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编号:10401960
持续表达EGF-IL18靶向细胞因子的肝癌细胞系的建立
http://www.100md.com 《中华医学研究杂志》 2003年第12期
     【摘要】 目的 研究获得持续分泌EGF-IL18细胞因子的SMMC7721肝癌细胞株。方法用聚合酶链反应(PCR)扩增Sec-EGF-IL18基因,用基因重组技术构建表达Sec-EGF-IL18的重组逆转录病毒载体pLXSE18并转染PA317细胞。将抗性克隆上清感染SMMC7721肝癌细胞,经G418筛选抗性克隆SMMC/SE18。PCR检测克隆细胞基因组中的目的基因,RT-PCR检测目的基因mRNA的表达,酶联免疫吸附法(ELISA)检测其上清中EGF-IL18的表达。结果 PCR扩增出645bp的Sec-EGF-IL18基因,成功筛选出抗性克隆SMMC/SE18,PCR扩增表明Sec-EGF-IL18基因已整合到细胞的基因组中。RT-PCR结果显示,SMMC/SE18细胞中有Sec-EGF-IL18的转录表达。在SMMC/SE18上清中检测出IL-18最高水平可达345pg/ml。结论 逆转录病毒已成功地介导Sec-EGF-IL18整合在SMMC7721细胞中,并实现了目的基因的分泌表达。

    关键词 白细胞介素18 逆转录病毒载体
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    【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)12-1057-03

    Establishment of a human hepatocellular carcinoma cell line

    stable producing targeting cytokine EGF-IL18

    Peng Ying,Lu Jianxin,Zheng Xiaoqun,et al.

    Institute of Cellular and Molecular Medicine,Wenzhou Medical College,Wenzhou325027.

    【Abstract】 Objective To establish a human hepatocellular carcinoma cell line that can stably secreted EGF-IL18.Methods Previously,we have cloned the fusion gene EGF-IL18encoding human IL-18mature peptide cDNA linked with EGF receptorinterferential sequence.In the present study,we amplified the Sec-EGF-IL18gene
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    encoding the EGF-IL18cDNA linked with the Igkappa leader sequence by polymerasechain reaction.Sec-EGF-IL18cDNA was cloned into retroviral vector pLXSN and then constructed pLXSE18was used to transfect packaging cell PA317.The transfected cells were selected with G418and resistant cells were proliferated,the supernatant was used to infect human hepatocellular carcinoma cell line SMMC7721.G418resistant infected cells were cloned and named SMMC/SE18cell.The genomic DNA and total RNA of SMMC/SE18were extracted.The genomic DNA conˉtaining Sec-EGF-IL18gene was identified by PCR.The Sec-EGF-IL18mRNA transcription was identified by RT-PCR.Expression of secreted EGF-IL18in SMMC/SE18cells was checked by ELISA.Results Sec-EGF-IL18cDNA was sequencing and recombinant retrovirus vector pLXSE18was correctly constructed.PCR results showed that the Sec-EGF-IL18gene was integrated into the genome of SMMC/SE18cells and the mRNA has been tranˉscribed.EGF-IL18was produced in the supernatant at a highest level of345pg/ml evaluated by ELISA.Conclusion Sec-EGF-IL18cDNA has been successfully integrated into the SMMC/SE18cellsand was secreted in the superˉnatant transduced by retroviral vector.
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    Key words interleukin18 retroviral vector tumor vaccine

    细胞因子基因修饰的肿瘤疫苗可使肿瘤局部持续分泌细胞因子,扩大抗肿瘤免疫反应,因此日益受到人们的关注,然而,大量的临床试验资料表明,这些瘤苗的治疗效果与人们的期望值仍相差甚远。原因之一在于单纯的细胞因子缺乏肿瘤靶向性:一方面,能近距离作用于肿瘤细胞的细胞因子为数不够;另一方面,积聚在正常组织周围的细胞因子又会激发局部炎症,产生副作用。因此,从有效性和持久 性的角度来看,增强细胞因子的肿瘤细胞靶向性应是今后细胞因子修饰瘤苗的重要发展方向之一 [1]

    表皮生长因子(Epithelial growth factor,EGF)受体在许多肿瘤细胞表面的表达量是正常细胞的100倍,其受体干扰序列可靶向性地与肿瘤细胞结合,既无EGF活性又可干扰EGF对肿瘤细胞生长的刺激效应,已在肿瘤靶向治疗研究中得到了广泛应用 [2] 。此前,我们已将人白细胞介素18(IL-18,Interleukin18)的成熟肽cDNA与EGF受体干扰序列DNA通过一个中间接头(Gly4Ser)3编码序列融合,构建了重组体EGF-IL18 [3] 。本文则进一步构建了带有信号肽序列的EGF-IL18靶向细胞因子基因Sec-EGF-IL18,并采用逆转录病毒载体介导该基因转入人肝癌细胞系,建立了持续分泌EGF-IL18靶向细胞因子的SMMC7721细胞株。
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    1 材料和方法

    1.1 实验材料 携带571bp全长人EGF-IL18cDNA基因的质粒pTFus由我所构建 [3] 。大肠杆菌菌株DH 、逆转录病毒载体pLXSN、PA317包装细胞系由本所保存。小鼠成纤维细胞系NIH3T3,人肝癌细胞株SMMC7721购自上海中科院细胞库。G418、Trizol购自上海生工公司。限制性内切酶和PCR试剂购自TaKaRa公司。DMEM、FCS、Cell FECTIN购自Invitrogen公司。人IL-18ELISA试剂盒购自上海森雄公司。

    1.2 Sec-EGF-IL18基因的PCR扩增 上游引物Sec1:5′ -GGAATTCATGGAGACAGACACACTCCTGCTATGGGTA CTG———CTGCTCTGGGTTCCAGGTTCCACTGGTGAC C GCTGCTCCCATGGC-3′;下游引物Sec2:3′-CAAGTTTTGCTT CTGATC———GAGCTCGC-5′。其中黑体部分为鼠Igκ链V-J2-C信号肽序列,根据Invitrogen公司pSecTag2载体的序列设计[4] ;斜体部分对应于EGF-IL18cDNA基因的5′端及3′端序列,根据本所的Genebank收录序列AF454397设计 [3] ;下划线部分分别为EcoRI及XhoI酶切位点(图1)。以pTFus为模板,以Sec1和Sec2为引物,按常规方法进行PCR扩增。反应结束后,1%琼脂糖凝胶电泳。 I:Igκleader sequence(63bp);E:EGF receptor interferential sequence(48bp);L:(Gly4Ser)3Linker(45bp);IL18:mature human interleukin18cDNA(474bp) 图1 Sec-EGF-IL18融合基因的线性结构图
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    1.3 重组逆转录病毒的构建 PCR产物经冻融法回收纯化后,以EcoRI/XhoI酶切,与酶切后的pLXSN质粒连接,构建重组质粒pLXSE18。接种PA317细胞于6孔板中,至对数生长期依照Cell FECTIN的使用说明将质粒转染PA317细胞(DMEM,10%FCS)。转染48h后用含200μg/ml G418的培养液选择培养,每3d换液1次,逐渐加大G418浓度至400μg/ml,继续培养直到抗性克隆形成。

    然后以有限稀释法进行克隆化和亚克隆化,选择出单个克隆细胞。得到的阳性细胞于37℃中培养,收集病毒上清。以NIH3T3细胞作为靶细胞,加入病毒上清进行感染,300μg/ml G418筛选,2周后在显微镜下数集落,计算滴度 [5]

    1.4 肝癌细胞株的感染与筛选 在细胞密度为60%~80%SMMC7721肝癌细胞(DMEM,10%FCS)上以滴度最高的包装细胞抗性克隆培养上清感染,吸附3h后,加入5ml完全培养基继续培养48h后加入终浓度为300μg/ml的G418筛选传代。再对抗性细胞经扩大培养后进行鉴定 [5]
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    1.5 克隆细胞基因组中目的基因的检测 分别收集克隆化和对照组SMMC7721细胞各约2.5×10 7 个,加入消化缓冲液(10mmol/LTris-HCl,pH8.0;10mmol/L EDTA,15mmol/L NaCl和5g/L SDS),蛋白酶K及RNA酶,56℃水浴1h,再以常规酚/氯仿抽提法制备基因组DNA。用引物Sec1和Sec2从基因组DNA中行PCR扩增。

    1.6 RT-PCR检测目的基因mRNA的表达 细胞总RNA的提取依照Trizol的使用说明进行,RT-PCR根据TaKaRa公司提供的方法进行,扩增产物行1.0%琼脂糖凝胶电泳检测。

    1.7 转基因细胞中EGF-IL18的表达 夹心ELISA法检测抗性SMMC7721细胞培养上清中IL-18的浓度,酶联仪检测。

    2 结果

, 百拇医药     2.1 Sec-EGF-IL18基因的PCR扩增 PCR产物经1.0% 琼脂糖凝胶电泳,可见1条特异条带位于DNA分子量标准600bp与700bp间,与预计长度(645bp)相符(图2-1),对此特异片段进行直接测序,证明此片段中包含Sec-EGF-IL18基因全编码序列。

    2.2 重组逆转录病毒载体的鉴定 挑取筛选后的重组质 粒pLXSE18进行EcoRI/XhoI酶切鉴定。pLXSE18经酶切切出约645bp小片段与5.9kb大片段(图2-4),表明Sec-EGF-IL18基因已成功插入pLXSN载体中。

    2.3 重组逆转录病毒的制备 重组逆转录病毒质粒pLXSE18转染PA317细胞,在G418的筛选下部分存活细胞为转基因的阳性细胞,收集病毒上清,测得pLXSN产生的病毒滴度为2.5×105 CFU/ml,pLXSE18为9×10 5 CFU/ml。
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    2.4 转Sec-EGF-IL18基因肝癌细胞株的筛选 将重组逆转录病毒上清感染SMMC7721人肝癌细胞株,经G418筛选,3周时克隆形成,收集细胞扩大培养,将pLXSN转染的细胞株命名为SMMC/Neo,将pLXSE18转染的细胞株命名为SMMC/SE18。

    2.5 转Sec-EGF-IL18基因细胞株的鉴定 提取SMMC/Neo和SMMC/SE18细胞基因组DNA,以Sec1、Sec2进行PCR扩增,SMMC/SE18细胞扩增出特异的645bp左右片段(图2-2),表明Sec-EGF-IL18基因已整合到细胞的基因组中。提取2种细胞总RNA进行RT-PCR,Sec-EGF-IL18基因的扩增结果显示,SMMC/SE18细胞为阳性(图2-3),SMMC/Neo细胞则为阴性,说明SMMC/SE18细

    胞中有Sec-EGF-IL18的转录表达。1:pTFus PCR products(Sec1/Sec2)2:SMMC/SE18genomic DNA PCR products(Sec1/Sec2)3:SMMC/SE18RT-PCR products(Sec1/Sec2)4:pLXSE18/EcoRI+XhoIM1:100bp DNALadder;M2:1kb DNALadder 图2 PCR及酶切电泳结果
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    2.6 SMMC/SE18株表达IL-18水平 经夹心法ELISA检测,SMMC/SE18细胞培养上清中IL-18最高水平24h可达345pg/ml,转基因细胞在冻存后复苏仍能分泌IL-18。普通光学显微镜下观察IL-18高表达克隆细胞形态与对照组比较无明显差异。

    3 讨论

    IL-18是一种具有多种免疫生物学功能的细胞因子,其靶细胞是NK细胞及Th1细胞。除了能够诱导NK细胞、T淋巴细胞、肝脏的枯否氏细胞表达IFNγ以外,还能促进T淋巴细胞增殖以及诱导自然杀伤(NK)细胞的细胞毒活性。这些都显示了IL-18在抗肿瘤方面具有潜在的应用前景 [6] 。然而,体内使用IL-18往往会引起毒副作用 [7] 。因此,IL-18若应用于临床还需消除它的毒副作用。

    本文中我们选择了带有EGF受体干扰序列的人IL-18(EGF-IL18)作为目的基因,该基因的表达产物可能会通过以下途径加强并完善IL-18的抗肿瘤活性:(1)EGF受体在许多肿瘤细胞表面的表达量是正常细胞的100倍,SMMC7721细胞表面EGF受体为0.7×10 5[8] 。干扰序列可靶向性地与肿瘤细胞结合,且无EGF活性,并可干扰EGF对肿瘤细胞的刺激效应 [2];(2)可使IL-18能近距离发挥对肿瘤细胞的细胞毒作用,从而会限制它的毒副作用;(3)当EGF-IL18同时与肿瘤细胞和Th细胞结合时,可连接二者到合适距离,并在局部诱生较高浓度的IFNγ;(4)IFNγ以旁分泌方式作用于肿瘤细胞,诱导MHCⅡ和肿瘤抗原的表达,并以复合体形式与已被“拉近”的Th细胞的TCR/CD3复合体结合并产生抗原刺激信号,该信号决定免疫应答的特异性;(5)此外,由IFNγ激活的细胞因子网络亦可诱导肿瘤细胞共刺激分子如B7、ICAM-1的表达,后者与Th细胞的相应配体结合并产生共刺激信号,该信号亦为T细胞激活所必需,从而在同一时间、同一空间内建立了肿瘤细胞和Th细胞抗原刺激信号、共刺激信号
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    及细胞因子信号的识别和激活。

    此前,我们已成功构建并克隆了EGF-IL18基因。然而,成熟IL-18无典型的信号肽序列,其分泌依赖于细胞中的IL-1β转化酶(ICE)特异地切割IL-18前体蛋白 [9] 。因此,为了得到可分泌到胞外的IL-18,人们在研究中采用了两种策略:①将IL-18前体基因和ICE基因共转染靶细胞 [9] ;②在成熟IL-18基因末端加上异源信号肽序列 [10] 。 这里我们采用了后者,选择鼠Igκ链V-J2-C的信号肽序列并设计到PCR上游引物中,扩增出了Sec-EGF-IL18基因(图1)。

    本研究的实验结果表明,我们已经得到了能持续分泌EGF-IL18细胞因子的SMMC7721肝癌细胞株。今后,我们将进一步完善以下工作:(1)检测分泌出的EGF-IL18细胞因子是否具有IL-18的活性;(2)检测分泌出的EGF-IL18细胞因子能否与SMMC/SE18细胞结合;(3)测定EGF-IL18是否能同时与SMMC/SE18细胞和Th及NK细胞结合,结合后是否能诱生IFNγ。
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    参考文献

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    (收稿日期:2003-10-15)

    基金项目:浙江省教育厅项目(编号:20020474)。浙江省自然科学基金项目(编号:302769)

    作者单位:1 325027温州医学院细胞与分子医学研究所

    2 46202-5120Indiana University Cellular and IntegrativePhysiology

    (编 辑 小川), http://www.100md.com