阿霉素诱导人卵巢癌细胞凋亡和周期特异性的实验研究
阿霉素诱导人卵巢癌细胞凋亡和周期特异性的实验研究
李佳平 唐良萏 周洪贵 卞度宏
摘 要 目的：探讨阿霉素诱导卵巢癌细胞凋亡的规律。方法：以不同浓度的阿霉素作用于人卵巢癌细胞株SKOV3，用光镜、电镜、TUNEL法和DNA凝胶电泳法检测确定细胞凋亡，以流式细胞仪定量分析凋亡和细胞周期特异性。结果：大剂量(25～100μg/ml)长时间(3～72h)的阿霉素作用可引起卵巢癌细胞坏死和凋亡，较小剂量(0.5μg/ml)的阿霉素连续作用24、48、72h，诱导细胞凋亡发生率分别为40.01%、65.38%和77.65%，并使细胞发生G1期阻滞。结论：阿霉素能导致卵巢癌细胞DNA损伤，发生G1期阻滞并诱导凋亡是其抗肿瘤的机制之一。
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关键词：阿霉素；卵巢肿瘤；细胞凋亡；流式细胞术
细胞凋亡与肿瘤的发生、消退以及放、化疗密切相关。通过诱导肿瘤细胞凋亡，对进一步探讨肿瘤发病机理及其防治具有十分重要的意义。目前，国内外对白血病和实体瘤的凋亡研究较多，对卵巢癌主要采用以顺铂和紫杉醇诱导肿瘤细胞凋亡[1-4]，而用阿霉素诱导卵巢癌细胞凋亡的研究较少。我们以阿霉素作用于人卵巢癌SKOV3细胞，探讨其诱导肿瘤细胞凋亡的规律和药物作用的机理，以冀深入开展凋亡相关基因和耐药关系的研究。
1 材料与方法
1.1 卵巢癌细胞系 SKOV3卵巢癌细胞株由北京医科大学提供，来自美国Memorial Sloan Kettering Cancer Center，为人类卵巢浆液性乳头状囊腺癌，细胞在含HEPS 25 mmol/L， 谷氨酰胺2 mmol/L，青霉素100 IU/ml，链霉素100 IU/ml和10%灭活小牛血清的RPMI 1640完全培养基中(Gibco/Brl 公司)培养。
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1.2 DNA提取及凝胶琼糖电泳[5] 收集经药物作用的106个细胞，经裂解后用蛋白酶K(Boehriger Manheim 德国)消化，饱和酚(promega)：氯仿：异丙醇(25：24：1)抽提，TE溶液(10mmol/L Tris-HCL pH7.4， 1mmol/L EDTA pH8.0)溶解，提取的DNA以RNA酶5mg/L作用1h，在含有0.5μg/ml溴化乙啶的1.2%琼脂糖凝胶中，电泳1.5h，DNA标准用EcoRI/HindIII(promega)，紫外灯下观察。
1.3 光镜观察形态学改变 细胞接种在放有已消毒盖玻片的培养皿中培养，待细胞生长至对数生长期，分别换入由培养基配制的不同浓度的阿霉素(Farmitralial,Italy)培养液，定时镜下观察。
1.3.1 倒置显微镜下直接观察。
1.3.2 普通光镜观察 取经药物作用后的载玻片，1：3冰醋酸：甲醇固定30min，常规HE染色，镜下观察。
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1.4 末端脱氧核糖转移酶介导的原位末端标记法(TUNEL)原位检测凋亡 取经药物作用后的载玻片，以TUNEL法检测细胞凋亡，参照试剂盒(Boehriger Manheim,德国)说明书操作[6]。
1.5 电镜样品制备及观察 取指数生长期细胞(107/瓶)，经药物作用后，用policeman橡皮刮刀分离细胞，离心,3.5%戊二醛固定，四氧化锇再固定，依序丙酮脱水，常规包埋、切片、醋酸铀染色。HITACHI-600型透射电镜观察。
1.6 流式细胞术检测细胞周期及凋亡分析[4，8] 收集经药物作用的细胞，胰酶消化后计数，用5mg/ml的PI(Sigma)染液染色,以正常人淋巴细胞调整细胞参数,上流式细胞仪(FACScan,Becton Dickinson,美国)作凋亡和DNA周期分析。测量的数据输入Macintosh 650计算机用Cell Quest软件分析数据。每次计算10 000个细胞，打印结果，包括点图和组方图，并用Modfit1.0软件判断和计算凋亡比例。
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1.7 统计学方法 采用χ2检验。
2 结 果
2.1 凋亡细胞的形态学改变
2.1.1 倒置显微镜观察 以浓度为0.5μg/ml的阿霉素作用于SKOV3细胞,6～12h后细胞逐渐变为圆形,体积变小,胞膜完整,培养液中有许多漂浮的呈桑椹样细胞, 细胞膜表面有小泡形成, 24h后上述改变更为明显。以浓度≥25μg/ml的阿霉素作用后，6～12h细胞明显肿胀、体积增大，随着阿霉素浓度增加，48～72h细胞全部破裂，未加药者细胞则无明显改变，仅见少许漂浮的细胞。
2.1.2 光镜观察 以浓度为0.5μg/ml的阿霉素处理卵巢癌细胞，12～24h后观察，SKOV3细胞部分体积明显缩小，细胞膜上出现小泡及胞膜皱缩，胞浆变少，红染，细胞核明显固缩，染色质浓染，有的呈月牙状边集，部分细胞裂解为碎片状：48h上述改变明显。未加药的卵巢癌细胞改变不明显，仅见散在的细胞浆红染核固缩的细胞。
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2.1.3 用TUNEL法的结果 加药的细胞可见凋亡细胞的染色质局限在核内，染色质边集，形成半月状或环形，坏死细胞晚期DNA发生非特异性分解，断裂的片段进入胞浆，染色较浅且细胞核和胞浆均能显色。
2.2 DNA琼脂糖凝胶电泳 分别以浓度为10μg/ml和40μg/ml的阿霉素作用3h，细胞出现300kb的大片段。以浓度0.5μg/ml的阿霉素作用48h出现典型的梯状电泳。
2.3 电镜观察 未加药的细胞在形态上未见明显改变，用浓度0.5μg/ml 的阿霉素作用48h后透射电镜下观察，见部分癌细胞表面微绒毛明显减少或消失，有些细胞膜上出现一些小泡；胞浆内结构密度增大，内质网及线粒体等细胞器依稀可见，其数量减少，核内染色质浓集成块，有的呈月牙状，边集在核膜下，有一些由膜状物包裹的小体，内含残存的染色质和退变的细胞器，有的细胞崩解为碎片，每个碎片由结构不清的膜状物包裹。另外，可见一些卵巢癌细胞体积增大，电子密度降低，内质网膜扩大，线粒体肿胀，核染色质疏松，此为变性坏死细胞。
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2.4 流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡及周期分析
2.4.1 以浓度25～100μg/ml阿霉素作用72h检测,主要为坏死峰。
2.4.2 以浓度1.5～20μg/ml的阿霉素作用72h,可检测到凋亡和坏死的细胞,作用3h后, 再培养72h, 主要是诱导卵巢癌细胞凋亡。
2.4.3 以浓度0.5μg/ml阿霉素连续作用24、48、72h检测，SKOV3细胞凋亡发生率分别为40.01%、65.38%和77.65%。
2.4.4 细胞周期分析 对照SKOV3细胞的Gl/0、S、G2/M期比例分别为44.73%、26.32%、28.95%，经浓度0.5μg/ml阿霉素作用后24、48、72h检测Gl/0比例>90%，均显著高于未用药的对照细胞(P<0.01)，表明细胞发生Gl期阻滞。
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3 讨 论
诱导肿瘤细胞凋亡可能是许多化疗药物抑制肿瘤细胞生长的机制之一，提示在肿瘤的治疗中筛选并应用更加特异地诱导肿瘤细胞凋亡的药物或其它手段可提高治疗效果。近年，国内外学者对妇科恶性肿瘤中的细胞凋亡进行了研究，表明治疗卵巢癌的常用化疗剂，如环磷酰胺、顺铂、紫杉醇等均可诱导敏感的卵巢癌细胞发生凋亡，发挥了化疗剂的抗肿瘤作用[1-5]。
本实验以不同浓度的阿霉素作用于卵巢癌SKOV3细胞，采用光镜、电镜和DNA琼脂糖电泳，TUNEL法和流式细胞术等观察卵巢癌细胞发生凋亡的情况，并比较各种方法。结果表明，以阿霉素作用培养的人卵巢癌细胞，从形态学、DNA结构断裂和TUNEL法等方面均证实能诱导卵巢癌细胞发生凋亡。DNA琼脂糖电泳表明，用10μg/ml和40μg/ml的阿霉素作用3h，细胞有300kb的大分子片段形成，0.5μg/ml阿霉素作用卵巢癌细胞48h后，细胞出现180～200bp的DNA梯样断裂；这些改变符合凋亡的特征变化[5，6]。电镜下见有些细胞受阿霉素作用后崩解为碎片，碎片内结构不清，呈颗粒状，可能是细胞骨架破坏发生凋亡最后消失的一种形式[7，8]。
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为研究阿霉素药物浓度和作用时间诱导卵巢癌细胞凋亡的规律，我们采用了流式细胞术定量分析了卵巢癌细胞凋亡和细胞周期，结果表明：(1)大剂量(25～100μg/ml)阿霉素连续作用72h，卵巢癌细胞主要是坏死，短时间作用(3h)，均检测到细胞坏死和凋亡，无Gl/0期峰，表明大剂量化疗剂对肿瘤细胞有杀灭作用，可获得更好疗效，但此剂量为临床剂量的50～200倍，对正常细胞的毒性损伤作用太大，患者难以承受，故临床价值不大；(2)中等剂量(1～20μg/ml)的阿霉素连续作用72h，均检测到肿瘤细胞细胞调亡和坏死，但短时间(3h)作用主要诱导凋亡，提示临床中对患者采用短时、局部、冲击治疗可诱导卵巢癌细胞凋亡，以减少全身的毒副反应，具有一定的临床意义；(3)0.5μg/ml阿霉素连续作用72h，能诱导细胞发生凋亡；(4)分析受药物作用后的细胞周期DNA变化表明，阿霉素是周期特异性药物，能使细胞DNA损伤，发生Gl期阻滞，并诱导凋亡。损伤后致凋亡的机制有待进一步探讨。
第一作者简介：李佳平，男，39岁，成都市第三人民医院妇产科副主任医师，医学博士。主要研究方向：卵巢肿瘤的诊断与治疗和介入技术在妇产科的临床应用。
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李佳平(成都市第三人民医院妇产科，610031)
唐良萏(重庆医科大学第一附属医院妇产科)
周洪贵(重庆医科大学第一附属医院妇产科)
卞度宏(重庆医科大学第一附属医院妇产科)
参考文献
1，Kerr JFR, Winterford CM, Harmon BV. Apoptosis: Its significance in cancer and cancer therapy. Cancer, 1994,73:2017-2020
2，Harrilesky LJ, Elbendary A,Hurteau J.Chemotherapy induce apoptosis in epithelial ovarian cancer. Obstet Gynecol, 1995,85:1007-1010
, http://www.100md.com
3，Fesus I,Sxondy C,Uray I,et al. Probing the molecular program of apoptosis by cancer chemopreventive agent. J Cell Biochem, 1995,85:151-154
4，Gibb RK, Taylor DD, Wan T, et al. Apoptosis as a measure of chemosensitivity to cisplatin and taxol therapy in ovarian cancer cell lines. Gynecol Oncol, 1997,65:13-14
5，Ormerod MG,O' neill CF,Robertson D,et al. Cisplatin induces apoptosis in a human ovarian cell line without concomitant internucleosomal cegradation of DNA. Exp Cell Res, 1994,211:237-239
, 百拇医药
6，Oberhammer F,Wilson JW,Dive C,et al. Apoptotic death in epithelial cells; cleavage of DNA to 300 and/or 50kb fragment prior to or in the absence of internucleosomal fragmentation. EMBO J, 1993,12:3696-3997
7，Gorezyca W,Gong J, Darazynkiewicz Z. Detection of DNA strand breaks in individual apoptotec cells by the in situ terminal deoxynucleotidye transferase and nick translation assay. Cancer Res, 1993, 53:1945-1948
8，Darzynkiewicz Z,Juan G,Li X,et al. Cytometry in cell necrobiology:Analysis of apoptosis and accidental cell death(Necrosis). Cytometry, 1997,27:1-3, 百拇医药
李佳平 唐良萏 周洪贵 卞度宏
摘 要 目的：探讨阿霉素诱导卵巢癌细胞凋亡的规律。方法：以不同浓度的阿霉素作用于人卵巢癌细胞株SKOV3，用光镜、电镜、TUNEL法和DNA凝胶电泳法检测确定细胞凋亡，以流式细胞仪定量分析凋亡和细胞周期特异性。结果：大剂量(25～100μg/ml)长时间(3～72h)的阿霉素作用可引起卵巢癌细胞坏死和凋亡，较小剂量(0.5μg/ml)的阿霉素连续作用24、48、72h，诱导细胞凋亡发生率分别为40.01%、65.38%和77.65%，并使细胞发生G1期阻滞。结论：阿霉素能导致卵巢癌细胞DNA损伤，发生G1期阻滞并诱导凋亡是其抗肿瘤的机制之一。
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关键词：阿霉素；卵巢肿瘤；细胞凋亡；流式细胞术
细胞凋亡与肿瘤的发生、消退以及放、化疗密切相关。通过诱导肿瘤细胞凋亡，对进一步探讨肿瘤发病机理及其防治具有十分重要的意义。目前，国内外对白血病和实体瘤的凋亡研究较多，对卵巢癌主要采用以顺铂和紫杉醇诱导肿瘤细胞凋亡[1-4]，而用阿霉素诱导卵巢癌细胞凋亡的研究较少。我们以阿霉素作用于人卵巢癌SKOV3细胞，探讨其诱导肿瘤细胞凋亡的规律和药物作用的机理，以冀深入开展凋亡相关基因和耐药关系的研究。
1 材料与方法
1.1 卵巢癌细胞系 SKOV3卵巢癌细胞株由北京医科大学提供，来自美国Memorial Sloan Kettering Cancer Center，为人类卵巢浆液性乳头状囊腺癌，细胞在含HEPS 25 mmol/L， 谷氨酰胺2 mmol/L，青霉素100 IU/ml，链霉素100 IU/ml和10%灭活小牛血清的RPMI 1640完全培养基中(Gibco/Brl 公司)培养。
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1.2 DNA提取及凝胶琼糖电泳[5] 收集经药物作用的106个细胞，经裂解后用蛋白酶K(Boehriger Manheim 德国)消化，饱和酚(promega)：氯仿：异丙醇(25：24：1)抽提，TE溶液(10mmol/L Tris-HCL pH7.4， 1mmol/L EDTA pH8.0)溶解，提取的DNA以RNA酶5mg/L作用1h，在含有0.5μg/ml溴化乙啶的1.2%琼脂糖凝胶中，电泳1.5h，DNA标准用EcoRI/HindIII(promega)，紫外灯下观察。
1.3 光镜观察形态学改变 细胞接种在放有已消毒盖玻片的培养皿中培养，待细胞生长至对数生长期，分别换入由培养基配制的不同浓度的阿霉素(Farmitralial,Italy)培养液，定时镜下观察。
1.3.1 倒置显微镜下直接观察。
1.3.2 普通光镜观察 取经药物作用后的载玻片，1：3冰醋酸：甲醇固定30min，常规HE染色，镜下观察。
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1.4 末端脱氧核糖转移酶介导的原位末端标记法(TUNEL)原位检测凋亡 取经药物作用后的载玻片，以TUNEL法检测细胞凋亡，参照试剂盒(Boehriger Manheim,德国)说明书操作[6]。
1.5 电镜样品制备及观察 取指数生长期细胞(107/瓶)，经药物作用后，用policeman橡皮刮刀分离细胞，离心,3.5%戊二醛固定，四氧化锇再固定，依序丙酮脱水，常规包埋、切片、醋酸铀染色。HITACHI-600型透射电镜观察。
1.6 流式细胞术检测细胞周期及凋亡分析[4，8] 收集经药物作用的细胞，胰酶消化后计数，用5mg/ml的PI(Sigma)染液染色,以正常人淋巴细胞调整细胞参数,上流式细胞仪(FACScan,Becton Dickinson,美国)作凋亡和DNA周期分析。测量的数据输入Macintosh 650计算机用Cell Quest软件分析数据。每次计算10 000个细胞，打印结果，包括点图和组方图，并用Modfit1.0软件判断和计算凋亡比例。
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1.7 统计学方法 采用χ2检验。
2 结 果
2.1 凋亡细胞的形态学改变
2.1.1 倒置显微镜观察 以浓度为0.5μg/ml的阿霉素作用于SKOV3细胞,6～12h后细胞逐渐变为圆形,体积变小,胞膜完整,培养液中有许多漂浮的呈桑椹样细胞, 细胞膜表面有小泡形成, 24h后上述改变更为明显。以浓度≥25μg/ml的阿霉素作用后，6～12h细胞明显肿胀、体积增大，随着阿霉素浓度增加，48～72h细胞全部破裂，未加药者细胞则无明显改变，仅见少许漂浮的细胞。
2.1.2 光镜观察 以浓度为0.5μg/ml的阿霉素处理卵巢癌细胞，12～24h后观察，SKOV3细胞部分体积明显缩小，细胞膜上出现小泡及胞膜皱缩，胞浆变少，红染，细胞核明显固缩，染色质浓染，有的呈月牙状边集，部分细胞裂解为碎片状：48h上述改变明显。未加药的卵巢癌细胞改变不明显，仅见散在的细胞浆红染核固缩的细胞。
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2.1.3 用TUNEL法的结果 加药的细胞可见凋亡细胞的染色质局限在核内，染色质边集，形成半月状或环形，坏死细胞晚期DNA发生非特异性分解，断裂的片段进入胞浆，染色较浅且细胞核和胞浆均能显色。
2.2 DNA琼脂糖凝胶电泳 分别以浓度为10μg/ml和40μg/ml的阿霉素作用3h，细胞出现300kb的大片段。以浓度0.5μg/ml的阿霉素作用48h出现典型的梯状电泳。
2.3 电镜观察 未加药的细胞在形态上未见明显改变，用浓度0.5μg/ml 的阿霉素作用48h后透射电镜下观察，见部分癌细胞表面微绒毛明显减少或消失，有些细胞膜上出现一些小泡；胞浆内结构密度增大，内质网及线粒体等细胞器依稀可见，其数量减少，核内染色质浓集成块，有的呈月牙状，边集在核膜下，有一些由膜状物包裹的小体，内含残存的染色质和退变的细胞器，有的细胞崩解为碎片，每个碎片由结构不清的膜状物包裹。另外，可见一些卵巢癌细胞体积增大，电子密度降低，内质网膜扩大，线粒体肿胀，核染色质疏松，此为变性坏死细胞。
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2.4 流式细胞术(FCM)检测细胞凋亡及周期分析
2.4.1 以浓度25～100μg/ml阿霉素作用72h检测,主要为坏死峰。
2.4.2 以浓度1.5～20μg/ml的阿霉素作用72h,可检测到凋亡和坏死的细胞,作用3h后, 再培养72h, 主要是诱导卵巢癌细胞凋亡。
2.4.3 以浓度0.5μg/ml阿霉素连续作用24、48、72h检测，SKOV3细胞凋亡发生率分别为40.01%、65.38%和77.65%。
2.4.4 细胞周期分析 对照SKOV3细胞的Gl/0、S、G2/M期比例分别为44.73%、26.32%、28.95%，经浓度0.5μg/ml阿霉素作用后24、48、72h检测Gl/0比例>90%，均显著高于未用药的对照细胞(P<0.01)，表明细胞发生Gl期阻滞。
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诱导肿瘤细胞凋亡可能是许多化疗药物抑制肿瘤细胞生长的机制之一，提示在肿瘤的治疗中筛选并应用更加特异地诱导肿瘤细胞凋亡的药物或其它手段可提高治疗效果。近年，国内外学者对妇科恶性肿瘤中的细胞凋亡进行了研究，表明治疗卵巢癌的常用化疗剂，如环磷酰胺、顺铂、紫杉醇等均可诱导敏感的卵巢癌细胞发生凋亡，发挥了化疗剂的抗肿瘤作用[1-5]。
本实验以不同浓度的阿霉素作用于卵巢癌SKOV3细胞，采用光镜、电镜和DNA琼脂糖电泳，TUNEL法和流式细胞术等观察卵巢癌细胞发生凋亡的情况，并比较各种方法。结果表明，以阿霉素作用培养的人卵巢癌细胞，从形态学、DNA结构断裂和TUNEL法等方面均证实能诱导卵巢癌细胞发生凋亡。DNA琼脂糖电泳表明，用10μg/ml和40μg/ml的阿霉素作用3h，细胞有300kb的大分子片段形成，0.5μg/ml阿霉素作用卵巢癌细胞48h后，细胞出现180～200bp的DNA梯样断裂；这些改变符合凋亡的特征变化[5，6]。电镜下见有些细胞受阿霉素作用后崩解为碎片，碎片内结构不清，呈颗粒状，可能是细胞骨架破坏发生凋亡最后消失的一种形式[7，8]。
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为研究阿霉素药物浓度和作用时间诱导卵巢癌细胞凋亡的规律，我们采用了流式细胞术定量分析了卵巢癌细胞凋亡和细胞周期，结果表明：(1)大剂量(25～100μg/ml)阿霉素连续作用72h，卵巢癌细胞主要是坏死，短时间作用(3h)，均检测到细胞坏死和凋亡，无Gl/0期峰，表明大剂量化疗剂对肿瘤细胞有杀灭作用，可获得更好疗效，但此剂量为临床剂量的50～200倍，对正常细胞的毒性损伤作用太大，患者难以承受，故临床价值不大；(2)中等剂量(1～20μg/ml)的阿霉素连续作用72h，均检测到肿瘤细胞细胞调亡和坏死，但短时间(3h)作用主要诱导凋亡，提示临床中对患者采用短时、局部、冲击治疗可诱导卵巢癌细胞凋亡，以减少全身的毒副反应，具有一定的临床意义；(3)0.5μg/ml阿霉素连续作用72h，能诱导细胞发生凋亡；(4)分析受药物作用后的细胞周期DNA变化表明，阿霉素是周期特异性药物，能使细胞DNA损伤，发生Gl期阻滞，并诱导凋亡。损伤后致凋亡的机制有待进一步探讨。
第一作者简介：李佳平，男，39岁，成都市第三人民医院妇产科副主任医师，医学博士。主要研究方向：卵巢肿瘤的诊断与治疗和介入技术在妇产科的临床应用。
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李佳平(成都市第三人民医院妇产科，610031)
唐良萏(重庆医科大学第一附属医院妇产科)
周洪贵(重庆医科大学第一附属医院妇产科)
卞度宏(重庆医科大学第一附属医院妇产科)
参考文献
1，Kerr JFR, Winterford CM, Harmon BV. Apoptosis: Its significance in cancer and cancer therapy. Cancer, 1994,73:2017-2020
2，Harrilesky LJ, Elbendary A,Hurteau J.Chemotherapy induce apoptosis in epithelial ovarian cancer. Obstet Gynecol, 1995,85:1007-1010
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3，Fesus I,Sxondy C,Uray I,et al. Probing the molecular program of apoptosis by cancer chemopreventive agent. J Cell Biochem, 1995,85:151-154
4，Gibb RK, Taylor DD, Wan T, et al. Apoptosis as a measure of chemosensitivity to cisplatin and taxol therapy in ovarian cancer cell lines. Gynecol Oncol, 1997,65:13-14
5，Ormerod MG,O' neill CF,Robertson D,et al. Cisplatin induces apoptosis in a human ovarian cell line without concomitant internucleosomal cegradation of DNA. Exp Cell Res, 1994,211:237-239
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6，Oberhammer F,Wilson JW,Dive C,et al. Apoptotic death in epithelial cells; cleavage of DNA to 300 and/or 50kb fragment prior to or in the absence of internucleosomal fragmentation. EMBO J, 1993,12:3696-3997
7，Gorezyca W,Gong J, Darazynkiewicz Z. Detection of DNA strand breaks in individual apoptotec cells by the in situ terminal deoxynucleotidye transferase and nick translation assay. Cancer Res, 1993, 53:1945-1948
8，Darzynkiewicz Z,Juan G,Li X,et al. Cytometry in cell necrobiology:Analysis of apoptosis and accidental cell death(Necrosis). Cytometry, 1997,27:1-3, 百拇医药