老年大鼠下丘脑和垂体神经细胞核染色质的构象研究
老年大鼠下丘脑和垂体神经细胞核染色质的构象研究
彭家和 邱平 茆象千
摘 要 目的 观察老年大鼠下丘脑和垂体神经细胞核染色质的构象特征。 方法 选用微球菌核酸酶(MCN)和脱氧核糖核酸酶I(DNase I)作为染色质结构识别探针，经琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，显示老年大鼠和青年大鼠下丘脑、垂体神经细胞核染色质的结构变化。 结果 老年大鼠下丘脑、垂体染色质核小体重复DNA长度分别为(190±7)bp和(171±8)bp,而青年大鼠分别为(193±9)bp和(170±5)bp;DNase I酶解DNA产物PAGE显示各年龄组染色质DNA均存在10 bp间隔重复结构和相同的电泳区带分布特征；DNase I染色质降解率老年大鼠明显低于青年大鼠。 结论 (1)老年大鼠和青年大鼠下丘脑、垂体染色质核小体重复DNA长度未发现随龄变化特征，但呈明显组织差异；(2)染色质DNA均以B型双股螺旋构象形式存在；(3)老年大鼠染色质DNA抗DNase I酶解能力增强。
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关键词：染色质构象；下丘脑；垂体
真核细胞的全部遗传信息DNA及与其结合的蛋白质形成念珠状的多聚核小体结构，在细胞分裂间期多聚核小体进一步组装成多层次复合的超卷曲染色质构象，进而参与基因表达的调控过程〔1,2〕。我们于1996年1月至1998年12月以微球菌核酸酶(MCN)和脱氧核糖核酸酶(DNase)I为染色质结构识别探针，对老年大鼠和青年大鼠的下丘脑、垂体神经细胞核染色质构象特征进行比较研究，以助于进一步认识脑组织老化的分子机制。
材料与方法
一、实验动物和试剂
实验动物为健康Wistar系大鼠，由第三军医大学实验动物中心提供，按鼠龄分两组：青年组23只，16～17周；老年组18只，100～105周。MCN(172 U/mg Prot)和DNase I(925 Kunitzunits/mg Prot)为美国Sigma公司产品，琼脂糖为瑞典Pharmacia公司产品，苯*****(PMSF)为德国Boehringer Mannheim公司产品，高分子量和低分子量DNA标准品分别为华美公司和上海复华公司产品，常用其他化学试剂均为国产分析纯。
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二、方法
1.脑神经细胞核的分离及MCN和DNase I消化：参照文献〔3〕，断头处死大鼠，迅速取下丘脑和垂体，经冰冷分离介质(0.32 mol/L蔗糖、5 mmol/L MgCl2、150 mmol/L KCl、10 mmol/L Tris-HCl,pH 7.0)冲洗后称重，按每克组织加15 ml分离介质制成匀浆，并用200目尼龙布过滤，滤液用TGL-16台式离心机5 000 r/min离心5 min，弃上清，沉淀用消化介质(150 mmol/L KCl、5%甘油、0.5 mmol/L PMSF、10 mmol/L Tris-HCl,pH 8.2)洗1次，再配制成1 mg/ml DNA悬液。
取核悬液于30℃预温5 min，按150 U/mg DNA分别加入MCN和DNase I，开始MCN消化和DNase I消化，在指定时间取200 μl加到200 μl终止液〔20 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)、1%十二烷基硫酸钠(SDS)，pH 8.0〕中，终止反应。按文献〔4〕的方法测定酸溶性DNA百分率。
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向各管加等体积饱和酚，轻轻上下翻转抽提5 min，8 000 r/min离心5 min，取上清液于另一离心管中，再用酚-氯仿、氯仿重复各抽提1次，取上清液加2倍体积无水乙醇沉淀DNA，-20℃过夜。12 000 r/min离心5 min，沉淀用冰冷70%乙醇洗1次，弃上清，加TE(1 mmol/L EDTA、10 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0)使其溶解。
2.DNA凝胶电泳：MCN酶解双链DNA产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳，4℃、60 V、4 h，溴化乙锭(EB)染色，在TR-A型紫外线检测仪上观察、照像。由DNA标准确定碱基对数(bp)，用于核小体单位DNA长度分析。DNase I酶解产物单链DNA制备参照Maniatis等〔5〕的方法，经12%聚丙烯酰胺凝胶-7mol/L尿素垂直平板电泳(1.5 mm×150 mm×180 mm)，缓冲系统为TBE缓冲液(90 mmol/L Tris,90 mmol/L硼酸，2.5 mmol/L EDTA-Na2，pH 8.3)，200 V恒压、室温电泳约9 h。凝胶电泳后经0.0025% stains-all(50%甲酰胺配制)染色，置暗处约8 h，水中脱色3 h，照像。
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结 果
一、下丘脑、垂体神经细胞核MCN酶解产物电泳分析及核小体单位DNA长度的测定
图1为两组大鼠下丘脑和垂体神经细胞核染色质经MCN消化9 min，酶解产物DNA的电泳分析图谱。下丘脑和垂体染色质DNA均被分解为单体及其寡聚体形式，在图谱上均表现出规律性重复排列的核小体结构。
图1 MCN酶解DNA产物的琼脂糖凝胶电泳图谱
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图2 标准DNA分子量电泳相对迁移率
青年大鼠、老年大鼠的下丘脑和垂体染色质DNA的MCN酶解图谱均无明显差别，提示老年大鼠未发生核小体结构的变化，尤其是核小体间连接DNA长度的改变。依据DNA标准迁移率(图2)测得青年大鼠和老年大鼠下丘脑及垂体细胞核核小体及其寡聚体DNA碱基对(表1)，分别计算出下丘脑和垂体细胞核染色质的核小体单位DNA长度分别稳定在190～193 bp和170～171 bp的水平上。
表1 青年大鼠和老年大鼠的下丘脑、垂体神经细胞核染色质DNA平均重复长度(X±s，bp)
区带
青年大鼠
老年大鼠
下丘脑
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垂体
下丘脑
垂体
碱基对
△碱基对
碱基对
△碱基对
碱基对
△碱基对
碱基对
△碱基对
1
212±4
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141±3
221±3
147±4
2
369±7
154±6
315±2
174±3
362±2
?141±3
325±4
178±4
3
, 百拇医药
589±9
220±8
490±4
175±3
580±5
218±4
496±7
171±6
4
781±13
192±11
657±8
167±6
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793±12
213±9
661±9
165±8
5
986±10
205±12
845±5
171±6
984±11
191±12
831±12
170±11
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6
1008±9
163±7
999±7
169±10
平均值
193±9
170±5
190±7
171±8
注：表中碱基对数值是3～4次电泳的平均值；△碱基对为相邻区带碱基对差值
二、下丘脑、垂体神经细胞核对DNase I消化的敏感性
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青年大鼠和老年大鼠下丘脑、垂体神经细胞核的消化动力学曲线(图3)显示：细胞核染色质DNA对DNase I消化敏感性表现出明显的随龄变化特征。在各个消化时期，老年大鼠染色质DNase I消化率显著低于青年鼠。
图3 青年、老年大鼠下丘脑、垂体神经细胞核DNase I消化动力学曲线
三、下丘脑、垂体细胞核染色质DNase I酶解产物电泳分析及核小体构象特征
图4为青年大鼠和老年大鼠下丘脑、垂体神经细胞核染色质DNase I消化20 min，酶解产物的电泳分析图谱。显示染色质DNA均存在间隔规律的DNase I识别和剪切位点。以老年大鼠下丘脑为例，以其各区带碱基对的对数值对相应区带相对迁移率作图(图5)，显示各区带分子量以10倍值递增,染色质DNA每隔10个核苷酸序列具有DNase I的作用位点,提示下丘脑、垂体神经细胞染色质DNA主要以B型双股螺旋构象形式存在〔6〕。
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图4 DNase I消化下丘脑、垂体染色质DNA产物的垂直平板电泳图谱
图5 DNase I消化老年大鼠下丘脑染色质DNA片段碱基对数与其相对迁移率的关系曲线
讨 论
MCN和DNase I是近年来研究染色质构象应用得最多的核酸内切酶，一般认为MCN能优先酶切核小体间连接DNA，产生单核小体及其寡聚体；而DNase I对染色质构象特征的识别作用为在30 nm染色质纤维构象中识别螺线管亚单位二核小体(dinucleosome)；在核小体DNA内部剪切下10 bp的片段及其多聚体，识别DNA双股螺旋的卷曲特征；优先酶解活性染色质〔7〕。本研究结果显示，MCN酶解下丘脑及垂体神经细胞核染色质，核小体单位DNA长度分别保持在190 bp和170 bp水平上，存在明显的组织差异，未发现有年龄相关性变化。由于各年龄组大鼠下丘脑、垂体核小体核心颗粒DNA均为140 bp，说明核小体间连接DNA长度与脑老化神经功能状态无明显联系，其原因可能与脑老化中染色质组蛋白组成的高度保守性有关〔8〕。
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DNase I酶解青年大鼠和老年大鼠下丘脑、垂体神经细胞核染色质DNA，其产物电泳图谱区带分子量均表现为以10倍值递增的B型双螺旋构象特征。但进一步的实验结果表明，老年大鼠较青年大鼠对DNase I消化敏感性降低，表明衰老导致染色质构象发生了不利于DNase I分子接近的变化，掩盖了部分活性染色质区域，这将有可能影响RNA聚合酶转录染色质模板，进而抑制基因表达〔9〕。这一结果在染色质构象上为探讨生物细胞衰老的分子机制提供了线索。
基金项目：国家自然科学基金资助(39570353)
彭家和(第三军医大学生物化学与分子生物学教研室 重庆市，400038)
邱平(第三军医大学生物化学与分子生物学教研室 重庆市，400038)
茆象千(第三军医大学生物化学与分子生物学教研室 重庆市，400038)
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参考文献
1，Dai X, Greizerstein WB, Chinnik N. Supercoil-induced extraction of regulatory DNA hairpin. Proc Natl Acad Sci, 1997,94:2174-2179.
2，Lauvent WC, Ngo S, Danchin A. Role of eschericha coil histone-like nucleoid structuring protein in becterial metabolism and stress respone identification of targets by two-dimensional electrophoresis. Eur J Biochem, 1997,244:767-773.
3，茆象千，彭家和，邱平.大鼠老化过程小脑神经元染色质核小体线性和空间排布特征分析.中国生物化学与分子生物学报,1999，15:188-191.
, 百拇医药
4，Noll M, Kornbery RD. Action of micrococcal nuclease on chromatin and the location of histone H1. J Mol Biol, 1977,109:393-404.
5，Maniatis T, Jeffrey A, Desande HV. Chain length determination of small double and single-stranded DNA molecules by polyacrylamide gel electrophoresis. Biochemistry, 1975,14:3787-3794.
6，Kornberg RD. Structure of chromatin. Ann Kev Biochem, 1997,46:931-951.
7，Staynov DZ, Progkova YG. Quantitative analysis of DNase I digestion patters of oligo-and polynucleosomes, J Mol Biol, 1998,279:59-71.
, http://www.100md.com
8，An W, Van Holde K, Zlatanova J. Linker histone protection of chromatosomes reconstituted on 5s rDNA from Xenopus horealis: a reinvestigation. Nucleic Acids Res, 1998,26:4042-4046.
9，Chaturvedi MM, Kanungo MS. Analysis of conformation and function of the chromatin of the brain of young and old rats. Mol Biol Rep, 1985,10:215-219., http://www.100md.com
彭家和 邱平 茆象千
摘 要 目的 观察老年大鼠下丘脑和垂体神经细胞核染色质的构象特征。 方法 选用微球菌核酸酶(MCN)和脱氧核糖核酸酶I(DNase I)作为染色质结构识别探针，经琼脂糖和聚丙烯酰胺凝胶电泳(PAGE)，显示老年大鼠和青年大鼠下丘脑、垂体神经细胞核染色质的结构变化。 结果 老年大鼠下丘脑、垂体染色质核小体重复DNA长度分别为(190±7)bp和(171±8)bp,而青年大鼠分别为(193±9)bp和(170±5)bp;DNase I酶解DNA产物PAGE显示各年龄组染色质DNA均存在10 bp间隔重复结构和相同的电泳区带分布特征；DNase I染色质降解率老年大鼠明显低于青年大鼠。 结论 (1)老年大鼠和青年大鼠下丘脑、垂体染色质核小体重复DNA长度未发现随龄变化特征，但呈明显组织差异；(2)染色质DNA均以B型双股螺旋构象形式存在；(3)老年大鼠染色质DNA抗DNase I酶解能力增强。
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关键词：染色质构象；下丘脑；垂体
真核细胞的全部遗传信息DNA及与其结合的蛋白质形成念珠状的多聚核小体结构，在细胞分裂间期多聚核小体进一步组装成多层次复合的超卷曲染色质构象，进而参与基因表达的调控过程〔1,2〕。我们于1996年1月至1998年12月以微球菌核酸酶(MCN)和脱氧核糖核酸酶(DNase)I为染色质结构识别探针，对老年大鼠和青年大鼠的下丘脑、垂体神经细胞核染色质构象特征进行比较研究，以助于进一步认识脑组织老化的分子机制。
材料与方法
一、实验动物和试剂
实验动物为健康Wistar系大鼠，由第三军医大学实验动物中心提供，按鼠龄分两组：青年组23只，16～17周；老年组18只，100～105周。MCN(172 U/mg Prot)和DNase I(925 Kunitzunits/mg Prot)为美国Sigma公司产品，琼脂糖为瑞典Pharmacia公司产品，苯*****(PMSF)为德国Boehringer Mannheim公司产品，高分子量和低分子量DNA标准品分别为华美公司和上海复华公司产品，常用其他化学试剂均为国产分析纯。
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二、方法
1.脑神经细胞核的分离及MCN和DNase I消化：参照文献〔3〕，断头处死大鼠，迅速取下丘脑和垂体，经冰冷分离介质(0.32 mol/L蔗糖、5 mmol/L MgCl2、150 mmol/L KCl、10 mmol/L Tris-HCl,pH 7.0)冲洗后称重，按每克组织加15 ml分离介质制成匀浆，并用200目尼龙布过滤，滤液用TGL-16台式离心机5 000 r/min离心5 min，弃上清，沉淀用消化介质(150 mmol/L KCl、5%甘油、0.5 mmol/L PMSF、10 mmol/L Tris-HCl,pH 8.2)洗1次，再配制成1 mg/ml DNA悬液。
取核悬液于30℃预温5 min，按150 U/mg DNA分别加入MCN和DNase I，开始MCN消化和DNase I消化，在指定时间取200 μl加到200 μl终止液〔20 mmol/L乙二胺四乙酸(EDTA)、1%十二烷基硫酸钠(SDS)，pH 8.0〕中，终止反应。按文献〔4〕的方法测定酸溶性DNA百分率。
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向各管加等体积饱和酚，轻轻上下翻转抽提5 min，8 000 r/min离心5 min，取上清液于另一离心管中，再用酚-氯仿、氯仿重复各抽提1次，取上清液加2倍体积无水乙醇沉淀DNA，-20℃过夜。12 000 r/min离心5 min，沉淀用冰冷70%乙醇洗1次，弃上清，加TE(1 mmol/L EDTA、10 mmol/L Tris-HCl,pH 8.0)使其溶解。
2.DNA凝胶电泳：MCN酶解双链DNA产物经1.2%琼脂糖凝胶电泳，4℃、60 V、4 h，溴化乙锭(EB)染色，在TR-A型紫外线检测仪上观察、照像。由DNA标准确定碱基对数(bp)，用于核小体单位DNA长度分析。DNase I酶解产物单链DNA制备参照Maniatis等〔5〕的方法，经12%聚丙烯酰胺凝胶-7mol/L尿素垂直平板电泳(1.5 mm×150 mm×180 mm)，缓冲系统为TBE缓冲液(90 mmol/L Tris,90 mmol/L硼酸，2.5 mmol/L EDTA-Na2，pH 8.3)，200 V恒压、室温电泳约9 h。凝胶电泳后经0.0025% stains-all(50%甲酰胺配制)染色，置暗处约8 h，水中脱色3 h，照像。
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结 果
一、下丘脑、垂体神经细胞核MCN酶解产物电泳分析及核小体单位DNA长度的测定
图1为两组大鼠下丘脑和垂体神经细胞核染色质经MCN消化9 min，酶解产物DNA的电泳分析图谱。下丘脑和垂体染色质DNA均被分解为单体及其寡聚体形式，在图谱上均表现出规律性重复排列的核小体结构。
图1 MCN酶解DNA产物的琼脂糖凝胶电泳图谱
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图2 标准DNA分子量电泳相对迁移率
青年大鼠、老年大鼠的下丘脑和垂体染色质DNA的MCN酶解图谱均无明显差别，提示老年大鼠未发生核小体结构的变化，尤其是核小体间连接DNA长度的改变。依据DNA标准迁移率(图2)测得青年大鼠和老年大鼠下丘脑及垂体细胞核核小体及其寡聚体DNA碱基对(表1)，分别计算出下丘脑和垂体细胞核染色质的核小体单位DNA长度分别稳定在190～193 bp和170～171 bp的水平上。
表1 青年大鼠和老年大鼠的下丘脑、垂体神经细胞核染色质DNA平均重复长度(X±s，bp)
区带
青年大鼠
老年大鼠
下丘脑
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垂体
下丘脑
垂体
碱基对
△碱基对
碱基对
△碱基对
碱基对
△碱基对
碱基对
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141±3
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147±4
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369±7
154±6
315±2
174±3
362±2
?141±3
325±4
178±4
3
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589±9
220±8
490±4
175±3
580±5
218±4
496±7
171±6
4
781±13
192±11
657±8
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1008±9
163±7
999±7
169±10
平均值
193±9
170±5
190±7
171±8
注：表中碱基对数值是3～4次电泳的平均值；△碱基对为相邻区带碱基对差值
二、下丘脑、垂体神经细胞核对DNase I消化的敏感性
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青年大鼠和老年大鼠下丘脑、垂体神经细胞核的消化动力学曲线(图3)显示：细胞核染色质DNA对DNase I消化敏感性表现出明显的随龄变化特征。在各个消化时期，老年大鼠染色质DNase I消化率显著低于青年鼠。
图3 青年、老年大鼠下丘脑、垂体神经细胞核DNase I消化动力学曲线
三、下丘脑、垂体细胞核染色质DNase I酶解产物电泳分析及核小体构象特征
图4为青年大鼠和老年大鼠下丘脑、垂体神经细胞核染色质DNase I消化20 min，酶解产物的电泳分析图谱。显示染色质DNA均存在间隔规律的DNase I识别和剪切位点。以老年大鼠下丘脑为例，以其各区带碱基对的对数值对相应区带相对迁移率作图(图5)，显示各区带分子量以10倍值递增,染色质DNA每隔10个核苷酸序列具有DNase I的作用位点,提示下丘脑、垂体神经细胞染色质DNA主要以B型双股螺旋构象形式存在〔6〕。
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图4 DNase I消化下丘脑、垂体染色质DNA产物的垂直平板电泳图谱
图5 DNase I消化老年大鼠下丘脑染色质DNA片段碱基对数与其相对迁移率的关系曲线
讨 论
MCN和DNase I是近年来研究染色质构象应用得最多的核酸内切酶，一般认为MCN能优先酶切核小体间连接DNA，产生单核小体及其寡聚体；而DNase I对染色质构象特征的识别作用为在30 nm染色质纤维构象中识别螺线管亚单位二核小体(dinucleosome)；在核小体DNA内部剪切下10 bp的片段及其多聚体，识别DNA双股螺旋的卷曲特征；优先酶解活性染色质〔7〕。本研究结果显示，MCN酶解下丘脑及垂体神经细胞核染色质，核小体单位DNA长度分别保持在190 bp和170 bp水平上，存在明显的组织差异，未发现有年龄相关性变化。由于各年龄组大鼠下丘脑、垂体核小体核心颗粒DNA均为140 bp，说明核小体间连接DNA长度与脑老化神经功能状态无明显联系，其原因可能与脑老化中染色质组蛋白组成的高度保守性有关〔8〕。
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DNase I酶解青年大鼠和老年大鼠下丘脑、垂体神经细胞核染色质DNA，其产物电泳图谱区带分子量均表现为以10倍值递增的B型双螺旋构象特征。但进一步的实验结果表明，老年大鼠较青年大鼠对DNase I消化敏感性降低，表明衰老导致染色质构象发生了不利于DNase I分子接近的变化，掩盖了部分活性染色质区域，这将有可能影响RNA聚合酶转录染色质模板，进而抑制基因表达〔9〕。这一结果在染色质构象上为探讨生物细胞衰老的分子机制提供了线索。
基金项目：国家自然科学基金资助(39570353)
彭家和(第三军医大学生物化学与分子生物学教研室 重庆市，400038)
邱平(第三军医大学生物化学与分子生物学教研室 重庆市，400038)
茆象千(第三军医大学生物化学与分子生物学教研室 重庆市，400038)
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1，Dai X, Greizerstein WB, Chinnik N. Supercoil-induced extraction of regulatory DNA hairpin. Proc Natl Acad Sci, 1997,94:2174-2179.
2，Lauvent WC, Ngo S, Danchin A. Role of eschericha coil histone-like nucleoid structuring protein in becterial metabolism and stress respone identification of targets by two-dimensional electrophoresis. Eur J Biochem, 1997,244:767-773.
3，茆象千，彭家和，邱平.大鼠老化过程小脑神经元染色质核小体线性和空间排布特征分析.中国生物化学与分子生物学报,1999，15:188-191.
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4，Noll M, Kornbery RD. Action of micrococcal nuclease on chromatin and the location of histone H1. J Mol Biol, 1977,109:393-404.
5，Maniatis T, Jeffrey A, Desande HV. Chain length determination of small double and single-stranded DNA molecules by polyacrylamide gel electrophoresis. Biochemistry, 1975,14:3787-3794.
6，Kornberg RD. Structure of chromatin. Ann Kev Biochem, 1997,46:931-951.
7，Staynov DZ, Progkova YG. Quantitative analysis of DNase I digestion patters of oligo-and polynucleosomes, J Mol Biol, 1998,279:59-71.
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8，An W, Van Holde K, Zlatanova J. Linker histone protection of chromatosomes reconstituted on 5s rDNA from Xenopus horealis: a reinvestigation. Nucleic Acids Res, 1998,26:4042-4046.
9，Chaturvedi MM, Kanungo MS. Analysis of conformation and function of the chromatin of the brain of young and old rats. Mol Biol Rep, 1985,10:215-219., http://www.100md.com