“匹多莫德”片剂的药物动力学和相对生物利用度研究
http://www.100md.com
中国药学会
刘 芸 王曼丽 郭红英 王汝龙
北京友谊医院临床药理研究室
摘 要 本实验采用HPLC法，以意大利普利化学工业公司生产的普利莫口服液(400mg/支)为对照品，对多肽药物研究所生产的匹多莫德片剂(400mg/片)的相对生物利用度和药物动力学参数迸行了测定。本实验选取健康男性志愿者18名，采用自身对照法，交叉单剂量口服意大利普利化学工业公司生产的普利莫口服液及多肽药物研究所生产的匹多莫德片剂各800mg，在规定的取样点取血，血样经过提取后迸HPLC，测定血药浓度。其数据经统计处理，结果显示匹多莫德片剂的半衰期T1/2为4.34±3.90h，达峰时间Tmax为2.50±0.34h，平均滞留时间MRT为5.25±0.89h，达峰浓度Cmax为6.20±2.41g/ml，药时曲线下面积AUC为27.7±8.20h.μg/ml，样品与对照品的相对生物利用度F为100.73±18.91%。
, 百拇医药
关键词：匹多莫德 药物动力学 相对生物利用度 HPLC
匹多莫德片剂的主要活性成份是吡酮莫特(pidotimod)，是一种全合成的免疫刺激调节剂，通过刺激和调节细胞免疫产生效应。成人预防量为每次800mg，每日一次。本实验的目的是以意大利普利化学工业公司生产的普利莫口服液(400mg/支)为对照品利用健康志愿者验证多肽药物研究所生产的匹多莫得片剂(200mg/片)的相对生物利用度和药物动力学特征。
1 实验仪器与试药：
1.1 仪器
Shimadzu 6A系列高效液相色谱仪(日本Shimadzu公司)； IKA minishaker马来西亚产；80—2B型高心机(4000r/m)；TDx高速离心机(美固ABBOTT公司)；AP—01溶剂过滤器(奥特赛恩斯[天津]仪器有限公司)；TP200B超声波清洗机(天鹏电子新技术[北京]有限公司)
, 百拇医药
1.2 药品及试剂
药品：标准品：匹多莫德(99.9%)，多肽药物研究所提供；样品：匹多莫得片剂(200mg/片)，多肽药物研究所生产；对照品：普利莫口服液(400mg/支)，意大利普利化学工业公司生产。试剂：甲醇乙腈(均为色谱纯)KH2PO4磷酸(均为分析纯)
2 血药浓度测定方法的建立：
2.1 色谱条件：
色谱柱：ALLTIMA NH2 5μ柱 250mm×4.6mm；预拄：4mm× 2mmNH2柱；流动相：乙腈：0.02MpH3.2磷酸盐缓冲液=75:25；流速：1.0ml/min；检测器：Shimadau SPD-6AV UV 检测器；检测波长：210nm。
, http://www.100md.com 2.2 受试者的选择及试验方法：
2.2.1 受试者的选择：
本试验选用健康男性志愿者18名，年龄18～35岁，体重为53～ 80公斤。受试者均先经充分的体检，并由生化、尿液、血相等检查确认其健康状态。受试者在试验前应详细告知以试验内容、试验药物的作用和可能发生的副反应、受试者的权利和义务，并签署同意书之后，方可参加试验。
2.2.2 试验方法：
本实验采用双处理、两周期随机交叉实验投计，将受试者随机分成两组，每组9人。第一组于第一周期单剂量口服多肽药物研究所生产的匹多莫德片剂800mg，于第二周期单剂量口服意大利普利工业公司生产的普利莫口服液800mg，第二组于第一周期单剂量口服意大利普利化学工业公司生产的普利莫口服液80Omg，于第二周期单剂量口服多肽药物研究所生产的匹多莫德片剂800mg，清洗期为一周。每次给药之前，每名受试者均先经过夜禁食十小时以上，然后给药。服药前先取一空白血，然后每名受试者均统一以200ml水口服给予匹多莫德片剂或普利莫口服液 800mg，并于服药后0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，4.0，5.0，8.0，12.0，24.0小时前臂取血3ml，肝素抗凝，分离血浆，测定其血药浓度，求出Tmax，Cmax，T1/2，MRT，AUC0_∞，F等，样品匹多莫德片剂与对照普利莫口服液比较，求出相对生物利用度，并对其药物动力学参数进行统计学分析。
, 百拇医药
表1 生物利用度交叉实验设计表
受试者
周期I服用药物
周期Ⅱ服用药物
A
T
R
B
T
R
C
T
R
, 百拇医药
D
T
R
E
R
T
F
T
R
G
R
T
H
R
, http://www.100md.com
T
I
T
R
J
R
T
K
R
T
L
R
T
M
, 百拇医药
T
R
N
T
R
O
R
T
P
R
T
Q
R
T
, 百拇医药
R
T
R
2.3 标准曲线的制备：
2.3.1 标准溶液的配制：
精密称取100mg匹多莫德标准品，用蒸馏水定容至100ml，得浓度为1mg/ml的标准液。精密吸取10ml、7.5ml、5ml、2.5ml、1ml的标准液，用蒸馏水定容至100ml，分别得浓度为100μg/ml、75μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、10μg/ml的标准液。
2.3.2 标准曲线的制备：
取空白血浆6份各500μl，分置6个具塞离心管中，分别加入不同量的匹多莫德标准液，使其血浆浓度分别为0，1.0，2.5，5.0，7.5，10.0μg/ml，加入500μl乙晴，涡旋振荡1分钟，高速离心(10000rpm)10分钟。取上清液20μl进HPLC。每个浓度各做5次；取平均值，以浓度对蜂面积进行线性回归，得回归方程如下：Conc(μg/ml)=7.18×10-5×Area+0.023 (γ= 0.9997)
, http://www.100md.com
2.4 血浆样品的测定：
取样品血浆500μl，加入乙晴500μl，涡旋振荡1分钟，高速离心(10000rpm)10分钟，取上清液20μl进HPLC.
2.5 方法评价：
2.5.1 最低检测浓度：0.0144μg/m1(以仪器所能检测的最小蜂面积带入浓度-面积公式计算)
2.5.2 绝对回收率试验：
取3份空白血浆各500μl，加入不同浓度的匹多莫德标准液，使其浓度分别为1.0μg/ml，5.0μg/ml，10.0g/ml，按标准曲线制备项下方法进行提取测定，并与相应浓度的匹多莫德标准液测定值进行比较，每个浓度做5次，计算回收率。结果见表2：
表2 匹多莫德高、中、低浓度回收率(n=5)
, 百拇医药
浓度(µg/ml)
回收率%(X±SD)
RSD(%)
10.0
91.00%±4.99%
5.49%
5.0
86.76%±7.72%
8.90%
1.0
79.52%±7.51%
9.45%
, http://www.100md.com
平均回收率%
86.99%±7.68%
2.5.3 方法回收率：
取3份空白血浆各500μl，加入不同浓度的匹多莫德标准液，使其浓度分别为1.0μg/ml，50μg/ml，按标准曲红制备项下方法进行提取测定，重复5次，并与由标准工作曲线回归方程计算出的浓度进行比较，计算方法回收率。
表3 方法回收率表
加入量
(μg/ml)
检出量
(μg/ml)
, 百拇医药
回收率
(%)
平均回收率
(%)
RSD
(%)
1.0
0.960
0.946
0.846
0.969
0.780
96.0
, 百拇医药
94.6
84.6
96.6
78.0
90.0
9.2
5.0
5.41
5.23
4.80
4.98
4.28
108.2
, 百拇医药
104.6
96.0
99.6
85.6
98.8
8.8
10.0
10.03
10.59
9.64
9.12
9.95
100.3
, 百拇医药
105.9
96.4
91.2
9905
98.7
2.5.4 精密度：
取3份空白血浆各500μl，加入不同浓度的匹多莫德标准液，使其浓度分别为1.0μg/ml，5.0μg/ml，10.0g/ml，同标准曲线制备项下方法进行提取测定，每一浓度在同一天内提取、测定5次，计算日内精密度及变异系数；另每一浓度每天各提取测定1次，共5天，计算其日间精密度及变异系数。结果见表4
表4 匹多莫德高、中、低浓度精密度(n=5)
, 百拇医药
浓度
(µg/ml)
日内精密度(n=5)
日间精密度(n=5)
(XSD)(µg/ml)
RSD%
(XSD)(µg/ml)
RSD%
1.0
0.90±0.08
9.25
, http://www.100md.com 1.00±0.09
9.41
5.0
4.94±0.44
8.83
5.07±0.43
8.58
10.0
9.87±0.54
5.47
9.24±0.40
4.31
3 实验结果：
, http://www.100md.com
3.1 药物动力学参数
根据血药浓度时间数据，进行统计学处理。曲线下面积按梯形法汁算，达峰时间Tmax、Cmax按实测值计算。
3.1.1 以意大利普利化学工业公司的普利莫口服液为对照品计算单剂量口服多肽药物研究所的匹多莫德片剂的药动学参数以及相对生物利用度。
3.1.3 多肽药物研究所的匹多莫德片剂与意大利普利化学工业公司的普利莫口服液生物等效性比较将试验品和对照品的药动学参数进行方差分析和双单侧t检验，比较生物等效性，结果见表6-表9。
表6 AUC(0-Tn)方差分析表(数据经对数转换后)
方差来源
自由度
, 百拇医药
离差平方和
均方
F值
P值
个体间
17
2.263
0.133
14.646
0.000
周期间
1
0.027
, 百拇医药
0.027
3.011
0.102
制剂间
1
0.005
0.005
0.510
0.485
误 差
16
0.145
0.009
, 百拇医药
总变异
35
2.441
表7 AUC(0-Tn)双单侧t检验和90%置信区间
试验品均值：
3.175
对照品均值
3.198
误差均方的平方根：
t1：
90%置信区间：
, http://www.100md.com
0.095
6.301
92.46%-103.32%
t(0.05，16)
t2：
1.746
7.741
结论：试验品和对照品生物等效
表8 Cmax方差分析表(数据经对数转换后)
方差来源
自由度
, 百拇医药
离差平方和
均方
F值
P值
个体间
17
3.300
0.194
8.479
0.000
周期间
1
0.009
, 百拇医药
0.009
0.373
0.550
制剂间
1
0.008
0.008
0.349
0.563
误 差
16
0.366
0.023
, 百拇医药
总变异
35
3.683
结论：试验品和对照品生物等效
表9 Cmax双单侧t检验和90%置信区间
试验品均值：
1.763
对照品均值：
1.733
误差均方的平方根：
O.151
t(O.05，16)
, 百拇医药
1.746
t1：
5.016
t2:
3.832
90%置信区间：94.34%-112.51%
4 结论 本实验取意大利普利化学工业公司的普利莫口服液(400mg/支)作为对照品，对多肽药物研究所的匹多莫德片剂(200mg/片)的相对生物利用度和药物动力学参数迸行了测定。实验结果表明：多肽药物研究所的匹多莫得片与对照品意大利普利化学工业公司的普利莫口服液相比较其相对生物利用度为1OO.73±18.91%，符合《新药(西药)临床研究指导原则汇编》所规定的生物利用度范围，多肽药物研究所的匹多莫德片剂与意大利普利化学工业公司的普利莫口服液生物等效。
国家药品监督管理局药品注册司
二OO一年三月二十八日, 百拇医药
北京友谊医院临床药理研究室
摘 要 本实验采用HPLC法，以意大利普利化学工业公司生产的普利莫口服液(400mg/支)为对照品，对多肽药物研究所生产的匹多莫德片剂(400mg/片)的相对生物利用度和药物动力学参数迸行了测定。本实验选取健康男性志愿者18名，采用自身对照法，交叉单剂量口服意大利普利化学工业公司生产的普利莫口服液及多肽药物研究所生产的匹多莫德片剂各800mg，在规定的取样点取血，血样经过提取后迸HPLC，测定血药浓度。其数据经统计处理，结果显示匹多莫德片剂的半衰期T1/2为4.34±3.90h，达峰时间Tmax为2.50±0.34h，平均滞留时间MRT为5.25±0.89h，达峰浓度Cmax为6.20±2.41g/ml，药时曲线下面积AUC为27.7±8.20h.μg/ml，样品与对照品的相对生物利用度F为100.73±18.91%。
, 百拇医药
关键词：匹多莫德 药物动力学 相对生物利用度 HPLC
匹多莫德片剂的主要活性成份是吡酮莫特(pidotimod)，是一种全合成的免疫刺激调节剂，通过刺激和调节细胞免疫产生效应。成人预防量为每次800mg，每日一次。本实验的目的是以意大利普利化学工业公司生产的普利莫口服液(400mg/支)为对照品利用健康志愿者验证多肽药物研究所生产的匹多莫得片剂(200mg/片)的相对生物利用度和药物动力学特征。
1 实验仪器与试药：
1.1 仪器
Shimadzu 6A系列高效液相色谱仪(日本Shimadzu公司)； IKA minishaker马来西亚产；80—2B型高心机(4000r/m)；TDx高速离心机(美固ABBOTT公司)；AP—01溶剂过滤器(奥特赛恩斯[天津]仪器有限公司)；TP200B超声波清洗机(天鹏电子新技术[北京]有限公司)
, 百拇医药
1.2 药品及试剂
药品：标准品：匹多莫德(99.9%)，多肽药物研究所提供；样品：匹多莫得片剂(200mg/片)，多肽药物研究所生产；对照品：普利莫口服液(400mg/支)，意大利普利化学工业公司生产。试剂：甲醇乙腈(均为色谱纯)KH2PO4磷酸(均为分析纯)
2 血药浓度测定方法的建立：
2.1 色谱条件：
色谱柱：ALLTIMA NH2 5μ柱 250mm×4.6mm；预拄：4mm× 2mmNH2柱；流动相：乙腈：0.02MpH3.2磷酸盐缓冲液=75:25；流速：1.0ml/min；检测器：Shimadau SPD-6AV UV 检测器；检测波长：210nm。
, http://www.100md.com 2.2 受试者的选择及试验方法：
2.2.1 受试者的选择：
本试验选用健康男性志愿者18名，年龄18～35岁，体重为53～ 80公斤。受试者均先经充分的体检，并由生化、尿液、血相等检查确认其健康状态。受试者在试验前应详细告知以试验内容、试验药物的作用和可能发生的副反应、受试者的权利和义务，并签署同意书之后，方可参加试验。
2.2.2 试验方法：
本实验采用双处理、两周期随机交叉实验投计，将受试者随机分成两组，每组9人。第一组于第一周期单剂量口服多肽药物研究所生产的匹多莫德片剂800mg，于第二周期单剂量口服意大利普利工业公司生产的普利莫口服液800mg，第二组于第一周期单剂量口服意大利普利化学工业公司生产的普利莫口服液80Omg，于第二周期单剂量口服多肽药物研究所生产的匹多莫德片剂800mg，清洗期为一周。每次给药之前，每名受试者均先经过夜禁食十小时以上，然后给药。服药前先取一空白血，然后每名受试者均统一以200ml水口服给予匹多莫德片剂或普利莫口服液 800mg，并于服药后0.5，1.0，1.5，2.0，2.5，3.0，4.0，5.0，8.0，12.0，24.0小时前臂取血3ml，肝素抗凝，分离血浆，测定其血药浓度，求出Tmax，Cmax，T1/2，MRT，AUC0_∞，F等，样品匹多莫德片剂与对照普利莫口服液比较，求出相对生物利用度，并对其药物动力学参数进行统计学分析。
, 百拇医药
表1 生物利用度交叉实验设计表
受试者
周期I服用药物
周期Ⅱ服用药物
A
T
R
B
T
R
C
T
R
, 百拇医药
D
T
R
E
R
T
F
T
R
G
R
T
H
R
, http://www.100md.com
T
I
T
R
J
R
T
K
R
T
L
R
T
M
, 百拇医药
T
R
N
T
R
O
R
T
P
R
T
Q
R
T
, 百拇医药
R
T
R
2.3 标准曲线的制备：
2.3.1 标准溶液的配制：
精密称取100mg匹多莫德标准品，用蒸馏水定容至100ml，得浓度为1mg/ml的标准液。精密吸取10ml、7.5ml、5ml、2.5ml、1ml的标准液，用蒸馏水定容至100ml，分别得浓度为100μg/ml、75μg/ml、50μg/ml、25μg/ml、10μg/ml的标准液。
2.3.2 标准曲线的制备：
取空白血浆6份各500μl，分置6个具塞离心管中，分别加入不同量的匹多莫德标准液，使其血浆浓度分别为0，1.0，2.5，5.0，7.5，10.0μg/ml，加入500μl乙晴，涡旋振荡1分钟，高速离心(10000rpm)10分钟。取上清液20μl进HPLC。每个浓度各做5次；取平均值，以浓度对蜂面积进行线性回归，得回归方程如下：Conc(μg/ml)=7.18×10-5×Area+0.023 (γ= 0.9997)
, http://www.100md.com
2.4 血浆样品的测定：
取样品血浆500μl，加入乙晴500μl，涡旋振荡1分钟，高速离心(10000rpm)10分钟，取上清液20μl进HPLC.
2.5 方法评价：
2.5.1 最低检测浓度：0.0144μg/m1(以仪器所能检测的最小蜂面积带入浓度-面积公式计算)
2.5.2 绝对回收率试验：
取3份空白血浆各500μl，加入不同浓度的匹多莫德标准液，使其浓度分别为1.0μg/ml，5.0μg/ml，10.0g/ml，按标准曲线制备项下方法进行提取测定，并与相应浓度的匹多莫德标准液测定值进行比较，每个浓度做5次，计算回收率。结果见表2：
表2 匹多莫德高、中、低浓度回收率(n=5)
, 百拇医药
浓度(µg/ml)
回收率%(X±SD)
RSD(%)
10.0
91.00%±4.99%
5.49%
5.0
86.76%±7.72%
8.90%
1.0
79.52%±7.51%
9.45%
, http://www.100md.com
平均回收率%
86.99%±7.68%
2.5.3 方法回收率：
取3份空白血浆各500μl，加入不同浓度的匹多莫德标准液，使其浓度分别为1.0μg/ml，50μg/ml，按标准曲红制备项下方法进行提取测定，重复5次，并与由标准工作曲线回归方程计算出的浓度进行比较，计算方法回收率。
表3 方法回收率表
加入量
(μg/ml)
检出量
(μg/ml)
, 百拇医药
回收率
(%)
平均回收率
(%)
RSD
(%)
1.0
0.960
0.946
0.846
0.969
0.780
96.0
, 百拇医药
94.6
84.6
96.6
78.0
90.0
9.2
5.0
5.41
5.23
4.80
4.98
4.28
108.2
, 百拇医药
104.6
96.0
99.6
85.6
98.8
8.8
10.0
10.03
10.59
9.64
9.12
9.95
100.3
, 百拇医药
105.9
96.4
91.2
9905
98.7
2.5.4 精密度：
取3份空白血浆各500μl，加入不同浓度的匹多莫德标准液，使其浓度分别为1.0μg/ml，5.0μg/ml，10.0g/ml，同标准曲线制备项下方法进行提取测定，每一浓度在同一天内提取、测定5次，计算日内精密度及变异系数；另每一浓度每天各提取测定1次，共5天，计算其日间精密度及变异系数。结果见表4
表4 匹多莫德高、中、低浓度精密度(n=5)
, 百拇医药
浓度
(µg/ml)
日内精密度(n=5)
日间精密度(n=5)
(XSD)(µg/ml)
RSD%
(XSD)(µg/ml)
RSD%
1.0
0.90±0.08
9.25
, http://www.100md.com 1.00±0.09
9.41
5.0
4.94±0.44
8.83
5.07±0.43
8.58
10.0
9.87±0.54
5.47
9.24±0.40
4.31
3 实验结果：
, http://www.100md.com
3.1 药物动力学参数
根据血药浓度时间数据，进行统计学处理。曲线下面积按梯形法汁算，达峰时间Tmax、Cmax按实测值计算。
3.1.1 以意大利普利化学工业公司的普利莫口服液为对照品计算单剂量口服多肽药物研究所的匹多莫德片剂的药动学参数以及相对生物利用度。
3.1.3 多肽药物研究所的匹多莫德片剂与意大利普利化学工业公司的普利莫口服液生物等效性比较将试验品和对照品的药动学参数进行方差分析和双单侧t检验，比较生物等效性，结果见表6-表9。
表6 AUC(0-Tn)方差分析表(数据经对数转换后)
方差来源
自由度
, 百拇医药
离差平方和
均方
F值
P值
个体间
17
2.263
0.133
14.646
0.000
周期间
1
0.027
, 百拇医药
0.027
3.011
0.102
制剂间
1
0.005
0.005
0.510
0.485
误 差
16
0.145
0.009
, 百拇医药
总变异
35
2.441
表7 AUC(0-Tn)双单侧t检验和90%置信区间
试验品均值：
3.175
对照品均值
3.198
误差均方的平方根：
t1：
90%置信区间：
, http://www.100md.com
0.095
6.301
92.46%-103.32%
t(0.05，16)
t2：
1.746
7.741
结论：试验品和对照品生物等效
表8 Cmax方差分析表(数据经对数转换后)
方差来源
自由度
, 百拇医药
离差平方和
均方
F值
P值
个体间
17
3.300
0.194
8.479
0.000
周期间
1
0.009
, 百拇医药
0.009
0.373
0.550
制剂间
1
0.008
0.008
0.349
0.563
误 差
16
0.366
0.023
, 百拇医药
总变异
35
3.683
结论：试验品和对照品生物等效
表9 Cmax双单侧t检验和90%置信区间
试验品均值：
1.763
对照品均值：
1.733
误差均方的平方根：
O.151
t(O.05，16)
, 百拇医药
1.746
t1：
5.016
t2:
3.832
90%置信区间：94.34%-112.51%
4 结论 本实验取意大利普利化学工业公司的普利莫口服液(400mg/支)作为对照品，对多肽药物研究所的匹多莫德片剂(200mg/片)的相对生物利用度和药物动力学参数迸行了测定。实验结果表明：多肽药物研究所的匹多莫得片与对照品意大利普利化学工业公司的普利莫口服液相比较其相对生物利用度为1OO.73±18.91%，符合《新药(西药)临床研究指导原则汇编》所规定的生物利用度范围，多肽药物研究所的匹多莫德片剂与意大利普利化学工业公司的普利莫口服液生物等效。
国家药品监督管理局药品注册司
二OO一年三月二十八日, 百拇医药