抗菌肽MagaininⅡ单链抗体基因的构建及其表达
抗菌肽MagaininⅡ单链抗体基因的构建及其表达
胡泰山 陈海旭 杨运桂 钱友存 陈登鸿 屈贤铭 杨胜利
摘 要：目的 将克隆的抗体轻重链可变区基因拼接成单链抗体基因并将其在大肠杆菌中表达。方法 通过RT—PCR从两株抗MagaininⅡ杂交瘤细胞株(2D1，3F8)中克隆出VH和VL基因，然后利用重组PCR技术，将VH和VL基因通过柔性肽段(GLY4Ser)3的Linker拼接成单链抗体基因(ScFv)，将ScFv克隆到表达载体pCANTAB5E上并将其分别在大肠杆菌E.coliHB2151及TG1中进行表达。结果 SDS-PAGE和Western-blot分析表明，ScFv在大肠杆菌E.coliHB2151中得到了分泌表达。间接ELISA结果显示可溶性ScFv及其表面展示噬菌体均具有抗原结合活性。结论 成功地获得了ScFv-2D1和ScFv-3F8基因并在大肠杆菌中得到了功能性表达，为新型抗菌肽的设计打下了基础。
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关键词：MagaininⅡ；重组PCR；单链抗体；分泌表达；噬菌体表面展示
Magainins是1987年由Zasloff从非洲爪蟾的皮肤中分离出来的一类碱性无半胱氨酸的多肽，具有广谱杀菌效果，可以作用于革兰氏阴性、阳性菌、真菌、原虫、病毒甚至癌细胞〔1-3〕，目前已成为新型抗菌药物设计的焦点。为此，我们实验室也相继开展了相关项目的研究，立足于抗原一抗体的相互作用来设计新型抗菌肽。目前，我们已经得到了4株抗MagaininⅡ的单克隆抗体(mAb)，并完成了抗体基因的克隆，本文将获得的针对不同表位的两株mAb的轻、重链可变区基因，通过重组PCR拼接成单链抗体(ScFv)，并成功地在大肠杆菌中进行了功能性表达。
1材料和方法
1.1材料 抗MagaininⅡ的鼠杂交瘤细胞株2D1及3F8为本实验室制备。表达菌株E.coliHB2151为中国科学院上海生物工程研究中心陈常庆教授惠赠。表达载体pCANTAB5E为第四军医大学生物化学与分子生物学教研室牛利国博士赠送。pGEM-Tvector，限制性内切酶，T4DNA连接酶和M-MLV反转录酶均为Promega产品。TaqDNA聚合酶为Sangon公司产品。HRP标记的羊抗鼠IgG多抗为华美公司产品。anti-E-tagantibody为pharmacia公司产品。RNA抽提试剂Trizol及柱离心式胶回收试剂盒，为上海华顺生物工程公司产品。引物由Sangon公司合成，其序列如下：
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引物A(VHBACK):
5′-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTS-
SfiIMARCTGGTGSAGTCWGG3′
[S:G,C;M:A,C;R:A,G;W:A,T]；
引物B(VHFOR):
5′-GGAGCCGCCGCCGCCAGAACCACCACCACCTGAAACAGT-
GGTCCCTTGGCC3′;
引物C(VκBACK):
5′-GGCGCCGCCGCCTCCGGTGGTGGTGGTTCTATCGTGATGA-
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CCCAGTCT3′;
引物D(VκFOR):
5′-GAGTCATTCTGCGGCCGCCCGTTTG(T)ATT(C)TCCAGCT-
NotI
TGGTCCC3′.
1.2方法
1.2.1总RNA的抽提及cDNA第1链的合成 取107左右对数生长期的2D1和3F8杂交瘤细胞，加入1mLTrizol裂解液，彻底匀浆后，室温放置5min，加200μL氯仿，室温放5min，4℃高速离心10min，吸取上层水相，加入500μL异丙醇，室温放置10～30min，4℃高速离心10min，用1mL750ml/L乙醇洗涤沉淀，干燥，用DEPC处理的ddH2O溶解，于-70℃保存。取10μg总RNA和1μg引物B或D混合，加DEPC处理的ddH2O至15μL，70℃5min破坏RNA的二级结构。迅速置于冰上,加5×RT缓冲液，0.5mmol/LdNTP，20URNasin和200UM-MLV反转录酶，再加水至25μL，42℃温育1h，于95℃5min灭活反转录酶。
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1.2.2VH和VL基因的扩增及ScFv的构建 取2μL反转录cDNA，加10μL10×PCRbuffer，8μL2.5mmol/LdNTP,引物A、B各1μg(扩增VH)或C、D各1μg(扩增VL)，2.5UTaqDNA聚合酶，加ddH2O至100μL。PCR反应条件为：94℃5min，然后94℃lmin，55℃2min，72℃lmin共进行30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物经20g/Lagarose电泳，胶回收纯化后，以重组PCR技术将VH和VL拼接成ScFv。各取0.1μg的VH和VL，10μL10×PCRbuffer，8μL2.5mmol/LdNTP和2.5UTaqDNA聚合酶,加ddH2O至100μL。PCR反应条件为：94℃5min，然后94℃1min，60℃lmin，72℃lmin。4个循环后，加入引物A和D各1μg，再继续PCR反应至30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物经10g/Lagarose电泳、胶回收试剂盒回收纯化后，4℃连接于pGEM-TVector,转化E.coliDH5α，蓝白颜色筛选后，挑阳性菌落培养，提取质粒，进行PCR并用SfiI/NotI双酶切鉴定及测序。
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1.2.3DNA序列测定DNA测序 是以M13通用引物，在ABI373自动DNA测序仪上进行。
1.2.4ScFv基因的表达对测序 正确的克隆培养后抽提质粒，再经双酶切回收ScFv基因与经同样双酶切回收的pCANTAB5E载体相连接，转化E.coliHB2151和TG1。挑取鉴定正确的克隆，将其接种于3mL2×YT培养基中30℃培养过夜。ScFv的可溶性分泌表达按如下程序进行：以1%接种量将过夜培养的HB2151接种到200mL2×YT(含20g/Lglucose,100mg/LAmp)的培养基中，30℃培养至A600为0.8左右，以5000r/min的离心15min。弃上清，用200mL2×YT(含1mmol/LIPTG及100mg/LAmp)的培养基悬浮，37℃诱导4h。再以5000r/min离心15min，取沉淀，用预冷的4mLSolutionI(20mmol/LTris-HCLpH8.0,2.5mmol/LEDTA和20%Sucrose)悬浮,放冰上5min。以5000r/min离心10min去上清,再将沉淀用预冷的SolutionⅡ(20mmol/LTris-HCLpH8.0和2.5mmol/LEDTA)悬浮，放冰上15min。以12000r/min离心10min，取上清，即为外周质部分，于-20℃保存。
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ScFv表面展示噬菌体的制备按如下步骤进行：将过夜培养的E.coliTG1按1%接种到3mL2×YT(含20g/Lglucose和100mg/LAmp)培养基中，培养至A600达0.5左右，离心，将菌体重悬于3mL(含100mg/LAmp)的2×YT培养基中，并加入108左右的辅助噬菌体M13K07，继续培养1h。加入终浓度为50mg/L的卡那霉素，继续培养过夜，离心、取上清，加入1/5体积的200g/LPEG/2.5mol/LNaCl溶液，4℃沉淀5h，离心。用300μL0.01mol/LPBS(pH7.4)悬浮，高速离心去除细菌碎片，于4℃保存。
1.2.5ScFv基因表达产物的鉴定 采用120g/LSDS-PAGE及Westernblot进行鉴定，二抗为鼠抗E-tagmAb。
1.2.6ScFv抗原结合活性的测定 ScFv抗原结合活性的测定采用间接ELISA法。以MagaininⅡ(10mg/L)包被酶标板，一抗为可溶性ScFv或ScFv表面展示噬菌体，二抗为鼠抗E-tagmAb或HRP标记的鼠抗M13mAb。阴性对照为未诱导样品，阳性对照为自制的相应mAb，PBS溶液为空白对照。
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2结果
2.1ScFv基因的拼接和组装 利用RT-PCR从两个杂交瘤细胞株中扩增出VH和VL基因，其大小为350bp左右。以重组PCR将VH和VL基因通过一个柔性linker拼接成ScFv基因后，电泳结果显示，其大小为750bp左右(图1)。
图1ScFv基因片段的琼脂糖凝胶电泳分析
Fig1AnalysisofScFvgenefragmentsbyagarosegel
electrophoresis
M:pGEMDNAmarkerfragments(Promega)；1:ScFv-2D1gene;
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2:ScFv-3F8gene.
2.2ScFv基因的序列测定序列测定 结果见图2。ScFv2D1基因的长度为771bp，而ScFv3F8基因的长度为792bp，组成ScFv的VH与VL基因和我们以前基因克隆的序列相一致。VH基因在上游，VL基因在下游，中间为柔性linker的序列。此外，在基因的两端分别引入了SfiI和NotI的酶切位点。
2.3ScFv在大肠杆菌中的表达 ScFv在E.coliHB2151中与E-tag形成可溶性融合蛋白。E-tag作为蛋白标签可以通过鼠抗E-tag抗体来检测ScFv的表达。从图3可以看出，以1mmol/LIPTG诱导4h后，在相对分子量(Mr)为29×103左右有1条明显的蛋白带出现，而且该蛋白表达后被分泌到胞间隙中。利用抽提的外周质蛋白进行的Westernblot分析表明，此蛋白可以和抗E-tag抗体特异结合(图4)。
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图2ScFv的核苷酸及推导的氨基酸序列
Fig2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of ScFv
A:Sequences of ScFv-2D1 gene;B:Nucleotide and deduced amino acid
sequences of ScFv-3F8gene
Primer sequences were indicated by bold-face,linker sequences were underlined.
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图3ScFv表达的SDS-PAGE分析
Fig3 Analysis of ScFv expression by SDS-PAGE
1:Uninduced E.coli HB2151(pCANTAB5E);2:E.coli HB 2151(pCANTAB5E-ScFv-3F8)induced by IPTG;3:E.coli HB 2151(pCANTAB5E-ScFv-2D1)induced by IPTG;4:Proteins in periplasmic space of E.coli HB 2151(pCANTAB5E-ScFv-3F8)after induction;5:Proteins in periplasmics pace of E.coli HB 2151(pCANTAB5E-ScFv-2D1)after induction;M:Protein marker(Mr×103).
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2.4ScFv的抗原结合活性 间接ELISA测定结果表明，表达的可溶性ScFv及ScFv表面展示噬菌物均有较好的抗原结合活性(表1)。
图4大肠杆菌HB2151外周质间隙中表达蛋白的免疫印迹
分析
Fig4 Analysis of prote in sinperiplasmic space of E.coli HB2151 by Western blot
1:Uninduced sample;2:Proteins in periplasmic space of E.coli HB2151(pCANTAB5E-ScFv-3F8);3:Proteins in periplasmic space of E.coli HB2151(pCANTAB5E-ScFv-2D1).
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表1ScFv抗原结合活性的间接ELISA测定
Tab1 Determination of antigenic binding activity of ScFvby
indirect ELISA (A492nm)
Sample
2D1
3F8
Negative control
0.05
Positive control
2.25
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Soluble ScFv
0.68
0.76
Phage displayed ScFv
0.46
0.52
3讨论
自基因工程抗体技术创建以来，对功能性抗体片段尤其是单链抗体的研究越来越受到重视。单链抗体是许多功能性抗体分子如免疫毒素、双链抗体和胞内抗体等结构的基础〔4-6〕。尤其是近年来抗体库技术的出现，更拓宽了单链抗体的应用范围，利用ScFv噬菌体抗体库甚至可不经免疫来制备抗体或进行抗体的人源化改造〔7,8〕。此外，利用噬菌体可方便地对抗原—抗体的相互作用进行研究，从而对抗体或抗原进行定向诱变，由于单链抗体不需要糖基化，因此可用大肠杆菌表达系统来表达。表达方式有胞浆内表达和分泌表达两种，但胞浆内表达常形成不溶性的包涵体，给后续纯化工作带来不便，而分泌表达则有利于蛋白折叠，二硫键的形成及异源二聚体的组装，同时还可减少胞内蛋白酶对表达产物的降解〔9〕。
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我们通过RT-RCR从两株杂交瘤细胞株2D1和3F8中，克隆出抗体的轻重链可变区基因。PCR引物的设计参照Clackson等(1991)〔10〕设计的引物，并根据抗体可变区基因的框架而设计，5′端引物与FR1互补，3′端引物与FR4互补。为了保证扩增的有效性，在引物3′端的适当位置上掺入了混合碱基，在引物B和C的5′端为linker序列，可使重组PCR在两个片段而不是通常的3个片段之间进行，而提高基因拼接的效率。
ScFv的表达采用Pharmacia公司的噬菌粒载体pCANTAB5E。该载体使用的启动子为Lac启动子。此外，还含有gⅢ蛋白信号肽序列，从而可引导融合蛋白分泌到外周质中。在多克隆位点与gⅢ蛋白编码区之间，有1个E-tag序列和琥珀终止密码子(TAG)，在不含琥珀抑制基因的菌株(如HB2151)中，多肽链的翻译终止于E-tag，从而形成可溶性的ScFv-E-tag融合蛋白分泌到外周质中，在含有琥珀抑制基因的菌株(如TG1)中，多肽链的翻译不会终止于TAG，从而与gⅢ蛋白融合，在辅助噬菌体的超感染下可将ScFv展示于噬菌体的表面。实验结果表明，我们制备的可溶性ScFv及其表面展示噬菌体有很好的抗原结合活性，为下一步的工作打下了基础。
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基金项目：国家高技术研究发展计划项目资助，No.101-01-0203
作者简介：胡泰山，男，32岁，博士生
胡泰山(中国科学院上海生物工程研究中心，上海 200233)
陈海旭(中国科学院上海生物工程研究中心，上海 200233)
杨运桂(中国科学院上海生物工程研究中心，上海 200233)
钱友存(中国科学院上海生物工程研究中心，上海 200233)
陈登鸿(中国科学院上海生物工程研究中心，上海 200233)
屈贤铭(中国科学院上海生物工程研究中心，上海 200233)
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杨胜利(中国科学院上海生物工程研究中心，上海 200233)
参考文献：
[1]Zasloff M.Magainins，a class of antimicrobial peptides from Xenopus skin isolation，characterization of two active forms，and partial cDNA sequence of a precursor[J].Proc Natl Acad Sci USA，1987；84：5449-5455.
[2]Zasloff M，Martin V，Chen HC.Antimicrobial activity of synthetic magainin peptides and several analogues[J].Proc Natl Acad Sci USA，1988；85：910-913.
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[3]Jacob L,Zasloff M.Potential therapeutic applications of magainins and other antimicrobial agents of animal origin[M].in：Goode J，ed.Antibacterial Peptides.Ciba Fundation Symposium 186.Chichester：Wiley,1994：197-223.
[4]Chaudhary VK,Queen C,Junghans RP,et al.A recombinant immunotoxin consisting of two antibody variable domains fused to Pseudommonas exotoxin[J].Nature,1989;339:394-397.
[5]netter M,Chang CP,Robinson RR,et al.Escherichia coli secretion of an active chimerric antibody fragment[J].Science,1988;240:1041-1043.
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[6]Holliger P,Prospero T,Winter G."Diabodies":small bivalent and bispecific antibody fragments[J].Proc Natl Acad Sci USA,1993;90:6444-6448.
[7]Marks JD,Griffiths AD,Malmpvist M,et al.By-passing immunisation:building high affinity human antibodies by chain shuffling[J].Bio Technol,1992;10:779-783.
[8]Jespers LS,Roberts A,Mahler SM,et al.Guiding the selection of human antibodies from phage display repertoires to a single epitope of an antigen[J].Bio/Technol,1994;12:899-903.
[9]Richardson JH,Marasco WA.Intracellular antibodies:development and therapeutic potential[J].Trends Biotechnol,1995;13:306-310.
[10]Clackson T,hoogenboom HR,Griffiths AD,et al.Making antibody fragments using phage display libraries[J].Nature,1991;352:624-628., http://www.100md.com
胡泰山 陈海旭 杨运桂 钱友存 陈登鸿 屈贤铭 杨胜利
摘 要：目的 将克隆的抗体轻重链可变区基因拼接成单链抗体基因并将其在大肠杆菌中表达。方法 通过RT—PCR从两株抗MagaininⅡ杂交瘤细胞株(2D1，3F8)中克隆出VH和VL基因，然后利用重组PCR技术，将VH和VL基因通过柔性肽段(GLY4Ser)3的Linker拼接成单链抗体基因(ScFv)，将ScFv克隆到表达载体pCANTAB5E上并将其分别在大肠杆菌E.coliHB2151及TG1中进行表达。结果 SDS-PAGE和Western-blot分析表明，ScFv在大肠杆菌E.coliHB2151中得到了分泌表达。间接ELISA结果显示可溶性ScFv及其表面展示噬菌体均具有抗原结合活性。结论 成功地获得了ScFv-2D1和ScFv-3F8基因并在大肠杆菌中得到了功能性表达，为新型抗菌肽的设计打下了基础。
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关键词：MagaininⅡ；重组PCR；单链抗体；分泌表达；噬菌体表面展示
Magainins是1987年由Zasloff从非洲爪蟾的皮肤中分离出来的一类碱性无半胱氨酸的多肽，具有广谱杀菌效果，可以作用于革兰氏阴性、阳性菌、真菌、原虫、病毒甚至癌细胞〔1-3〕，目前已成为新型抗菌药物设计的焦点。为此，我们实验室也相继开展了相关项目的研究，立足于抗原一抗体的相互作用来设计新型抗菌肽。目前，我们已经得到了4株抗MagaininⅡ的单克隆抗体(mAb)，并完成了抗体基因的克隆，本文将获得的针对不同表位的两株mAb的轻、重链可变区基因，通过重组PCR拼接成单链抗体(ScFv)，并成功地在大肠杆菌中进行了功能性表达。
1材料和方法
1.1材料 抗MagaininⅡ的鼠杂交瘤细胞株2D1及3F8为本实验室制备。表达菌株E.coliHB2151为中国科学院上海生物工程研究中心陈常庆教授惠赠。表达载体pCANTAB5E为第四军医大学生物化学与分子生物学教研室牛利国博士赠送。pGEM-Tvector，限制性内切酶，T4DNA连接酶和M-MLV反转录酶均为Promega产品。TaqDNA聚合酶为Sangon公司产品。HRP标记的羊抗鼠IgG多抗为华美公司产品。anti-E-tagantibody为pharmacia公司产品。RNA抽提试剂Trizol及柱离心式胶回收试剂盒，为上海华顺生物工程公司产品。引物由Sangon公司合成，其序列如下：
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引物A(VHBACK):
5′-GTCCTCGCAACTGCGGCCCAGCCGGCCATGGCCCAGGTS-
SfiIMARCTGGTGSAGTCWGG3′
[S:G,C;M:A,C;R:A,G;W:A,T]；
引物B(VHFOR):
5′-GGAGCCGCCGCCGCCAGAACCACCACCACCTGAAACAGT-
GGTCCCTTGGCC3′;
引物C(VκBACK):
5′-GGCGCCGCCGCCTCCGGTGGTGGTGGTTCTATCGTGATGA-
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CCCAGTCT3′;
引物D(VκFOR):
5′-GAGTCATTCTGCGGCCGCCCGTTTG(T)ATT(C)TCCAGCT-
NotI
TGGTCCC3′.
1.2方法
1.2.1总RNA的抽提及cDNA第1链的合成 取107左右对数生长期的2D1和3F8杂交瘤细胞，加入1mLTrizol裂解液，彻底匀浆后，室温放置5min，加200μL氯仿，室温放5min，4℃高速离心10min，吸取上层水相，加入500μL异丙醇，室温放置10～30min，4℃高速离心10min，用1mL750ml/L乙醇洗涤沉淀，干燥，用DEPC处理的ddH2O溶解，于-70℃保存。取10μg总RNA和1μg引物B或D混合，加DEPC处理的ddH2O至15μL，70℃5min破坏RNA的二级结构。迅速置于冰上,加5×RT缓冲液，0.5mmol/LdNTP，20URNasin和200UM-MLV反转录酶，再加水至25μL，42℃温育1h，于95℃5min灭活反转录酶。
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1.2.2VH和VL基因的扩增及ScFv的构建 取2μL反转录cDNA，加10μL10×PCRbuffer，8μL2.5mmol/LdNTP,引物A、B各1μg(扩增VH)或C、D各1μg(扩增VL)，2.5UTaqDNA聚合酶，加ddH2O至100μL。PCR反应条件为：94℃5min，然后94℃lmin，55℃2min，72℃lmin共进行30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物经20g/Lagarose电泳，胶回收纯化后，以重组PCR技术将VH和VL拼接成ScFv。各取0.1μg的VH和VL，10μL10×PCRbuffer，8μL2.5mmol/LdNTP和2.5UTaqDNA聚合酶,加ddH2O至100μL。PCR反应条件为：94℃5min，然后94℃1min，60℃lmin，72℃lmin。4个循环后，加入引物A和D各1μg，再继续PCR反应至30个循环，最后72℃延伸10min。PCR产物经10g/Lagarose电泳、胶回收试剂盒回收纯化后，4℃连接于pGEM-TVector,转化E.coliDH5α，蓝白颜色筛选后，挑阳性菌落培养，提取质粒，进行PCR并用SfiI/NotI双酶切鉴定及测序。
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1.2.3DNA序列测定DNA测序 是以M13通用引物，在ABI373自动DNA测序仪上进行。
1.2.4ScFv基因的表达对测序 正确的克隆培养后抽提质粒，再经双酶切回收ScFv基因与经同样双酶切回收的pCANTAB5E载体相连接，转化E.coliHB2151和TG1。挑取鉴定正确的克隆，将其接种于3mL2×YT培养基中30℃培养过夜。ScFv的可溶性分泌表达按如下程序进行：以1%接种量将过夜培养的HB2151接种到200mL2×YT(含20g/Lglucose,100mg/LAmp)的培养基中，30℃培养至A600为0.8左右，以5000r/min的离心15min。弃上清，用200mL2×YT(含1mmol/LIPTG及100mg/LAmp)的培养基悬浮，37℃诱导4h。再以5000r/min离心15min，取沉淀，用预冷的4mLSolutionI(20mmol/LTris-HCLpH8.0,2.5mmol/LEDTA和20%Sucrose)悬浮,放冰上5min。以5000r/min离心10min去上清,再将沉淀用预冷的SolutionⅡ(20mmol/LTris-HCLpH8.0和2.5mmol/LEDTA)悬浮，放冰上15min。以12000r/min离心10min，取上清，即为外周质部分，于-20℃保存。
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ScFv表面展示噬菌体的制备按如下步骤进行：将过夜培养的E.coliTG1按1%接种到3mL2×YT(含20g/Lglucose和100mg/LAmp)培养基中，培养至A600达0.5左右，离心，将菌体重悬于3mL(含100mg/LAmp)的2×YT培养基中，并加入108左右的辅助噬菌体M13K07，继续培养1h。加入终浓度为50mg/L的卡那霉素，继续培养过夜，离心、取上清，加入1/5体积的200g/LPEG/2.5mol/LNaCl溶液，4℃沉淀5h，离心。用300μL0.01mol/LPBS(pH7.4)悬浮，高速离心去除细菌碎片，于4℃保存。
1.2.5ScFv基因表达产物的鉴定 采用120g/LSDS-PAGE及Westernblot进行鉴定，二抗为鼠抗E-tagmAb。
1.2.6ScFv抗原结合活性的测定 ScFv抗原结合活性的测定采用间接ELISA法。以MagaininⅡ(10mg/L)包被酶标板，一抗为可溶性ScFv或ScFv表面展示噬菌体，二抗为鼠抗E-tagmAb或HRP标记的鼠抗M13mAb。阴性对照为未诱导样品，阳性对照为自制的相应mAb，PBS溶液为空白对照。
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2结果
2.1ScFv基因的拼接和组装 利用RT-PCR从两个杂交瘤细胞株中扩增出VH和VL基因，其大小为350bp左右。以重组PCR将VH和VL基因通过一个柔性linker拼接成ScFv基因后，电泳结果显示，其大小为750bp左右(图1)。
图1ScFv基因片段的琼脂糖凝胶电泳分析
Fig1AnalysisofScFvgenefragmentsbyagarosegel
electrophoresis
M:pGEMDNAmarkerfragments(Promega)；1:ScFv-2D1gene;
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2:ScFv-3F8gene.
2.2ScFv基因的序列测定序列测定 结果见图2。ScFv2D1基因的长度为771bp，而ScFv3F8基因的长度为792bp，组成ScFv的VH与VL基因和我们以前基因克隆的序列相一致。VH基因在上游，VL基因在下游，中间为柔性linker的序列。此外，在基因的两端分别引入了SfiI和NotI的酶切位点。
2.3ScFv在大肠杆菌中的表达 ScFv在E.coliHB2151中与E-tag形成可溶性融合蛋白。E-tag作为蛋白标签可以通过鼠抗E-tag抗体来检测ScFv的表达。从图3可以看出，以1mmol/LIPTG诱导4h后，在相对分子量(Mr)为29×103左右有1条明显的蛋白带出现，而且该蛋白表达后被分泌到胞间隙中。利用抽提的外周质蛋白进行的Westernblot分析表明，此蛋白可以和抗E-tag抗体特异结合(图4)。
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图2ScFv的核苷酸及推导的氨基酸序列
Fig2 Nucleotide and deduced amino acid sequences of ScFv
A:Sequences of ScFv-2D1 gene;B:Nucleotide and deduced amino acid
sequences of ScFv-3F8gene
Primer sequences were indicated by bold-face,linker sequences were underlined.
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图3ScFv表达的SDS-PAGE分析
Fig3 Analysis of ScFv expression by SDS-PAGE
1:Uninduced E.coli HB2151(pCANTAB5E);2:E.coli HB 2151(pCANTAB5E-ScFv-3F8)induced by IPTG;3:E.coli HB 2151(pCANTAB5E-ScFv-2D1)induced by IPTG;4:Proteins in periplasmic space of E.coli HB 2151(pCANTAB5E-ScFv-3F8)after induction;5:Proteins in periplasmics pace of E.coli HB 2151(pCANTAB5E-ScFv-2D1)after induction;M:Protein marker(Mr×103).
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2.4ScFv的抗原结合活性 间接ELISA测定结果表明，表达的可溶性ScFv及ScFv表面展示噬菌物均有较好的抗原结合活性(表1)。
图4大肠杆菌HB2151外周质间隙中表达蛋白的免疫印迹
分析
Fig4 Analysis of prote in sinperiplasmic space of E.coli HB2151 by Western blot
1:Uninduced sample;2:Proteins in periplasmic space of E.coli HB2151(pCANTAB5E-ScFv-3F8);3:Proteins in periplasmic space of E.coli HB2151(pCANTAB5E-ScFv-2D1).
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表1ScFv抗原结合活性的间接ELISA测定
Tab1 Determination of antigenic binding activity of ScFvby
indirect ELISA (A492nm)
Sample
2D1
3F8
Negative control
0.05
Positive control
2.25
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Soluble ScFv
0.68
0.76
Phage displayed ScFv
0.46
0.52
3讨论
自基因工程抗体技术创建以来，对功能性抗体片段尤其是单链抗体的研究越来越受到重视。单链抗体是许多功能性抗体分子如免疫毒素、双链抗体和胞内抗体等结构的基础〔4-6〕。尤其是近年来抗体库技术的出现，更拓宽了单链抗体的应用范围，利用ScFv噬菌体抗体库甚至可不经免疫来制备抗体或进行抗体的人源化改造〔7,8〕。此外，利用噬菌体可方便地对抗原—抗体的相互作用进行研究，从而对抗体或抗原进行定向诱变，由于单链抗体不需要糖基化，因此可用大肠杆菌表达系统来表达。表达方式有胞浆内表达和分泌表达两种，但胞浆内表达常形成不溶性的包涵体，给后续纯化工作带来不便，而分泌表达则有利于蛋白折叠，二硫键的形成及异源二聚体的组装，同时还可减少胞内蛋白酶对表达产物的降解〔9〕。
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我们通过RT-RCR从两株杂交瘤细胞株2D1和3F8中，克隆出抗体的轻重链可变区基因。PCR引物的设计参照Clackson等(1991)〔10〕设计的引物，并根据抗体可变区基因的框架而设计，5′端引物与FR1互补，3′端引物与FR4互补。为了保证扩增的有效性，在引物3′端的适当位置上掺入了混合碱基，在引物B和C的5′端为linker序列，可使重组PCR在两个片段而不是通常的3个片段之间进行，而提高基因拼接的效率。
ScFv的表达采用Pharmacia公司的噬菌粒载体pCANTAB5E。该载体使用的启动子为Lac启动子。此外，还含有gⅢ蛋白信号肽序列，从而可引导融合蛋白分泌到外周质中。在多克隆位点与gⅢ蛋白编码区之间，有1个E-tag序列和琥珀终止密码子(TAG)，在不含琥珀抑制基因的菌株(如HB2151)中，多肽链的翻译终止于E-tag，从而形成可溶性的ScFv-E-tag融合蛋白分泌到外周质中，在含有琥珀抑制基因的菌株(如TG1)中，多肽链的翻译不会终止于TAG，从而与gⅢ蛋白融合，在辅助噬菌体的超感染下可将ScFv展示于噬菌体的表面。实验结果表明，我们制备的可溶性ScFv及其表面展示噬菌体有很好的抗原结合活性，为下一步的工作打下了基础。
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基金项目：国家高技术研究发展计划项目资助，No.101-01-0203
作者简介：胡泰山，男，32岁，博士生
胡泰山(中国科学院上海生物工程研究中心，上海 200233)
陈海旭(中国科学院上海生物工程研究中心，上海 200233)
杨运桂(中国科学院上海生物工程研究中心，上海 200233)
钱友存(中国科学院上海生物工程研究中心，上海 200233)
陈登鸿(中国科学院上海生物工程研究中心，上海 200233)
屈贤铭(中国科学院上海生物工程研究中心，上海 200233)
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杨胜利(中国科学院上海生物工程研究中心，上海 200233)
参考文献：
[1]Zasloff M.Magainins，a class of antimicrobial peptides from Xenopus skin isolation，characterization of two active forms，and partial cDNA sequence of a precursor[J].Proc Natl Acad Sci USA，1987；84：5449-5455.
[2]Zasloff M，Martin V，Chen HC.Antimicrobial activity of synthetic magainin peptides and several analogues[J].Proc Natl Acad Sci USA，1988；85：910-913.
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[3]Jacob L,Zasloff M.Potential therapeutic applications of magainins and other antimicrobial agents of animal origin[M].in：Goode J，ed.Antibacterial Peptides.Ciba Fundation Symposium 186.Chichester：Wiley,1994：197-223.
[4]Chaudhary VK,Queen C,Junghans RP,et al.A recombinant immunotoxin consisting of two antibody variable domains fused to Pseudommonas exotoxin[J].Nature,1989;339:394-397.
[5]netter M,Chang CP,Robinson RR,et al.Escherichia coli secretion of an active chimerric antibody fragment[J].Science,1988;240:1041-1043.
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[6]Holliger P,Prospero T,Winter G."Diabodies":small bivalent and bispecific antibody fragments[J].Proc Natl Acad Sci USA,1993;90:6444-6448.
[7]Marks JD,Griffiths AD,Malmpvist M,et al.By-passing immunisation:building high affinity human antibodies by chain shuffling[J].Bio Technol,1992;10:779-783.
[8]Jespers LS,Roberts A,Mahler SM,et al.Guiding the selection of human antibodies from phage display repertoires to a single epitope of an antigen[J].Bio/Technol,1994;12:899-903.
[9]Richardson JH,Marasco WA.Intracellular antibodies:development and therapeutic potential[J].Trends Biotechnol,1995;13:306-310.
[10]Clackson T,hoogenboom HR,Griffiths AD,et al.Making antibody fragments using phage display libraries[J].Nature,1991;352:624-628., http://www.100md.com