灯盏花素注射液的溶栓作用及其对PAI-1tPA活性的调控
【摘要】 目的 评价灯盏花素注射液对大鼠的溶栓作用及其对组织型纤溶酶原激活物(tissue-type plasminogen activaˉtor，tPA)和纤溶酶原激活物抑制物(plasminogen activator inhibitor type-1，PAI-1)活性的影响。方法 采用改良的Charlton和Tomihisa等方法建立大鼠颈动脉血栓模型并评价灯盏花素注射液的溶栓作用;应用ELISA方法测定灯盏花素注射液在体外和体内(静脉注射)对血浆tPA、血浆中或血小板释放的PAI-1活性的影响。结果 6mg/kg灯盏花素注射液组的再通率为50%，再栓率为60%;12mg/kg灯盏花素注射液的血管再通率为60%，低于2万U/kg尿激酶80%的再通率，12mg/kg灯盏花素注射液的血管再栓率为42.9%，高于尿激酶25%的再栓率。再通后1h内，血管开放状态表现为，灯盏花素注射液(3～12mg/kg)随剂量的增大血管持续再栓数明显下降，而血管持续再通数显著升高。2万U/kg尿激酶组的血管开放状态明显好于12mg/kg的灯盏花素注射液组。灯盏花素注射液在体外或静脉注射均明显降低血浆PAI-1活性，同时提高血浆tPA的活性;灯盏花素注射液还明显抑制血小板释放的PAI-1活性。结论 灯盏花素注射液显著提高闭塞颈动脉的再通率，同时降低再通后颈动脉的再栓率;抑制血小板释放PAI-1并降低血浆中的PAI-1活性，同时提高tPA的活性是灯盏花素注射液具有较好溶栓作用的分子机制。
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关键词 灯盏花素注射液 尿激酶 血栓 溶栓 组织型纤溶酶原激活物 纤溶酶原激活物抑制物
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)19-2759-04
Thrombolytic effects of breviscapini injection and its
modulation on the activity of PAI-1and tPA
Shen Zhiqiang，Zhang Liuyi，Duan Li
Yunnan Pharmacological Laboratories of Natural Products，Kunming Medical College， Kunming650031.
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To investigate the thrombolytic effects of Breviscapini Injection and its influence on the activity of type1plasminogen activator inhibitor(PAI-1)/tissue-type plasminogen activator(tPA).Methods Charlton’s and Tomihisa’s methods were modified to evaluate the thrombolytic effect of Breviscapini Injection in rats，as well as its effect on carotid artery patency status.The activity of PAI-1in plasma or platelet releas and tPA in plasma was assayed by use of ELISA.Results The results showed that Breviscapini Injection significantly increased the reperfusion and decreased the reocclusion in rat carotid arteries，in a dose-dependent manner.One hour after sucˉcessful reperfusion，theincidence of carotid artery patency in the groups of Breviscapini Injection(3～12mg/kg)was gradually improved with the doses increasing.Breviscapini Injectionin vitro or intravenous injection，markedly supˉpressed PAI-1activity while elevated tPA activity;intravenous Breviscapini Injection also significantly inhibited PAI-1activity released from thrombin-activated platelets.Conclusion It is suggested that Breviscapini Injection inˉcreased the artery reperfusion and decreased the reocclusion of carotid artery.The inhibition of PAI-1activity and subsequent elevation of tPA activity might-contribute to the thrombolytic effect of Breviscapini Injection.
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Key words breviscapini injection urokinase thrombosis thrombolysis tissue-type plasminogen activator type1plasminogen activator inhibitor
组织型纤溶酶原激活物(tissue-type plasminogen activaˉtor，tPA)通过激活纤溶酶原形成纤溶酶而降解纤维蛋白，生成纤维蛋白降解产物，使堵塞在血管中的血栓溶解，以维持血流的通畅，即tPA是纤溶系统的启动因子 [1] ;纤溶酶原激活物抑制物(plasminogen activator inhibitor type-1，PAI-1)为tPA的生理快速抑制剂，它与tPA以1:1结合后使之迅速失去活性，导致纤维蛋白清除力下降、纤维蛋白沉积，同时与血管壁结合。换言之，PAI-1对纤溶系统起着起始抑制作用，降低tPA活性并因此减弱纤溶能力，促进血栓的形成和延展 [2] 。临床研究证实，急性心肌梗死、脑梗塞及深静脉血栓等血栓性疾病患者血浆的PAI-1活性异常增高，而tPA活性明显下降 [3，4] ;多数专家提出PAI-1是心脑血管等血栓栓塞性疾病的危险因子。
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灯盏花[Erigeron breviscapus(Vant.)Hand.-Mazz]，为菊科多年生草本植物，主要分布于我国云南、四川、贵州等省，尤以云南所产灯盏花闻名于世，产量约占全国的90%。民间主要用其防治中风偏瘫等疾病。灯盏花素注射液属灯盏花中提取分离的黄酮类物质，主要成分为灯盏乙素(4，5，6-三羟基黄酮—7—O—葡萄糖醛酸苷) [5] ，具有较好的改善心脑血管血流量，抗血小板聚集 [6] ，有效降低脑梗塞患者的纤维蛋白原和抗氧自由基等作用 [7] 。临床上多用于治疗脑血栓形成 [8] 、冠心病心绞痛、心肌缺血损伤等[9] ，是治疗心脑血管疾病的良药。然而目前，就灯盏花素注射液溶栓机制探讨较浅。
本研究采用Charlton和Tomihisa方法评价灯盏花素注射液对电刺激大鼠颈动脉血栓的溶解作用，运用ELISA方法测定灯盏花素注射液在体内外对大鼠血小板PAI-1活性及血浆tPA和PAI-1活性的影响，以评价灯盏花素注射液的溶栓作用及其作用机制。
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1 实验材料
1.1 动物 雄性SD大鼠，体重250～300g，由昆明医学院实验动物中心提供(合格证号:滇实动证字第2001034号)。
1.2 药物和试剂 灯盏花素注射液，规格:5mg/2ml，批准文号:ZZ-5795-滇卫药准字，批号:20020406，由云南省个旧生物药业有限公司提供。用前以生理盐水稀释。尿激酶从丽珠集团丽宝生化制药公司购买，用前溶于生理盐水中。人凝血酶由Sigma化学公司出品，用蒸馏水溶解。tPA和PAI-1的测定试剂盒购自上海医科大学。
1.3 主要仪器 电刺激仪(SEN-7203，日本Nihon Kohden公司产品);超声血流量仪(DVM-4200，日本Hayashi Denki公司生产);全自动酶标仪(EL340，美国Bio-Tek Instruments公司产品)。
2 方法与结果
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2.1 灯盏花素注射液对电刺激大鼠颈动脉血栓的溶解作用
2.1.1 血栓模型的制备 大鼠分为5组，每组10只。A组:生理盐水组;B组:2万U/kg尿激酶组;C～E组:3，6和12mg/kg的灯盏花素注射液组。改良Charlton等方法 [10] ，即用30mg/kg的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，分离大鼠左颈总动脉，置两根银制电极(间距0.8cm)，超声探针置远心端。用电刺激以2mA的直流电连续刺激大鼠颈动脉5min。用超声血流量仪连续探测颈动脉血流量。以血流量为刺激前的50%作为血栓形成。
2.1.2 灯盏花素注射液溶栓活性的测定 根据Tomihisa等方法 [11] ，以刺激结束后至血流量为刺激前的50%所需的时间定为血栓形成时间。形成血栓后20min，上述各组均经股静脉一次性注射，观察给药后1h内血管再通情况;该段时间内，若血管没有再通，则认为再通失败。若再通，则继续观察血管开放状态1h。以≥50%或≤25%的刺激前血流量者判定为持续再通或继后的再栓塞;再通后1h内，每只动物的颈动脉血流量以刺激前血流量为基线可分为≥50%，>25%至<50%，和≤25%。颈动脉血管开放程度分别为(1)持续栓塞(persistent occlusion，PO):无再通;(2)再通与再栓塞交错出现(cyclic reflow，CR);(3)再通后持续开放(persistent patency，PP):再通后无再栓塞。
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结果表明:6mg/kg的灯盏花素注射液，其再通率为50%，再栓率为60%;12mg/kg灯盏花素注射液的血管再通率为60%，低于2万U/kg尿激酶80%的再通率，12mg/kg灯盏花素注射液的血管再栓率为42.9%，高于尿激酶25%的再栓率;生理盐水组无一动物出现再通(表1)。再通后 1h内，血管开放状态表现为，生理盐水组均持续栓塞;灯盏花素注射液(3～12mg/kg)随剂量的增大血管持续再栓数明显下降，而血管再通数显著升高。2万U/kg尿激酶组的血管开放状态明显好于12mg/kg的灯盏花素注射液组(表2)。
表1 灯盏花素注射液对大鼠颈动脉血栓的溶栓作用
注:n=10， ˇ P<0.05 (χ 2 test)与生理盐水比较
表2 一次性静注灯盏花素注射液溶栓后1h 大鼠颈动脉开放状态
注:n=10雄性大鼠
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2.2 灯盏花素注射液对tPA和PAI-1活性的影响
2.2.1 血浆制备 自雄性大鼠颈动脉取血，用含有EDTA(270mmol/L)、Na 2 CO 3 (1.9mmol/L)和PGE 1 (282mmol/L)的抗凝剂抗凝(血与抗凝剂体积比为9:1)。于4℃1600g离心30min，得到贫血小板血浆，于-30℃冻存。
2.2.2 洗涤血小板的制备 自大鼠颈动脉取血，用3.8%的柠檬酸钠(血与抗凝剂体积比为9:1)抗凝。室温下180g离心10min得富血小板血浆，再以2500g离心10min，得血小板团块。细胞悬浮于磷酸缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)中(800g/L NaH 2 PO 4 ，947g/L Na 2 HPO 4 ，432g/L NaCl，250g/L牛血清蛋白和100mg/L葡萄糖混合溶液，pH7.38)。洗涤2次后，细胞重又悬浮于上述PBS缓冲液中。血小板数调至3×10 11 细胞/L。于血小板悬液加入1IU/ml的人凝血酶并于37℃温育10min，或0.1%的Triton X-100以溶解血小板。血小板聚集或溶解后，混合物再4℃4000g离心30min，沉淀血小板，得到血小板释放物和溶解物的上清液，并于-30℃保存待用。
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2.3.3 血浆及血小板释放液中tPA和PAI-1活性的测定
2.3.3.1 体外实验 不同浓度的灯盏花素注射液在室温下与上述制备的待测血浆样品温育45min。同本研究组先前的ELISA方法 [12] 于96孔酶标板上测定血浆tPA和PAI-1的活性。
结果显示，灯盏花素注射液在体外明显降低血浆PAI-1活性(IC 50 为0.27g/L)，同时提高血浆tPA的活性(表3)。
表3 灯盏花素注射液在体外对大鼠血浆PAI-1和tPA活性的影响
注:n=10， ˇ P<0.05， ˇˇ P<0.01与生理盐水比较
2.3.3.2 体内实验 雄性大鼠分2组，8只/组，即生理盐水、12mg/kg的灯盏花素注射液组。动物用30mg/kg的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，分离股静脉和颈总动脉。给药前取血1次，静脉注射药物后分别于30、60和90min取血。血浆、血小板的释放液或溶解液的制备及tPA与PAI-1的活性测定同前。
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结果发现，灯盏花素注射液静注显著降低血浆PAI-1活性，同时增加了血浆中tPA的活性，于给药后30min起效，可持续90min(表4，5)。给药前(0min)，凝血酶激活的血小板释放的PAI-1活性为(63.4±3.5)IU/ml，Triton使血小板破膜后PAI-1全部释放出来，其活性为(68.2±5.8)IU/ml。灯盏花素注射液静脉注射明显抑制血小板释放的PAI-1活性(表6)。
表4 灯盏花素注射(12mg/kg)液静脉注射对大鼠血浆PAI-1活性的影响
注:n=8， ˇ P<0.05， ˇˇ P<0.01与等时间点的生理盐水组比较， # P<0.01与给药前比较
表5 灯盏花素注射液(12mg/kg)静脉注射对大鼠血浆tPA活性的影响
注:n=8， ˇˇ P<0.01与等时间点的生理盐水组比较， # P<0.01与给药前比较
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表6 灯盏花素注射液(12mg/kg)静脉注射对大鼠血小板PAI-1活性的影响
注:n=8， ˇ P<0.05， ˇˇ P<0.01与等时间点的生理盐水组比较， # P<0.01与给药前比较
3 讨论
实验研究及临床实践均支持PAI-1水平增高与血栓形成事件之间存在紧密联系，血浆PAI-1活性增加可降低纤溶活性，促进血栓的形成与延展。众多学者对首发急性心肌梗死的生存者研究发现，这些患者的PAI-1活性异常增高，进一步随访研究后认为，血浆PAI-1活性增高是发生再梗死的原因 [13] 。提示PAI-1水平升高可能是心脑血管血栓性疾病(尤其是年轻人血栓性疾病)发病的主要危险因子，而且还可能是心肌梗死初发病例发生再梗死的危险因素。
灯盏花素注射液具有较好的改善心脑血管血流量，抗血小板聚集及抗血栓形成 [6] ，并有效降低脑梗塞患者的纤维蛋白和抗氧自由基等作用 [7] 。临床上主要用于治疗脑梗塞 [8] 、冠心病、心肌缺血损伤等 [9] 。本研究就灯盏花素注射液进行了溶栓作用及其机制探讨。结果表明，灯盏花素注射液对电刺激大鼠颈动脉血栓具有明显的溶解作用，随剂量的增加，血管再通率增高，而再栓率显著下降，提示灯盏花素注射液具有明确的溶栓作用。
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tPA是纤溶系统的启动因子，PAI-1为tPA的生理快速抑制剂，促使纤溶活性明显减弱 [14] 。灯盏花素注射液在 体外呈浓度依赖性明显抑制血浆PAI-1活性，同时提高血浆tPA活性;静脉注射后，灯盏花素注射液在降低血浆PAI-1活性的同时提高了tPA的活性，而且时效特征一致。PAI-1主要贮存在血小板的α颗粒内，血小板激活后，释放大量PAI-1。研究表明，血浆中3/4的PAI-1来自血小板 [15] 。本研究比较了Triton溶解血小板颗粒膜和凝血酶激活血小板后上清液内的PAI-1活性，结果显示，二者所测得的PAI-1活性基本相当(前者为68.2±5.8IU/ml，后者为63.4±3.5IU/ml)，而且用凝血酶激活血小板能较好反映机体的病理状态。灯盏花素注射液能明显降低血小板释放的PAI-1活性，于给药后30min起效，至90min时仍明显降低PAI-1活性，该时效特征与其抑制血浆PAI-1活性及升高tPA活性类似，提示灯盏花素注射液可能通过抑制血小板α颗粒释放的PAI-1活性而降低血浆PAI-1活性，并因此提高了血浆中tPA的活性。本研究总的提示，灯盏花素注射液可能是一种植物来源的PAI-1抑制剂，同时也揭示由于灯盏花素注射液抑制PAI-1活性，解除了PAI-1对纤溶系统的启动因子tPA的灭活作用，提高了机体的纤溶活力，因而具有较强的栓塞血管的再通作用，有利于防止血栓的进一步形成和发展。
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综上所述，灯盏花素注射液具有明显的溶栓作用，其机制可能与抑制血小板和血浆PAI-1活性、提高血浆tPA活性密切相关。灯盏花素注射液作为一种植物来源的PAI-1抑制剂，在疾病防治上将会开拓更宽广的临床用途。
参考文献
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3 周红，乔建.急性脑梗塞患者血浆tPA、PAI-1、TM及GMP-140的变化及意义.江苏临床医学杂志，2001，5:384-386.
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12 沈志强，董泽军，刘吉开.叶下珠有效部位的溶栓作用及其对PAI-1和tPA活性的影响.天然产物研究与开发，2003，15(5):441-445.
13 安向光，韩忠朝，王佩显，等.纤溶酶原激活物抑制剂-1与急性心肌梗死关系的研究.中国心血管杂志，2001，6:71-74.
14 Thogersen AM，Jansson JH，Boman K.High plasminogen activator inˉhibitor and tissue plasminogen activator levels in plasma precede a first acute myocardial infarction in both men and women:evidence for the fibrinolytic system as an independent primary risk factor.Circulation，1998，98:2241-2247.
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15 龙吉，曲辉，白云，等.脑血栓患者血浆组织型纤溶酶原激活物及其快速抑制物的变化及临床意义.中华神经科杂志，1998，31:267-289.
基金项目:云南省自然科学基金资助项目(No:98C066M)
作者单位:650031昆明医学院云南省天然药物药理重点实验室
650032昆明医学院第一附属医院放射科
通讯作者:Tel0871-5332956，Fax0871-5377271，E-mail szq21cn@hotmail.com
(编辑小 川), 百拇医药(沈志强 张六一 段理)
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关键词 灯盏花素注射液 尿激酶 血栓 溶栓 组织型纤溶酶原激活物 纤溶酶原激活物抑制物
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2003)19-2759-04
Thrombolytic effects of breviscapini injection and its
modulation on the activity of PAI-1and tPA
Shen Zhiqiang，Zhang Liuyi，Duan Li
Yunnan Pharmacological Laboratories of Natural Products，Kunming Medical College， Kunming650031.
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【Abstract】 Objective To investigate the thrombolytic effects of Breviscapini Injection and its influence on the activity of type1plasminogen activator inhibitor(PAI-1)/tissue-type plasminogen activator(tPA).Methods Charlton’s and Tomihisa’s methods were modified to evaluate the thrombolytic effect of Breviscapini Injection in rats，as well as its effect on carotid artery patency status.The activity of PAI-1in plasma or platelet releas and tPA in plasma was assayed by use of ELISA.Results The results showed that Breviscapini Injection significantly increased the reperfusion and decreased the reocclusion in rat carotid arteries，in a dose-dependent manner.One hour after sucˉcessful reperfusion，theincidence of carotid artery patency in the groups of Breviscapini Injection(3～12mg/kg)was gradually improved with the doses increasing.Breviscapini Injectionin vitro or intravenous injection，markedly supˉpressed PAI-1activity while elevated tPA activity;intravenous Breviscapini Injection also significantly inhibited PAI-1activity released from thrombin-activated platelets.Conclusion It is suggested that Breviscapini Injection inˉcreased the artery reperfusion and decreased the reocclusion of carotid artery.The inhibition of PAI-1activity and subsequent elevation of tPA activity might-contribute to the thrombolytic effect of Breviscapini Injection.
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Key words breviscapini injection urokinase thrombosis thrombolysis tissue-type plasminogen activator type1plasminogen activator inhibitor
组织型纤溶酶原激活物(tissue-type plasminogen activaˉtor，tPA)通过激活纤溶酶原形成纤溶酶而降解纤维蛋白，生成纤维蛋白降解产物，使堵塞在血管中的血栓溶解，以维持血流的通畅，即tPA是纤溶系统的启动因子 [1] ;纤溶酶原激活物抑制物(plasminogen activator inhibitor type-1，PAI-1)为tPA的生理快速抑制剂，它与tPA以1:1结合后使之迅速失去活性，导致纤维蛋白清除力下降、纤维蛋白沉积，同时与血管壁结合。换言之，PAI-1对纤溶系统起着起始抑制作用，降低tPA活性并因此减弱纤溶能力，促进血栓的形成和延展 [2] 。临床研究证实，急性心肌梗死、脑梗塞及深静脉血栓等血栓性疾病患者血浆的PAI-1活性异常增高，而tPA活性明显下降 [3，4] ;多数专家提出PAI-1是心脑血管等血栓栓塞性疾病的危险因子。
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灯盏花[Erigeron breviscapus(Vant.)Hand.-Mazz]，为菊科多年生草本植物，主要分布于我国云南、四川、贵州等省，尤以云南所产灯盏花闻名于世，产量约占全国的90%。民间主要用其防治中风偏瘫等疾病。灯盏花素注射液属灯盏花中提取分离的黄酮类物质，主要成分为灯盏乙素(4，5，6-三羟基黄酮—7—O—葡萄糖醛酸苷) [5] ，具有较好的改善心脑血管血流量，抗血小板聚集 [6] ，有效降低脑梗塞患者的纤维蛋白原和抗氧自由基等作用 [7] 。临床上多用于治疗脑血栓形成 [8] 、冠心病心绞痛、心肌缺血损伤等[9] ，是治疗心脑血管疾病的良药。然而目前，就灯盏花素注射液溶栓机制探讨较浅。
本研究采用Charlton和Tomihisa方法评价灯盏花素注射液对电刺激大鼠颈动脉血栓的溶解作用，运用ELISA方法测定灯盏花素注射液在体内外对大鼠血小板PAI-1活性及血浆tPA和PAI-1活性的影响，以评价灯盏花素注射液的溶栓作用及其作用机制。
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1 实验材料
1.1 动物 雄性SD大鼠，体重250～300g，由昆明医学院实验动物中心提供(合格证号:滇实动证字第2001034号)。
1.2 药物和试剂 灯盏花素注射液，规格:5mg/2ml，批准文号:ZZ-5795-滇卫药准字，批号:20020406，由云南省个旧生物药业有限公司提供。用前以生理盐水稀释。尿激酶从丽珠集团丽宝生化制药公司购买，用前溶于生理盐水中。人凝血酶由Sigma化学公司出品，用蒸馏水溶解。tPA和PAI-1的测定试剂盒购自上海医科大学。
1.3 主要仪器 电刺激仪(SEN-7203，日本Nihon Kohden公司产品);超声血流量仪(DVM-4200，日本Hayashi Denki公司生产);全自动酶标仪(EL340，美国Bio-Tek Instruments公司产品)。
2 方法与结果
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2.1 灯盏花素注射液对电刺激大鼠颈动脉血栓的溶解作用
2.1.1 血栓模型的制备 大鼠分为5组，每组10只。A组:生理盐水组;B组:2万U/kg尿激酶组;C～E组:3，6和12mg/kg的灯盏花素注射液组。改良Charlton等方法 [10] ，即用30mg/kg的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉大鼠，分离大鼠左颈总动脉，置两根银制电极(间距0.8cm)，超声探针置远心端。用电刺激以2mA的直流电连续刺激大鼠颈动脉5min。用超声血流量仪连续探测颈动脉血流量。以血流量为刺激前的50%作为血栓形成。
2.1.2 灯盏花素注射液溶栓活性的测定 根据Tomihisa等方法 [11] ，以刺激结束后至血流量为刺激前的50%所需的时间定为血栓形成时间。形成血栓后20min，上述各组均经股静脉一次性注射，观察给药后1h内血管再通情况;该段时间内，若血管没有再通，则认为再通失败。若再通，则继续观察血管开放状态1h。以≥50%或≤25%的刺激前血流量者判定为持续再通或继后的再栓塞;再通后1h内，每只动物的颈动脉血流量以刺激前血流量为基线可分为≥50%，>25%至<50%，和≤25%。颈动脉血管开放程度分别为(1)持续栓塞(persistent occlusion，PO):无再通;(2)再通与再栓塞交错出现(cyclic reflow，CR);(3)再通后持续开放(persistent patency，PP):再通后无再栓塞。
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结果表明:6mg/kg的灯盏花素注射液，其再通率为50%，再栓率为60%;12mg/kg灯盏花素注射液的血管再通率为60%，低于2万U/kg尿激酶80%的再通率，12mg/kg灯盏花素注射液的血管再栓率为42.9%，高于尿激酶25%的再栓率;生理盐水组无一动物出现再通(表1)。再通后 1h内，血管开放状态表现为，生理盐水组均持续栓塞;灯盏花素注射液(3～12mg/kg)随剂量的增大血管持续再栓数明显下降，而血管再通数显著升高。2万U/kg尿激酶组的血管开放状态明显好于12mg/kg的灯盏花素注射液组(表2)。
表1 灯盏花素注射液对大鼠颈动脉血栓的溶栓作用
注:n=10， ˇ P<0.05 (χ 2 test)与生理盐水比较
表2 一次性静注灯盏花素注射液溶栓后1h 大鼠颈动脉开放状态
注:n=10雄性大鼠
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2.2 灯盏花素注射液对tPA和PAI-1活性的影响
2.2.1 血浆制备 自雄性大鼠颈动脉取血，用含有EDTA(270mmol/L)、Na 2 CO 3 (1.9mmol/L)和PGE 1 (282mmol/L)的抗凝剂抗凝(血与抗凝剂体积比为9:1)。于4℃1600g离心30min，得到贫血小板血浆，于-30℃冻存。
2.2.2 洗涤血小板的制备 自大鼠颈动脉取血，用3.8%的柠檬酸钠(血与抗凝剂体积比为9:1)抗凝。室温下180g离心10min得富血小板血浆，再以2500g离心10min，得血小板团块。细胞悬浮于磷酸缓冲液(phosphate buffer solution，PBS)中(800g/L NaH 2 PO 4 ，947g/L Na 2 HPO 4 ，432g/L NaCl，250g/L牛血清蛋白和100mg/L葡萄糖混合溶液，pH7.38)。洗涤2次后，细胞重又悬浮于上述PBS缓冲液中。血小板数调至3×10 11 细胞/L。于血小板悬液加入1IU/ml的人凝血酶并于37℃温育10min，或0.1%的Triton X-100以溶解血小板。血小板聚集或溶解后，混合物再4℃4000g离心30min，沉淀血小板，得到血小板释放物和溶解物的上清液，并于-30℃保存待用。
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2.3.3 血浆及血小板释放液中tPA和PAI-1活性的测定
2.3.3.1 体外实验 不同浓度的灯盏花素注射液在室温下与上述制备的待测血浆样品温育45min。同本研究组先前的ELISA方法 [12] 于96孔酶标板上测定血浆tPA和PAI-1的活性。
结果显示，灯盏花素注射液在体外明显降低血浆PAI-1活性(IC 50 为0.27g/L)，同时提高血浆tPA的活性(表3)。
表3 灯盏花素注射液在体外对大鼠血浆PAI-1和tPA活性的影响
注:n=10， ˇ P<0.05， ˇˇ P<0.01与生理盐水比较
2.3.3.2 体内实验 雄性大鼠分2组，8只/组，即生理盐水、12mg/kg的灯盏花素注射液组。动物用30mg/kg的戊巴比妥钠腹腔注射麻醉后，分离股静脉和颈总动脉。给药前取血1次，静脉注射药物后分别于30、60和90min取血。血浆、血小板的释放液或溶解液的制备及tPA与PAI-1的活性测定同前。
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结果发现，灯盏花素注射液静注显著降低血浆PAI-1活性，同时增加了血浆中tPA的活性，于给药后30min起效，可持续90min(表4，5)。给药前(0min)，凝血酶激活的血小板释放的PAI-1活性为(63.4±3.5)IU/ml，Triton使血小板破膜后PAI-1全部释放出来，其活性为(68.2±5.8)IU/ml。灯盏花素注射液静脉注射明显抑制血小板释放的PAI-1活性(表6)。
表4 灯盏花素注射(12mg/kg)液静脉注射对大鼠血浆PAI-1活性的影响
注:n=8， ˇ P<0.05， ˇˇ P<0.01与等时间点的生理盐水组比较， # P<0.01与给药前比较
表5 灯盏花素注射液(12mg/kg)静脉注射对大鼠血浆tPA活性的影响
注:n=8， ˇˇ P<0.01与等时间点的生理盐水组比较， # P<0.01与给药前比较
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表6 灯盏花素注射液(12mg/kg)静脉注射对大鼠血小板PAI-1活性的影响
注:n=8， ˇ P<0.05， ˇˇ P<0.01与等时间点的生理盐水组比较， # P<0.01与给药前比较
3 讨论
实验研究及临床实践均支持PAI-1水平增高与血栓形成事件之间存在紧密联系，血浆PAI-1活性增加可降低纤溶活性，促进血栓的形成与延展。众多学者对首发急性心肌梗死的生存者研究发现，这些患者的PAI-1活性异常增高，进一步随访研究后认为，血浆PAI-1活性增高是发生再梗死的原因 [13] 。提示PAI-1水平升高可能是心脑血管血栓性疾病(尤其是年轻人血栓性疾病)发病的主要危险因子，而且还可能是心肌梗死初发病例发生再梗死的危险因素。
灯盏花素注射液具有较好的改善心脑血管血流量，抗血小板聚集及抗血栓形成 [6] ，并有效降低脑梗塞患者的纤维蛋白和抗氧自由基等作用 [7] 。临床上主要用于治疗脑梗塞 [8] 、冠心病、心肌缺血损伤等 [9] 。本研究就灯盏花素注射液进行了溶栓作用及其机制探讨。结果表明，灯盏花素注射液对电刺激大鼠颈动脉血栓具有明显的溶解作用，随剂量的增加，血管再通率增高，而再栓率显著下降，提示灯盏花素注射液具有明确的溶栓作用。
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tPA是纤溶系统的启动因子，PAI-1为tPA的生理快速抑制剂，促使纤溶活性明显减弱 [14] 。灯盏花素注射液在 体外呈浓度依赖性明显抑制血浆PAI-1活性，同时提高血浆tPA活性;静脉注射后，灯盏花素注射液在降低血浆PAI-1活性的同时提高了tPA的活性，而且时效特征一致。PAI-1主要贮存在血小板的α颗粒内，血小板激活后，释放大量PAI-1。研究表明，血浆中3/4的PAI-1来自血小板 [15] 。本研究比较了Triton溶解血小板颗粒膜和凝血酶激活血小板后上清液内的PAI-1活性，结果显示，二者所测得的PAI-1活性基本相当(前者为68.2±5.8IU/ml，后者为63.4±3.5IU/ml)，而且用凝血酶激活血小板能较好反映机体的病理状态。灯盏花素注射液能明显降低血小板释放的PAI-1活性，于给药后30min起效，至90min时仍明显降低PAI-1活性，该时效特征与其抑制血浆PAI-1活性及升高tPA活性类似，提示灯盏花素注射液可能通过抑制血小板α颗粒释放的PAI-1活性而降低血浆PAI-1活性，并因此提高了血浆中tPA的活性。本研究总的提示，灯盏花素注射液可能是一种植物来源的PAI-1抑制剂，同时也揭示由于灯盏花素注射液抑制PAI-1活性，解除了PAI-1对纤溶系统的启动因子tPA的灭活作用，提高了机体的纤溶活力，因而具有较强的栓塞血管的再通作用，有利于防止血栓的进一步形成和发展。
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综上所述，灯盏花素注射液具有明显的溶栓作用，其机制可能与抑制血小板和血浆PAI-1活性、提高血浆tPA活性密切相关。灯盏花素注射液作为一种植物来源的PAI-1抑制剂，在疾病防治上将会开拓更宽广的临床用途。
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基金项目:云南省自然科学基金资助项目(No:98C066M)
作者单位:650031昆明医学院云南省天然药物药理重点实验室
650032昆明医学院第一附属医院放射科
通讯作者:Tel0871-5332956，Fax0871-5377271，E-mail szq21cn@hotmail.com
(编辑小 川), 百拇医药(沈志强 张六一 段理)