主动脉中膜细胞体外钙化的研究
主动脉中膜细胞体外钙化的研究
崔晓暄 王士雯 齐鹏
摘 要 目的 研究主动脉中膜细胞体外钙化情况以及25-羟基胆固醇、β-甘油磷酸盐对此过程的作用。 方法 外植块法分离培养主动脉中膜细胞，进行von Kossa染色以观察钙化情况，生化检测细胞内外不溶性钙，放免法测定培养基质骨钙素含量。 结果 原代细胞有两种生长表现：一种细胞平行生长，不形成结节，von Kossa染色阴性；一种易形成结节，von Kossa染色阳性。传代细胞(对照组)培养28 d无结节形成，von Kossa染色阴性，但是，25-羟基胆固醇(胆固醇组)、β-甘油磷酸盐(甘油磷酸盐组)分别刺激有细胞结节形成，von Kossa染色阳性，不溶性钙分别为(57.80±18.50)μg/孔、(67.50±15.30)μg/孔，培养上清骨钙素分别为(0.886±0.063)μg/L、(0.895±0.061)μg/L，与对照组比较，差异有显著性。 结论 体外培养的主动脉中膜细胞有两种亚型，一种为平滑肌细胞的表型，另一种与微血管周细胞相似，并能使其细胞外基质钙化。25-羟基胆固醇及β-甘油磷酸盐均可以促进这一体外钙化过程。动脉中膜体外钙化过程中骨钙素合成增多，可能参与了主动脉的钙化。
, 百拇医药
关键词：动脉；钙化；胆固醇；甘油磷酸类；骨钙素
心脑血管的钙化在老年人中很常见，而且与心脑血管事件的发生有着密切的关系。为研究血管钙化的发生机制，我们于1997年3月至1999年7月对家兔主动脉中膜细胞进行体外培养，旨在观察原代及传代细胞的生长方式和钙化情况，以及25-羟基胆固醇和β-甘油磷酸盐对钙化的作用，初步探讨骨钙素(osteopontin)的分泌与钙化的关系。
材料与方法
一、材料
雄性4周龄体重约370 g的新西兰兔15只，购自中国药品生物制品检定所实验动物繁育场。骨钙素测定放免药盒购自北京东亚免疫技术研究所。
二、方法
1.主动脉平滑肌细胞的分离和培养〔1〕：无菌分离出实验兔主动脉，在Hank's液中反复冲洗主动脉条，并用钟表镊撕掉主动脉外膜。纵向剖开主动脉，用消毒棉签擦拭内膜面后，将主动脉剪碎并接种于培养瓶中。将培养瓶放于37℃、5% CO2培养箱中，30 min至1 h后取出，加入含有20% FBS、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、2 mmol/L谷胺酰胺的DMEM，37℃、5% CO2条件下培养。每3 d换液1次。
, 百拇医药
2.处理：培养的5～6代细胞在含有10% FBS、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、2 mmol/L谷胺酰胺的DMEM中，按1.8×105/孔的密度接种于6孔培养板。72 h后更换为添加有1 μg/ml 25-羟基胆固醇的上述DMEM，为胆固醇组；更换为添加有10 mmol/L β-甘油磷酸盐、50 μg/ml Vit C和100 U/L胰岛素的上述DMEM，为甘油磷酸盐组；以前述DMEM培养，为对照组。每3 d换液1次。
3.von Kossa染色：培养细胞在0.1%戊二醛中固定30 min，加入5%硝酸银，蔽光、室温孵育30 min。用三蒸水轻轻洗涤细胞后，在紫外光下放置30 min后用0.1%伊红复染30 s。
4.钙测定：为测定结合于细胞外基质、细胞蛋白、矿物质的不溶性钙，将已生长于6孔培养板的细胞在钙测定前的12 h更换成不含血清的培养基。用PBS冲洗，胰蛋白酶消化后铲下细胞，加入1.5 ml PBS并收集细胞，38℃下孵育细胞30 min。经过3个冷冻-融解循环后，再次在38℃下孵育30 min。将细胞置于超声波中3 min，使细胞充分破碎，3 000 r/min离心30 min，沉淀完全悬浮于250 μl 6 mol/L HCl，100℃孵育30 min后，加入250 μl 6 mol/L NaOH进行中和。其余步骤按Webster方法〔2〕进行操作。
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5.骨钙素测定：细胞培养至第25 d，更换培养基，6孔培养板每孔加入1.5 ml新鲜培养基，孵育72 h后，吸出上清，置-30℃待测。骨钙素的浓度用125I放射免疫法进行分析，具体操作按试剂盒说明进行。
三、数据处理
所得数据以均数±标准差(X±s)表示，用方差分析和q检验进行统计学分析，显著性水平为α=0.05。
结 果
一、培养细胞的生长及von Kossa染色特征
原代细胞在培养至21 d时镜下可见两种不同的细胞生长表现：一种为长梭形，平行生长，束状排列，密集与稀疏处相互交错呈“峰-谷”状(图1)；另一种为扁而大的星形细胞，即使在稀疏的生长状态下，仍然形成多个细胞结节，而不能达到细胞间隙完全融合(图2)。行von Kossa染色，细胞结节被染成黑色，显示有钙质沉积。
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对照组培养的传代细胞，培养至28 d无细胞结节形成，von Kossa染色阴性(图3)；而胆固醇组和甘油磷酸盐组的细胞可见多个细胞结节，von Kossa染色阳性(图4)。
二、钙及骨钙素的测定
见表1。
表1 各组每孔不溶性钙及培养上清
骨钙素含量比较(X±s)
组别
孔数
不溶性钙(μg/孔)
孔数
骨钙素(μg/L)
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对照组
6
0.10±0.03
7
0.685±0.039
胆固醇组
6
57.80±18.50
7
0.886±0.063
甘油磷酸盐组
6
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67.50±15.30
7
0.895±0.061
注：与对照组比较，P<0.01讨 论
一般认为平滑肌细胞是主动脉中膜唯一的细胞类型。我们采用主动脉中膜外植块法进行细胞的原代培养，发现从组织块外周长出的细胞表现为两种不同的细胞形态和生长状态。一种细胞为典型的平滑肌细胞的表现，另一种细胞生长和钙化的特点与微血管的周细胞(pericytes)十分相似，即使在稀疏的状态下仍然趋于结节化和钙化，这些特征是平滑肌细胞不具有的〔3,4〕。因而，我们认为主动脉中膜内存在一种周细胞样的细胞，正是这种细胞在血管壁的钙化过程中起着重要作用。
本实验中，传代培养的细胞在未施加促钙化因素的条件下，其钙化速度明显慢于原代细胞，培养至28 d时仍未见钙化结节出现。其原因可能为周细胞样细胞在原代细胞中所占的比例较少，并且有可能其生长速度慢于平滑肌细胞，因此在连续传代的过程中受到抑制。研究证实，25-羟胆固醇存在于动脉粥样斑块之中，本实验观察到它对体外血管壁细胞钙化有促进作用，表明它在体内可能作为促进钙化的一个病理因素。β-甘油磷酸盐是碱性磷酸酶的作用底物，分解后释放出无机磷酸盐使局部磷的浓度升高。Vit C可促进软骨细胞的成熟化，明显增高软骨细胞碱性磷酸酶水平。β-甘油磷酸盐与Vit C的联合应用可以极大促进培养的软骨细胞的钙化，对周细胞的钙化也有明显的促进作用〔5〕。本研究采用促进软骨细胞钙化的培养条件培养动脉中膜细胞，同样观察到钙化的加速，这提示动脉的钙化与骨组织的钙化具有某些相似或相同的机制。
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在本研究中，对培养28 d的主动脉壁细胞培养上清用放免法进行骨钙素测定，结果表明，发生钙化的胆固醇组和甘油磷酸盐组比无钙化的对照组骨钙素含量明显增高。Balica等〔6〕在研究17 β-雌二醇对体外牛主动脉平滑肌细胞钙化的促进作用时，用Western blot方法检测培养上清的骨钙素，结果表明，随钙化的增多骨钙素的分泌增加，这与本研究的结果一致。
图1、2 原代细胞的两种生长类型 von Kossa染色 ×100
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图3 对照组培养至28 d时的传代细胞 von Kossa染色 ×100
图4 甘油磷酸盐培养至28 d时的传代细胞 von Kossa染色 ×200
骨钙素属于γ-羧基谷氨酸(gamma carboxyglutamate，Gla)蛋白家族。Gla这一氨基酸残基具有结合钙的功能，Gla蛋白与钙离子的结合能力弱，但是Gla蛋白与羟基磷灰石有很高的结合力，所以一旦钙沉积发生，它就会结合于沉积的羟基磷灰石。骨钙素最初由骨组织分离出来，后来，在钙化的粥样斑块和瓣膜中可检测到低水平的骨钙素，而在无钙化的组织中几乎检测不到，并且发现钙化组织中其他Gla蛋白的含量也显著增高。因为目前对于Gla蛋白与钙化的关系仍然存在诸多疑问，所以就本实验培养上清骨钙素随钙化而增高这一结果可以做出两种解释：一种可能是局部钙及羟基磷灰石的增多向细胞发出有害信号，细胞分泌更多的骨钙素以便钙被结合转移，但由于骨钙素与沉积的羟基磷灰石结合，因此这种结合可能反而加速了矿物质的进一步沉积，形成一个正反馈，使得骨钙素的分泌随着钙化增加；另一种可能是在钙化的启动过程中骨钙素的表达和分泌增高，过多的骨钙素与其他因子共同构成了矿物质沉积的有利环境，从而促进钙化。
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基金项目：国家自然科学基金(39770869)
崔晓暄(空军总医院老年科 北京市，100036)
王士雯(解放军总医院老年心血管病研究所)
齐鹏(解放军总医院老年心血管病研究所)
参考文献
1，Bostrom K, Watson KE, Horn S, et al. Bone morphogenic protein expression in human atherosclerotic lesions. J Clin Invest, 1993, 91:1800-1809.
2，Webster WW Jr. A simple microspectrophotometric method for the determination of serum calcium. Am J Pathol, 1962, 37:330-333.
, 百拇医药
3，Schor AM, Allen TD, Canfield AE, et al. Pericytes derived from the retinal microvasculature undergo calcification in vitro. J Cell Sci, 1990, 97: 449-461.
4，Andreeva ER, Pugach IM, Gordon D, et al. Continuous subendothelial network formed by pericyte-like cells in human vascular bed. Tissue Cell, 1998, 30: 127-135.
5，Schor AM, Canfield AE, Sutton AB, et al. Pericyte differentiation. Clin Orthop, 1995, 313:81-91.
6，Balica M, Bostrom K, Shin V, et al. Calcifying subpopulation of bovine aortic smooth muscle cells is responsive to 17β-estradiol. Circulation，1997, 95:1954-1960., http://www.100md.com
崔晓暄 王士雯 齐鹏
摘 要 目的 研究主动脉中膜细胞体外钙化情况以及25-羟基胆固醇、β-甘油磷酸盐对此过程的作用。 方法 外植块法分离培养主动脉中膜细胞，进行von Kossa染色以观察钙化情况，生化检测细胞内外不溶性钙，放免法测定培养基质骨钙素含量。 结果 原代细胞有两种生长表现：一种细胞平行生长，不形成结节，von Kossa染色阴性；一种易形成结节，von Kossa染色阳性。传代细胞(对照组)培养28 d无结节形成，von Kossa染色阴性，但是，25-羟基胆固醇(胆固醇组)、β-甘油磷酸盐(甘油磷酸盐组)分别刺激有细胞结节形成，von Kossa染色阳性，不溶性钙分别为(57.80±18.50)μg/孔、(67.50±15.30)μg/孔，培养上清骨钙素分别为(0.886±0.063)μg/L、(0.895±0.061)μg/L，与对照组比较，差异有显著性。 结论 体外培养的主动脉中膜细胞有两种亚型，一种为平滑肌细胞的表型，另一种与微血管周细胞相似，并能使其细胞外基质钙化。25-羟基胆固醇及β-甘油磷酸盐均可以促进这一体外钙化过程。动脉中膜体外钙化过程中骨钙素合成增多，可能参与了主动脉的钙化。
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关键词：动脉；钙化；胆固醇；甘油磷酸类；骨钙素
心脑血管的钙化在老年人中很常见，而且与心脑血管事件的发生有着密切的关系。为研究血管钙化的发生机制，我们于1997年3月至1999年7月对家兔主动脉中膜细胞进行体外培养，旨在观察原代及传代细胞的生长方式和钙化情况，以及25-羟基胆固醇和β-甘油磷酸盐对钙化的作用，初步探讨骨钙素(osteopontin)的分泌与钙化的关系。
材料与方法
一、材料
雄性4周龄体重约370 g的新西兰兔15只，购自中国药品生物制品检定所实验动物繁育场。骨钙素测定放免药盒购自北京东亚免疫技术研究所。
二、方法
1.主动脉平滑肌细胞的分离和培养〔1〕：无菌分离出实验兔主动脉，在Hank's液中反复冲洗主动脉条，并用钟表镊撕掉主动脉外膜。纵向剖开主动脉，用消毒棉签擦拭内膜面后，将主动脉剪碎并接种于培养瓶中。将培养瓶放于37℃、5% CO2培养箱中，30 min至1 h后取出，加入含有20% FBS、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、2 mmol/L谷胺酰胺的DMEM，37℃、5% CO2条件下培养。每3 d换液1次。
, 百拇医药
2.处理：培养的5～6代细胞在含有10% FBS、100 U/ml青霉素、100 μg/ml链霉素、2 mmol/L谷胺酰胺的DMEM中，按1.8×105/孔的密度接种于6孔培养板。72 h后更换为添加有1 μg/ml 25-羟基胆固醇的上述DMEM，为胆固醇组；更换为添加有10 mmol/L β-甘油磷酸盐、50 μg/ml Vit C和100 U/L胰岛素的上述DMEM，为甘油磷酸盐组；以前述DMEM培养，为对照组。每3 d换液1次。
3.von Kossa染色：培养细胞在0.1%戊二醛中固定30 min，加入5%硝酸银，蔽光、室温孵育30 min。用三蒸水轻轻洗涤细胞后，在紫外光下放置30 min后用0.1%伊红复染30 s。
4.钙测定：为测定结合于细胞外基质、细胞蛋白、矿物质的不溶性钙，将已生长于6孔培养板的细胞在钙测定前的12 h更换成不含血清的培养基。用PBS冲洗，胰蛋白酶消化后铲下细胞，加入1.5 ml PBS并收集细胞，38℃下孵育细胞30 min。经过3个冷冻-融解循环后，再次在38℃下孵育30 min。将细胞置于超声波中3 min，使细胞充分破碎，3 000 r/min离心30 min，沉淀完全悬浮于250 μl 6 mol/L HCl，100℃孵育30 min后，加入250 μl 6 mol/L NaOH进行中和。其余步骤按Webster方法〔2〕进行操作。
, http://www.100md.com
5.骨钙素测定：细胞培养至第25 d，更换培养基，6孔培养板每孔加入1.5 ml新鲜培养基，孵育72 h后，吸出上清，置-30℃待测。骨钙素的浓度用125I放射免疫法进行分析，具体操作按试剂盒说明进行。
三、数据处理
所得数据以均数±标准差(X±s)表示，用方差分析和q检验进行统计学分析，显著性水平为α=0.05。
结 果
一、培养细胞的生长及von Kossa染色特征
原代细胞在培养至21 d时镜下可见两种不同的细胞生长表现：一种为长梭形，平行生长，束状排列，密集与稀疏处相互交错呈“峰-谷”状(图1)；另一种为扁而大的星形细胞，即使在稀疏的生长状态下，仍然形成多个细胞结节，而不能达到细胞间隙完全融合(图2)。行von Kossa染色，细胞结节被染成黑色，显示有钙质沉积。
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对照组培养的传代细胞，培养至28 d无细胞结节形成，von Kossa染色阴性(图3)；而胆固醇组和甘油磷酸盐组的细胞可见多个细胞结节，von Kossa染色阳性(图4)。
二、钙及骨钙素的测定
见表1。
表1 各组每孔不溶性钙及培养上清
骨钙素含量比较(X±s)
组别
孔数
不溶性钙(μg/孔)
孔数
骨钙素(μg/L)
, 百拇医药
对照组
6
0.10±0.03
7
0.685±0.039
胆固醇组
6
57.80±18.50
7
0.886±0.063
甘油磷酸盐组
6
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67.50±15.30
7
0.895±0.061
注：与对照组比较，P<0.01讨 论
一般认为平滑肌细胞是主动脉中膜唯一的细胞类型。我们采用主动脉中膜外植块法进行细胞的原代培养，发现从组织块外周长出的细胞表现为两种不同的细胞形态和生长状态。一种细胞为典型的平滑肌细胞的表现，另一种细胞生长和钙化的特点与微血管的周细胞(pericytes)十分相似，即使在稀疏的状态下仍然趋于结节化和钙化，这些特征是平滑肌细胞不具有的〔3,4〕。因而，我们认为主动脉中膜内存在一种周细胞样的细胞，正是这种细胞在血管壁的钙化过程中起着重要作用。
本实验中，传代培养的细胞在未施加促钙化因素的条件下，其钙化速度明显慢于原代细胞，培养至28 d时仍未见钙化结节出现。其原因可能为周细胞样细胞在原代细胞中所占的比例较少，并且有可能其生长速度慢于平滑肌细胞，因此在连续传代的过程中受到抑制。研究证实，25-羟胆固醇存在于动脉粥样斑块之中，本实验观察到它对体外血管壁细胞钙化有促进作用，表明它在体内可能作为促进钙化的一个病理因素。β-甘油磷酸盐是碱性磷酸酶的作用底物，分解后释放出无机磷酸盐使局部磷的浓度升高。Vit C可促进软骨细胞的成熟化，明显增高软骨细胞碱性磷酸酶水平。β-甘油磷酸盐与Vit C的联合应用可以极大促进培养的软骨细胞的钙化，对周细胞的钙化也有明显的促进作用〔5〕。本研究采用促进软骨细胞钙化的培养条件培养动脉中膜细胞，同样观察到钙化的加速，这提示动脉的钙化与骨组织的钙化具有某些相似或相同的机制。
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在本研究中，对培养28 d的主动脉壁细胞培养上清用放免法进行骨钙素测定，结果表明，发生钙化的胆固醇组和甘油磷酸盐组比无钙化的对照组骨钙素含量明显增高。Balica等〔6〕在研究17 β-雌二醇对体外牛主动脉平滑肌细胞钙化的促进作用时，用Western blot方法检测培养上清的骨钙素，结果表明，随钙化的增多骨钙素的分泌增加，这与本研究的结果一致。
图1、2 原代细胞的两种生长类型 von Kossa染色 ×100
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图3 对照组培养至28 d时的传代细胞 von Kossa染色 ×100
图4 甘油磷酸盐培养至28 d时的传代细胞 von Kossa染色 ×200
骨钙素属于γ-羧基谷氨酸(gamma carboxyglutamate，Gla)蛋白家族。Gla这一氨基酸残基具有结合钙的功能，Gla蛋白与钙离子的结合能力弱，但是Gla蛋白与羟基磷灰石有很高的结合力，所以一旦钙沉积发生，它就会结合于沉积的羟基磷灰石。骨钙素最初由骨组织分离出来，后来，在钙化的粥样斑块和瓣膜中可检测到低水平的骨钙素，而在无钙化的组织中几乎检测不到，并且发现钙化组织中其他Gla蛋白的含量也显著增高。因为目前对于Gla蛋白与钙化的关系仍然存在诸多疑问，所以就本实验培养上清骨钙素随钙化而增高这一结果可以做出两种解释：一种可能是局部钙及羟基磷灰石的增多向细胞发出有害信号，细胞分泌更多的骨钙素以便钙被结合转移，但由于骨钙素与沉积的羟基磷灰石结合，因此这种结合可能反而加速了矿物质的进一步沉积，形成一个正反馈，使得骨钙素的分泌随着钙化增加；另一种可能是在钙化的启动过程中骨钙素的表达和分泌增高，过多的骨钙素与其他因子共同构成了矿物质沉积的有利环境，从而促进钙化。
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基金项目：国家自然科学基金(39770869)
崔晓暄(空军总医院老年科 北京市，100036)
王士雯(解放军总医院老年心血管病研究所)
齐鹏(解放军总医院老年心血管病研究所)
参考文献
1，Bostrom K, Watson KE, Horn S, et al. Bone morphogenic protein expression in human atherosclerotic lesions. J Clin Invest, 1993, 91:1800-1809.
2，Webster WW Jr. A simple microspectrophotometric method for the determination of serum calcium. Am J Pathol, 1962, 37:330-333.
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3，Schor AM, Allen TD, Canfield AE, et al. Pericytes derived from the retinal microvasculature undergo calcification in vitro. J Cell Sci, 1990, 97: 449-461.
4，Andreeva ER, Pugach IM, Gordon D, et al. Continuous subendothelial network formed by pericyte-like cells in human vascular bed. Tissue Cell, 1998, 30: 127-135.
5，Schor AM, Canfield AE, Sutton AB, et al. Pericyte differentiation. Clin Orthop, 1995, 313:81-91.
6，Balica M, Bostrom K, Shin V, et al. Calcifying subpopulation of bovine aortic smooth muscle cells is responsive to 17β-estradiol. Circulation，1997, 95:1954-1960., http://www.100md.com