO作用后，SS的含量明显提高。
经HBO作用后，HBO组大鼠学习记忆能力比模型组有显著提高(P<0.05)。神经元超微结构损伤明显改善。海马区SS的含量比模型组动物明显改变(P<0.05)。结果提示：高压氧对脑缺血所致学习、记忆障碍有一定作用，但临床上要掌握治疗时机，尽早进行，且疗程要长。
, http://www.100md.com
王伯平(266071 青岛，解放军第四一医院神经科)
于涛(266071 青岛，解放军第四一医院神经科)
孙长丰(266071 青岛，解放军第四一医院神经科)
冯增文(266071 青岛，解放军第四一医院神经科)
贾钢锐(266071 青岛，解放军第四一医院神经科)
参考文献
1，Pulsinelli WA,Brierley JB.A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanaesthetized rat.Stroke,1979,10:267-271.
2，贾健民，贾健平.大鼠反复缺血致不可逆性学习、记忆障碍研究.心理学报，1995，27(10)：69-77.
3，高春锦，葛环，杨捷云，等.高压氧对缺血再灌注脑组织超微结构影响的实验研究.高压氧医学杂志，1995，5：6-13.
4，吴江，张淑琴，饶明俐，等.无名质区破坏的Wistar大鼠脑内胆碱乙酰转移酶和生长抑素活性的变化及相互关系.中风与神经疾病杂志，1995，12：130-132., 百拇医药
王伯平 于涛 孙长丰 冯增文 贾钢锐
关键词：高压氧；脑缺血；大鼠；脑；钙；生长抑素
材料和方法
成年雄性健康SD大鼠30只，体重250～300 g，由北京中国医学科学院动物研究所提供。随机分为3组，包括正常不缺血高压氧(HBO)作用组(对照组)，缺血后HBO未作用组(模型组)，缺血HBO作用组(HBO组)。
动物模型制备：用0.5%氯胺酮(0.3 ml/100 g Wt.I.P)腹腔内注射。先头顶部正中切口，暴露第1颈椎横突翼小孔，用直径0.5 mm电凝针插入每一侧翼小孔中，烧灼双侧椎动脉，造成永久性闭塞，缝合创口，避光保温饲养。24 h 后，再暴露双侧颈总动脉，用微动脉夹可逆性夹闭双侧颈总动脉5 min，反复3次，每次间隔1 h，恢复供血，缝合创口饲养。对照组手术后步骤同上，但不做脑缺血处理。
, 百拇医药
动物学习、记忆训练及测试：动物模型制作前，首先对所有动物进行水迷宫和跳台试验的训练及测试，每天训练5～7次，连续5 d，同时记录成绩。水迷宫及跳台仪由中国医学科学院药物所提供。
病理观察：快速将动物断头处死，迅速取额、颞叶皮质，将组织切成1～2 mm3的组织块，置于0～4℃的3%戊二醛-90 mmol/L草酸钾溶液中，固定2 h。用7.5%蔗糖-90 mmol/L草酸钾溶液振荡浸洗3次，1%OS4，2%焦锑酸钾溶液室温下固定1 h。经过脱水、浸透与包埋后，超薄切片，日本H 500型电镜下观察，放大倍数为10 000～60 000。
部分脑区标本的生长抑素(SS)测定：快速断头取全脑，置沸腾生理盐水中煮5 min后，分离海马、丘脑等脑区，称重后，移入含1 NHCl 1 ml的匀浆管内充分匀浆，室温搁置100 min，再加入1 ml 1NNaOH，3 000r/min离心20 min取上清液置入-80℃冰箱内保存待测。用上海第二军医大学神经生物学教研室提供的SS放射性核素测定试剂盒进行检测。HBO动物实验舱由全军航海病专科中心提供。将对照组和治疗组大鼠同时放入动物舱内，用纯氧加压至0.18 MPa，然后减压，连续洗舱3次，再用纯氧加压至0.25 MPa，持续吸氧90 min，20 min匀速减压出舱。每天1次，10次1个疗程，共2个疗程。两个疗程间隔5 d。每个疗程结束后，立即进行学习、记忆能力的测试。
, 百拇医药
统计学处理：对所测数据取均值(X±s)，用方差分析判断差异程度。
结果
水迷宫试验结果：缺血后30 d，模型组动物在水迷宫中游全程的时间比对照组明显延长(F＝4.09，P<0.05)，进入盲端的错误次数比对照组明显增多(F＝4.37，P<0.05)。经HBO治疗后，HBO组大鼠游全程的时间比模型组有明显缩短(F＝3.74，P<0.05)。进入盲端的错误次数比模型组明显减少(F＝3.89，P<0.05)，见表1，2。
跳台试验结果：缺血后30 d模型组动物在跳台试验中的潜伏期比对照组明显缩短(F＝4.86，P<0.05)，错误次数比对照组明显增多(F＝4.58，P<0.05)。经HBO治疗后HBO组动物错误次数比模型组有明显减少(F＝3.66，P<0.05)，见表3。
电镜所见：模型组动物额、颞叶皮质神经元和胶质细胞的核膜结构不清，线粒体明显肿胀，内质网扩张并脱颗粒，胞质出现空泡。并见钙颗粒分布于损伤细胞的线粒体及胞浆空泡内，钙颗粒增多的程度与细胞损伤程度相符(图略)，经HBO治疗后，HBO组动物皮质神经元和胶质细胞的结构正常，核膜结构清晰，胞质内粗面内质网丰富(图略)。
, 百拇医药
部分脑区标本SS测定结果：模型组海马区SS含量与HBO组比较明显减少(F＝3.91，P<0.05)，而丘脑区SS含量与HBO组差异无显著性(F＝2.86，P>0.05)。
表1 HBO作用前后大鼠在水迷宫试验中游全程的时间(X±s，s，n＝10)
组别及时间
测 试 时 间
第1 d
第2 d
第3 d
第4 d
实验前 对照组
53.0± 5.9
, 百拇医药
47.9±10.1
51.0± 9.5
41.9± 6.4
模型组
33.2± 7.3
49.5±10.9
44.5± 7.0
40.5± 7.9
HBO组
46.5± 8.3
46.2±11.0
32.7± 6.2
, 百拇医药
45.2± 7.7
缺血30 d对照组
44.8± 8.1
41.2±11.3
40.0± 7.5
41.2± 5.6
模型组
89.3±16.5
88.2±13.7
79.4±13.8
82.4±14.0
HBO组
, 百拇医药
117.5±14.8
98.2±17.8
86.3±12.2
80.8±14.4
HBO-2个疗程对照组
38.7±13.3
44.9±13.0
40.5± 6.7
38.9± 7.2
模型组
43.1± 8.6
50.0±22.9
, 百拇医药
34.4±13.6
26.6±12.2
HBO组
111.3±13.1
108.2±14.5
81.2±14.9
97.6±14.2
表2 HBO作用前后大鼠在水迷宫试验中错误次数(X±s，s,n＝10)
组别及时间
测 试 时 间
第1 d
, 百拇医药
第2 d
第3 d
第4 d
实验前 对照组
2.2±0.3
2.8±0.6
2.7±0.5
1.9±0.3
模型组
1.9±0.3
2.1±0.4
2.3±0.3
, 百拇医药 1.8±0.4
HBO组
2.3±0.2
2.0±0.3
2.3±0.5
2.3±0.5
缺血30 d对照组
1.8±0.3
2.5±0.5
2.2±0.4
2.8±0.5
模型组
, 百拇医药
3.8±0.8
4.6±0.7
5.0±1.0
5.6±0.8
HBO组
6.8±1.4
5.1±0.8
5.6±0.8
5.9±1.0
HBO-2个疗程对照组
2.3±0.5
2.3±0.5
, http://www.100md.com
2.3±0.7
3.2±0.6
模型组
5.9±1.3
5.9±1.3
5.0±1.0
5.5±0.8
HBO组
2.1±0.7
2.1±0.7
2.4±0.8
2.0±0.8
, http://www.100md.com
表3 HBO作用前后大鼠在跳台试验中学习记忆成绩(X±s，s,n＝10)
组别及时间
第1 d测试
第2 d测试
第3 d测试
潜伏期(s)
错误次数
潜伏期(s)
错误次数
潜伏期(s)
错误次数
实验前 对照组
, 百拇医药
22.1±17.6
3.6±0.7
164.0±16.0
0.4±0.4
151.5±19.0
0.4±0.3
模型组
23.7±17.4
2.9±0.7
149.0±20.8
0.2±0.1
146.0±22.7
, http://www.100md.com
0.3±0.2
HBO组
25.6±17.2
3.1±0.8
133.0±24.0
0.7±0.4
150.7±19.9
0.2±0.1
缺血30 d对照组
125.4±22.8
0.4±0.2
146.4±22.4
, 百拇医药
0.2±0.1
164.1±15.9
0.1±0.1
模型组
35.5±16.5
3.0±0.9
25.4±17.2
1.5±0.3
56.5±21.3
1.3±0.4
HBO组
76.7±28.1
, 百拇医药
1.2±0.5
65.0±25.1
1.6±0.5
77.9±23.0
1.1±0.4
HBO-2个疗程对照组
170.5± 9.5
0.2±0.2
145.8±22.9
0.4±0.3
145.8±0.20
0.2±0.1
, http://www.100md.com
模型组
69.9±24.1
3.3±0.8
64.7±25.3
2.0±0.6
84.6±0.82
2.3±0.8
HBO组
92.3±31.2
1.1±0.7
61.3±30.8
0.9±0.3
, 百拇医药
65.1±0.71
0.8±0.2
讨论 本实验采用Pulsinelli、贾健民等的方法[1，2]，建立大鼠反复脑缺血致学习记忆障碍的动物模型。实验证明，经过反复脑缺血再灌注后，模型组大鼠的学习记忆能力较对照组发生明显障碍(P<0.05)，与文献报道相符[2]。反复脑缺血再灌注后第30 d神经元超微结构仍有明显损伤，钙颗粒分布于损伤细胞的线粒体及胞浆空泡内，主要由于缺氧使钙泵运转停止、钙通道开放引起细胞内钙超载[3]。SS与认知功能有关，可能参与知觉和智能高级神经活动。已有实验证明，中枢胆碱能系统破坏后，脑内SS含量明显减少[4]。本研究证明，反复脑缺血再灌注后，模型组动物海马区SS的含量比对照组动物明显减少(P<0.05)。学习记忆障碍可能与此有关。HBO作用后，SS的含量明显提高。
经HBO作用后，HBO组大鼠学习记忆能力比模型组有显著提高(P<0.05)。神经元超微结构损伤明显改善。海马区SS的含量比模型组动物明显改变(P<0.05)。结果提示：高压氧对脑缺血所致学习、记忆障碍有一定作用，但临床上要掌握治疗时机，尽早进行，且疗程要长。
, http://www.100md.com
王伯平(266071 青岛，解放军第四一医院神经科)
于涛(266071 青岛，解放军第四一医院神经科)
孙长丰(266071 青岛，解放军第四一医院神经科)
冯增文(266071 青岛，解放军第四一医院神经科)
贾钢锐(266071 青岛，解放军第四一医院神经科)
参考文献
1，Pulsinelli WA,Brierley JB.A new model of bilateral hemispheric ischemia in the unanaesthetized rat.Stroke,1979,10:267-271.
2，贾健民，贾健平.大鼠反复缺血致不可逆性学习、记忆障碍研究.心理学报，1995，27(10)：69-77.
3，高春锦，葛环，杨捷云，等.高压氧对缺血再灌注脑组织超微结构影响的实验研究.高压氧医学杂志，1995，5：6-13.
4，吴江，张淑琴，饶明俐，等.无名质区破坏的Wistar大鼠脑内胆碱乙酰转移酶和生长抑素活性的变化及相互关系.中风与神经疾病杂志，1995，12：130-132., 百拇医药