沙眼衣原体主要外膜蛋白在减毒鼠伤寒杆菌中的表达及初步鉴定
沙眼衣原体主要外膜蛋白在减毒鼠伤寒杆菌中的表达及初步鉴定
白光春 李元 董辉 李别虎 薛莹 范雄林 马文煜
摘 要：目的 采用作为疫苗载体的减毒鼠伤寒杆菌致死性平衡系统，构建能异源表达沙眼衣原体(Ct)主要外膜蛋白(MOMP)的重组菌株。方法 以D型Ct的DNA为模板，用所设计的特异性引物扩增编码CtMOMP高变区(VDI～VDIV)基因，并将扩增产物定向克隆至质粒pUC19中。序列分析后，再亚克隆至与减毒鼠伤寒杆菌X4550互补的质粒pYA3341中，以重组质粒转化减毒鼠伤寒杆菌X4550。结果 对构建的重组菌以种特异性抗CtMOMP单克隆抗体(mAb)做蛋白印迹表明，在相对分子质量(Mr)约为33000处表达有1条带，表达量约占菌体总蛋白的13%。结论 成功地构建了能表达MOMP的重组菌株并获得表达。
, 百拇医药
关键词：沙眼衣原体；主要外膜蛋白；减毒鼠伤寒杆菌；基因克隆；基因表达
沙眼衣原体(Ct)是感染致盲和性传播疾病最常见的病原体，目前仍无成熟的疫苗。疫苗研究中的主要问题是，不能有效地刺激机体产生特异性粘膜免疫。减毒沙门氏菌不仅可用于预防沙门氏菌的感染，还可作为异源抗原的载体，构建能表达其它病原体保护性抗原的活疫苗。通过口服免疫形成自限性感染，在免疫动物或人体内稳定、高效地表达外源抗原，获得相应粘膜的局部免疫、体液免疫和细胞免疫。此外，该类疫苗具有安全、高效、简便和经济等优点，将Ct的主要外膜蛋白(MOMP)与其重组后，通过口服免疫诱发特异性粘膜免疫有可能成为预防Ct感染的有效途径之一。本研究采用作为口服疫苗载体的减毒鼠伤寒杆菌致死性平衡系统，构建了能异源表达CtMOMP的重组菌株。
1材料和方法
1.1材料 鼠伤寒杆菌X4550为crp-1和cya-1基因突变减毒、asd基因突变营养缺限株，具有奈啶酮酸(NA)抗性；E.coliX6212为asd基因突变株，具有NA抗性，两种菌株均由美国圣路易斯华盛顿大学Curtiss博士提供。沙眼衣原体D血清型由丹麦菌种保存中心提供。质粒pYA3341为沙门氏菌asd+质粒载体，能与asd基因突变菌株互补，由Curtiss博士提供。内切酶EcoRI，PstI和Taq酶，T4DNA连接酶，均购自华美生物公司。二氨基庚二酸(DAP)和NA为美国Sigma公司产品，由Curtiss博士惠赠。CtMOMP种特异性mAbN22，购自协和医科大学。
, 百拇医药
1.2方法
1.2.1PCR引物的设计 设计的CtD型MOMP的VDI～VDIV区特异性引物序列为P1：5′-GGA-ATTCCAGCCAAGCCTACAACTG，含EcoRI酶切位点；P2：5′-GCTGCAGCTACATTGTGTCTCCGAG,含PstI酶切位点和终止码，均由上海生物工程中心合成。
1.2.2CtDNA的提取 待McCoy细胞培养物长成单层后，弃去培养液，加入D型Ct(0.1mL/25L瓶)，于37℃摇床振荡1h。补充培养液(含1mg/L放线菌酮)，在50mL/LCO2条件下于37℃继续培养48h。以无菌玻棒刮取细胞，加入5mL沙眼衣原体D型培养物，离心(10000r/min)10min。取沉淀，重悬于50μL裂解液(10×PCR缓冲液5μL，4.5%吐温-205μL,4.5%NP-405μL，20g/L蛋白酶K0.5μL和水34.5μL)中，依次置于55℃水浴1h，95℃水浴10min，使蛋白酶K灭活，离心(8000r/min)1min。取上清，用酚—氯仿抽提、无水乙醇沉淀，溶于20μL水中备用。
, 百拇医药
1.2.3表达载体的构建 按图1所示，参照文献[1]构建表达载体。将重组质粒pUC19-780DNA纯化后，用荧光标记双脱氧末端终止法，进行双向全自动序列分析。
1.2.4重组质粒的表达 以低温CaCl2法制备X6212感受态细胞(所用LB培养基中需加50mg/L的DAP)。将pYA3341DNA和回收的780bp片段连接，取连接产物10μL转化X6212。随机挑选6个菌落，分别接种于5mL含50mg/LNA的LB培养液中，于37℃振荡培养过夜。取3mL菌沉淀，以碱变性法提取质粒DNA，并用EcoRI和PstI双酶切鉴定。
将用LB培养基培养的X6212(pYA3341-780)阳性重组子，以常规碱变性法提取质粒，参照文献[2]用电穿孔法转化X4550。转化条件为：电容25μF/电压2.5kV/电阻200Ω。将转化菌铺于LB平板，37℃培养过夜后，随机挑选6个菌落，分别接种于5mL含50mg/LNA的LB培养液中，再于37℃振荡培养过夜。取3mL菌沉淀，以碱变性法提取质粒DNA，并用EcoRI和PstI双酶切鉴定。另外，将重组菌X4550(pYA3341-780)及空载菌X4550(pYA3341)用LB培养基37℃培养18h后裂解，进行12%SDS-PAGE，并通过凝胶薄层扫描测定其表达量。
, 百拇医药
1.2.5表达产物的鉴定 将所构建的重组菌及其对照菌株X4550(pYA3341)在LB培养基中于37℃培养18h，进行12%SDS-PAGE，并转移至硝酸纤维素膜上，用10g/LBSA封闭过夜，加抗MOMP种特异性mAbN22作用1h，以10mmol/LPBS(pH7.2)洗涤后，加HRP标记的羊抗鼠IgG作用1h，以DAB显色观察结果。
图1重组质粒pYA3341-780的构建
Fig1 Construction of the recombinant plasmid pYA3341-780
2结果
2.1MOMP基因的扩增、克隆及序列分析 以Ct基因组DNA为模板，以P1和P2为引物做PCR，经30个循环获得780bp的特异性扩增带。将扩增产物与质粒pUC19连接转化JM109。随机挑选6个白色克隆，提取质粒经EcoRI和PstI双酶切后，有4个克隆切出780bp大小的片段，命名为pUC19-780。其中6号阳性克隆经双向自动测序，所得全序列与文献[3，4]的报道完全一致。
, http://www.100md.com
2.2MOMP基因表达载体的构建 将纯化的重组质粒pUC19-780DNA用EcoRI和PstI双酶切，回收780bp产物，与用相同酶切的质粒pYA3341连接，转化X6212感受态细胞。转化后在选择平板上随机挑选6个克隆，提取质粒用EcoRI和PstI双酶切，有5个克隆切出780bp的片段，命名为pYA3341-780。所制备的质粒pYA3341-780用EcoRI和PstI双酶切鉴定后，通过电穿孔法转化感受态χ4550。在所设置的条件下，以12.5kV/cm的脉冲持续4.9ms，转化效率大于107。随机挑选6个菌落，提取质粒后用EcoRI和PstI双酶
切鉴定，结果均为阳性，将该重组菌株命名为X4550(pYA3341-780)。
2.3重组菌的表达及其产物的鉴定 将重组菌X4550(pYA3341-780)和对照菌X4550(pYA3341)用含NA但不含DAP的LB培养基培养后，经12%SDS-PAGE，发现约在Mr为33000处有1条蛋白带，同预计的大小相吻合。经凝胶薄层扫描，测得重组菌表达带的蛋白量约占菌体总蛋白的13%。将其与抗MOMP种特异性mAbN22做免疫印迹，X4550(pYA3341-780)菌在Mr为33000处有1条反应带；而对照菌X4550(pYA3341)则无此带，表明Mr为33000的表达产物含有能与抗Ct种特异性mAb相结合的表位。
, http://www.100md.com
3讨论
MOMP是目前研究最多的Ct候选疫苗成分。该蛋白占Ct外膜总蛋白的60%，是中和抗体的主要靶位。根据MOMP的抗原性，用特异性mAb可将Ct分为3个血清组、18个血清型。各型的MOMP均含有VDI～VDIV4个高变区，其中型特异性表位主要位于VDI和VDII，种和亚种特异性表位多位于VDIV。18个血清型均可引起眼和/或生殖道感染，理想的疫苗应能保护两种主要的感染方式。其中D血清型可引起眼和生殖道感染，是全球流行最广泛的型别之一[5]。以D型MOMP的VDI～VDIV作为抗原，不仅有可能获得对D型的保护作用，还有可能获得对多种血清型的保护作用。此外，该血清型的MOMP编码基因的序列已清楚，且较广泛地以合成肽为基础进行了表位研究，因此，本研究选择D型MOMP的VDI～VDIV编码基因作为目的基因。
本研究所选用的表达系统是由Curtiss等构建的一种鼠伤寒杆菌致死性平衡系统[6-8]，宿主菌X4550的cya和crp基因经突变减毒和门冬氨酸-β-半醛脱氢酶基因(asd)突变而产生的菌株。asd基因编码的产物是生物合成二氨基庚二酸(DAP)途径中的一种酶，而DAP又是合成革兰氏阴性菌细胞壁肽聚糖的重要成分，由于哺乳动物组织中不含DAP，因此，该突变菌在不含DAP的培养基中或动物体内不能繁殖。我们所用系统已应用于多种病原体的疫苗研究。宿主菌X4550含有正常量的脂多糖(LPS)，为光滑型。该菌株不能用常规的CaCl2法转化，只能用电穿孔法或噬菌体转导。
, 百拇医药
所构建的重组疫苗株经SDS-PAGE和凝胶薄层扫描，测得表达产物约占菌体蛋白总量的13%，且能与抗Ct的种特异性mAbN22结合，表明其具有Ct种特异性表位，因此，很有可能刺激机体产生对Ct多种血清型的保护性免疫。
作者简介：白光春，男，31岁，讲师，博士
白光春(第四军医大学微生物学教研室，陕西 西安 710032)
李元(第四军医大学微生物学教研室，陕西 西安 710032)
董辉(第四军医大学微生物学教研室，陕西 西安 710032)
李别虎(第四军医大学微生物学教研室，陕西 西安 710032)
薛莹(第四军医大学微生物学教研室，陕西 西安 710032)
, http://www.100md.com
范雄林(第四军医大学微生物学教研室，陕西 西安 710032)
马文煜(第四军医大学微生物学教研室，陕西 西安 710032)
参考文献：
[1]金冬雁，黎孟枫，编译.《分子克隆实验指南》[M].第2版，北京：科学出版社，1992：16-69.
[2]Dower WJ,Miller JF， Ragsdale CW.High efficiency transformation of E.coli by high voltage electroporation[J].Nucleic Acids Res,1988;16(13):6127-6145.
[3]Sayada C,Denamur E,Elion J.Complete sequence of the major outer membrane protein- encoding gene of Chlamydia trachomatis Serovar D[J].Gene,1992;120(1):129-130.
, http://www.100md.com
[4]Sayada C,Vretou E,Orfila J,et al.Heterogeneity within the first constant segment of the major outer membrane protein gene in Chlamydia trachomatis serovar D/Da[J].C R Acad Sci III Sci,1995;318(9):943-949.
[5]Curtiss R.III,Kelly SM.Salmonella typhimurium deletion mutants lacking adenylate cyclase and cyclic AMP receptor protein are avirulent and immunogenic[J].Infect Immun,1987;55(12):3035-3043.
[6]Curtiss R,III,Goldschmidt RM,Fletchall NB,et al.Avirulent Salmonella typhimurium Δ cya Δ crp oral vaccine strains expressing a streptococcal colonization and virulence antigen[J].Vaccine,1988;6:155-160.
[7]Nakayama K,Kelly SM,Curtiss R.III.Construction of an asd+ expression-cloning vector:stable maintenance and high level expression of cloned genes in a Salmonella vaccine strain[J].Biotechnol,1988;6:693-697., 百拇医药
白光春 李元 董辉 李别虎 薛莹 范雄林 马文煜
摘 要：目的 采用作为疫苗载体的减毒鼠伤寒杆菌致死性平衡系统，构建能异源表达沙眼衣原体(Ct)主要外膜蛋白(MOMP)的重组菌株。方法 以D型Ct的DNA为模板，用所设计的特异性引物扩增编码CtMOMP高变区(VDI～VDIV)基因，并将扩增产物定向克隆至质粒pUC19中。序列分析后，再亚克隆至与减毒鼠伤寒杆菌X4550互补的质粒pYA3341中，以重组质粒转化减毒鼠伤寒杆菌X4550。结果 对构建的重组菌以种特异性抗CtMOMP单克隆抗体(mAb)做蛋白印迹表明，在相对分子质量(Mr)约为33000处表达有1条带，表达量约占菌体总蛋白的13%。结论 成功地构建了能表达MOMP的重组菌株并获得表达。
, 百拇医药
关键词：沙眼衣原体；主要外膜蛋白；减毒鼠伤寒杆菌；基因克隆；基因表达
沙眼衣原体(Ct)是感染致盲和性传播疾病最常见的病原体，目前仍无成熟的疫苗。疫苗研究中的主要问题是，不能有效地刺激机体产生特异性粘膜免疫。减毒沙门氏菌不仅可用于预防沙门氏菌的感染，还可作为异源抗原的载体，构建能表达其它病原体保护性抗原的活疫苗。通过口服免疫形成自限性感染，在免疫动物或人体内稳定、高效地表达外源抗原，获得相应粘膜的局部免疫、体液免疫和细胞免疫。此外，该类疫苗具有安全、高效、简便和经济等优点，将Ct的主要外膜蛋白(MOMP)与其重组后，通过口服免疫诱发特异性粘膜免疫有可能成为预防Ct感染的有效途径之一。本研究采用作为口服疫苗载体的减毒鼠伤寒杆菌致死性平衡系统，构建了能异源表达CtMOMP的重组菌株。
1材料和方法
1.1材料 鼠伤寒杆菌X4550为crp-1和cya-1基因突变减毒、asd基因突变营养缺限株，具有奈啶酮酸(NA)抗性；E.coliX6212为asd基因突变株，具有NA抗性，两种菌株均由美国圣路易斯华盛顿大学Curtiss博士提供。沙眼衣原体D血清型由丹麦菌种保存中心提供。质粒pYA3341为沙门氏菌asd+质粒载体，能与asd基因突变菌株互补，由Curtiss博士提供。内切酶EcoRI，PstI和Taq酶，T4DNA连接酶，均购自华美生物公司。二氨基庚二酸(DAP)和NA为美国Sigma公司产品，由Curtiss博士惠赠。CtMOMP种特异性mAbN22，购自协和医科大学。
, 百拇医药
1.2方法
1.2.1PCR引物的设计 设计的CtD型MOMP的VDI～VDIV区特异性引物序列为P1：5′-GGA-ATTCCAGCCAAGCCTACAACTG，含EcoRI酶切位点；P2：5′-GCTGCAGCTACATTGTGTCTCCGAG,含PstI酶切位点和终止码，均由上海生物工程中心合成。
1.2.2CtDNA的提取 待McCoy细胞培养物长成单层后，弃去培养液，加入D型Ct(0.1mL/25L瓶)，于37℃摇床振荡1h。补充培养液(含1mg/L放线菌酮)，在50mL/LCO2条件下于37℃继续培养48h。以无菌玻棒刮取细胞，加入5mL沙眼衣原体D型培养物，离心(10000r/min)10min。取沉淀，重悬于50μL裂解液(10×PCR缓冲液5μL，4.5%吐温-205μL,4.5%NP-405μL，20g/L蛋白酶K0.5μL和水34.5μL)中，依次置于55℃水浴1h，95℃水浴10min，使蛋白酶K灭活，离心(8000r/min)1min。取上清，用酚—氯仿抽提、无水乙醇沉淀，溶于20μL水中备用。
, 百拇医药
1.2.3表达载体的构建 按图1所示，参照文献[1]构建表达载体。将重组质粒pUC19-780DNA纯化后，用荧光标记双脱氧末端终止法，进行双向全自动序列分析。
1.2.4重组质粒的表达 以低温CaCl2法制备X6212感受态细胞(所用LB培养基中需加50mg/L的DAP)。将pYA3341DNA和回收的780bp片段连接，取连接产物10μL转化X6212。随机挑选6个菌落，分别接种于5mL含50mg/LNA的LB培养液中，于37℃振荡培养过夜。取3mL菌沉淀，以碱变性法提取质粒DNA，并用EcoRI和PstI双酶切鉴定。
将用LB培养基培养的X6212(pYA3341-780)阳性重组子，以常规碱变性法提取质粒，参照文献[2]用电穿孔法转化X4550。转化条件为：电容25μF/电压2.5kV/电阻200Ω。将转化菌铺于LB平板，37℃培养过夜后，随机挑选6个菌落，分别接种于5mL含50mg/LNA的LB培养液中，再于37℃振荡培养过夜。取3mL菌沉淀，以碱变性法提取质粒DNA，并用EcoRI和PstI双酶切鉴定。另外，将重组菌X4550(pYA3341-780)及空载菌X4550(pYA3341)用LB培养基37℃培养18h后裂解，进行12%SDS-PAGE，并通过凝胶薄层扫描测定其表达量。
, 百拇医药
1.2.5表达产物的鉴定 将所构建的重组菌及其对照菌株X4550(pYA3341)在LB培养基中于37℃培养18h，进行12%SDS-PAGE，并转移至硝酸纤维素膜上，用10g/LBSA封闭过夜，加抗MOMP种特异性mAbN22作用1h，以10mmol/LPBS(pH7.2)洗涤后，加HRP标记的羊抗鼠IgG作用1h，以DAB显色观察结果。
图1重组质粒pYA3341-780的构建
Fig1 Construction of the recombinant plasmid pYA3341-780
2结果
2.1MOMP基因的扩增、克隆及序列分析 以Ct基因组DNA为模板，以P1和P2为引物做PCR，经30个循环获得780bp的特异性扩增带。将扩增产物与质粒pUC19连接转化JM109。随机挑选6个白色克隆，提取质粒经EcoRI和PstI双酶切后，有4个克隆切出780bp大小的片段，命名为pUC19-780。其中6号阳性克隆经双向自动测序，所得全序列与文献[3，4]的报道完全一致。
, http://www.100md.com
2.2MOMP基因表达载体的构建 将纯化的重组质粒pUC19-780DNA用EcoRI和PstI双酶切，回收780bp产物，与用相同酶切的质粒pYA3341连接，转化X6212感受态细胞。转化后在选择平板上随机挑选6个克隆，提取质粒用EcoRI和PstI双酶切，有5个克隆切出780bp的片段，命名为pYA3341-780。所制备的质粒pYA3341-780用EcoRI和PstI双酶切鉴定后，通过电穿孔法转化感受态χ4550。在所设置的条件下，以12.5kV/cm的脉冲持续4.9ms，转化效率大于107。随机挑选6个菌落，提取质粒后用EcoRI和PstI双酶
切鉴定，结果均为阳性，将该重组菌株命名为X4550(pYA3341-780)。
2.3重组菌的表达及其产物的鉴定 将重组菌X4550(pYA3341-780)和对照菌X4550(pYA3341)用含NA但不含DAP的LB培养基培养后，经12%SDS-PAGE，发现约在Mr为33000处有1条蛋白带，同预计的大小相吻合。经凝胶薄层扫描，测得重组菌表达带的蛋白量约占菌体总蛋白的13%。将其与抗MOMP种特异性mAbN22做免疫印迹，X4550(pYA3341-780)菌在Mr为33000处有1条反应带；而对照菌X4550(pYA3341)则无此带，表明Mr为33000的表达产物含有能与抗Ct种特异性mAb相结合的表位。
, http://www.100md.com
3讨论
MOMP是目前研究最多的Ct候选疫苗成分。该蛋白占Ct外膜总蛋白的60%，是中和抗体的主要靶位。根据MOMP的抗原性，用特异性mAb可将Ct分为3个血清组、18个血清型。各型的MOMP均含有VDI～VDIV4个高变区，其中型特异性表位主要位于VDI和VDII，种和亚种特异性表位多位于VDIV。18个血清型均可引起眼和/或生殖道感染，理想的疫苗应能保护两种主要的感染方式。其中D血清型可引起眼和生殖道感染，是全球流行最广泛的型别之一[5]。以D型MOMP的VDI～VDIV作为抗原，不仅有可能获得对D型的保护作用，还有可能获得对多种血清型的保护作用。此外，该血清型的MOMP编码基因的序列已清楚，且较广泛地以合成肽为基础进行了表位研究，因此，本研究选择D型MOMP的VDI～VDIV编码基因作为目的基因。
本研究所选用的表达系统是由Curtiss等构建的一种鼠伤寒杆菌致死性平衡系统[6-8]，宿主菌X4550的cya和crp基因经突变减毒和门冬氨酸-β-半醛脱氢酶基因(asd)突变而产生的菌株。asd基因编码的产物是生物合成二氨基庚二酸(DAP)途径中的一种酶，而DAP又是合成革兰氏阴性菌细胞壁肽聚糖的重要成分，由于哺乳动物组织中不含DAP，因此，该突变菌在不含DAP的培养基中或动物体内不能繁殖。我们所用系统已应用于多种病原体的疫苗研究。宿主菌X4550含有正常量的脂多糖(LPS)，为光滑型。该菌株不能用常规的CaCl2法转化，只能用电穿孔法或噬菌体转导。
, 百拇医药
所构建的重组疫苗株经SDS-PAGE和凝胶薄层扫描，测得表达产物约占菌体蛋白总量的13%，且能与抗Ct的种特异性mAbN22结合，表明其具有Ct种特异性表位，因此，很有可能刺激机体产生对Ct多种血清型的保护性免疫。
作者简介：白光春，男，31岁，讲师，博士
白光春(第四军医大学微生物学教研室，陕西 西安 710032)
李元(第四军医大学微生物学教研室，陕西 西安 710032)
董辉(第四军医大学微生物学教研室，陕西 西安 710032)
李别虎(第四军医大学微生物学教研室，陕西 西安 710032)
薛莹(第四军医大学微生物学教研室，陕西 西安 710032)
, http://www.100md.com
范雄林(第四军医大学微生物学教研室，陕西 西安 710032)
马文煜(第四军医大学微生物学教研室，陕西 西安 710032)
参考文献：
[1]金冬雁，黎孟枫，编译.《分子克隆实验指南》[M].第2版，北京：科学出版社，1992：16-69.
[2]Dower WJ,Miller JF， Ragsdale CW.High efficiency transformation of E.coli by high voltage electroporation[J].Nucleic Acids Res,1988;16(13):6127-6145.
[3]Sayada C,Denamur E,Elion J.Complete sequence of the major outer membrane protein- encoding gene of Chlamydia trachomatis Serovar D[J].Gene,1992;120(1):129-130.
, http://www.100md.com
[4]Sayada C,Vretou E,Orfila J,et al.Heterogeneity within the first constant segment of the major outer membrane protein gene in Chlamydia trachomatis serovar D/Da[J].C R Acad Sci III Sci,1995;318(9):943-949.
[5]Curtiss R.III,Kelly SM.Salmonella typhimurium deletion mutants lacking adenylate cyclase and cyclic AMP receptor protein are avirulent and immunogenic[J].Infect Immun,1987;55(12):3035-3043.
[6]Curtiss R,III,Goldschmidt RM,Fletchall NB,et al.Avirulent Salmonella typhimurium Δ cya Δ crp oral vaccine strains expressing a streptococcal colonization and virulence antigen[J].Vaccine,1988;6:155-160.
[7]Nakayama K,Kelly SM,Curtiss R.III.Construction of an asd+ expression-cloning vector:stable maintenance and high level expression of cloned genes in a Salmonella vaccine strain[J].Biotechnol,1988;6:693-697., 百拇医药