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编号:10402294
散发性结直肠癌22号染色体微卫星不稳定性研究
http://www.100md.com 中华医学研究杂志 2003年4月 第3卷 第4期
     【摘要】 目的 研究微卫星不稳定在散发性结直肠癌发生中的作用。方法 用5个微卫星DNA标记对83例结直肠癌病例的肿瘤及正常组织进行PCR反应。PCR产物在ABI Prism377自动荧光测序仪电泳3h,以GeneScan3.1和Genotyper2.1软件进行基因分型。微卫星不稳定性与临床病理参数之间的关系比较采用样本率差别统计检验,P<0.05有统计学意义。结果 83例散发性结直肠癌在22号染色体上微卫星不稳定检出率为6%。4例标本表现为低频微卫星不稳定型,1例表现为高频微卫星不稳定型。其中的5例微卫星不稳定病例,肿瘤均位于近端结肠,体积较大(直径≥5cm)(P<0.05),属于Dukes B,C期,3例为中分化腺癌,1例低分化腺癌,1例粘液腺腺癌,均与年龄、性别无关。结论 散发性结直肠癌在22号染色体上微卫星不稳定的发生率低于以往的报道,微卫星不稳定发生在结直肠癌的中晚期。

    关键词 微卫星不稳定性22号染色体 散发性结直肠癌 基因定位

    【文献标识码】 A 【文章编号】 1680-6115(2003)04-0289-03
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    Microsatellite instability on chromosome22in sporadic colorectal cancer

    Qiu Guoqiang,Zhou Chongzhi,Peng Zhihai

    Department of General Surgery,Shanghai No.1People’s Hospital,Shanghai200080.

    【Abstract】 Objective To evaluate the role of microsatellite instability(MSI)in the carcinogenesis of spoˉradic colorectal cancer.Methods 83cases with colorectal cancer were analyzed with5polymorphic microsatellite markers by polymerase chain reactions(PCR).The products of PCR were electrophoresed for3hours on ABI377DNA sequencer and classified by Genescan3.1and Genotyper2.1softwares.MSIfrequency were compared to clinicoˉpathological parameters of the patients by sample rate test.Results MSI frequency of sporadic colorectal cancerous chromosome22was6.0%in83cases.4cases behaved low frequency MSI and1case high frequency MSIamong them.5cases with MSI were proximal colonic cancer,belonging to Dukes B or Dukes C stage,large size tumors(diamˉeter≥5cm)(P<0.05)and poorly differentiated mucous adenocarcinoma.There was no correlation between MSI and patients’age or gender in these cases.Conclusion MSI detected in this study was lower than that in previous obserˉvations.MSI was considered as the latter event in the carcinogenesis of colorectal cancer.
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    Key words microsatellite instabillity chromosome22 sporadic colorectal cancer gene-mapping

    结直肠癌的发生是一个涉及多基因、多途径的过程,被认为是多个控制生长和分化位点基因突变累积的结果。1993年结直肠癌中发现的微卫星不稳定现象(Microsatellite Instability,MSI)以及其和遗传性非息肉性结直肠癌(Herediˉtary Non-polyposis Colorectal Cancer,HNPCC)的关系为研究结直肠癌的形成和发展的机制提供了新的方法。HNPCC占结直肠癌的5%,其主要基因的不稳定是在进行杂合缺失分析时发现为微卫星不稳定。在过去的几年中对于MSI这一独特的基因不稳定形式的研究不再局限于HNPCC,而扩展到其他肿瘤。目前在散发性(非遗传性)结直肠癌中也发现存在MSI现象 [1,2] 。22号染色体长臂上明显的等位基因缺失现象早在1989年就已发现,认为有抑癌基因存在 [3] ,但与其它染色体不同的是,至今没有发现与结直肠癌肯定相关的抑癌基因。我们已对22号染色体杂合缺失现象进行了分析 [4] ,同时我们分析微卫星不稳定现象,试图从另一角度阐明22号染色体基因不稳定与结直肠癌发生的关系。我们课题选用(GeneAmp9700,Perkin-Elmer,USA)公司提供的荧光标记引物试剂盒,共有400对引物,覆盖人类23对染色体,在22号染色体长臂上主要有5对。我们采用22号染色体5个微卫星DNA标记对散发性结直肠癌中的微卫星不稳定现象进行分析,并研究其临床特征。
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    1 对象与方法

    1.1 研究对象 为本院1998~1999年间结直肠癌外科手术患者,共83例,其中男40例,女43例,年龄为31~84岁,中位年龄66岁。所有病例均经病理证实。依据Dukes标准进行临床分期,A期8例,B期21例,C期40例,D期14例。高分化腺癌23例,中分化39例,低分化、粘液腺癌共21例。肿瘤组织病理分级及分型依据WHO标准进行。

    1.2 DNA抽提 所有病例均于术后半小时内取新鲜癌组织(避开坏死区域,并去除邻近正常组织)和对应正常粘膜组织(距肿瘤边缘5cm以上)-液氮冷藏后转-70℃冻存。标准酚-氯仿法进行DNA抽提,乙醇沉淀。

    1.3 微卫星标记及聚合酶链式反应 5对荧光标记引物基本覆盖22号染色体长臂5个微卫星标记(表1),每对引物之间距离平均约为8cm。不同荧光标记及不同片段长度的微卫星标记引物分3组进行多重PCR反应。反应体系为5μl,1.4ng DNA模板,1.5mol/L Mg 2+ ,80mol/L dNTP,0.3U Iot-StartTaq酶(QIAGENE,Germany)每对引物0.06μl。反应采用“touch-down”反应程序,如下:Ⅰ阶段,96℃,12min,94℃,20s,63℃~56℃(每个循环降低0.5℃),1min,72℃,1min,共14个循环;Ⅱ阶段,94℃,20s,56℃,1min,72℃,1min,共20个循环(GeneAmp9700,Perkin-Elmer,USA)。
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    表1 22号染色体长臂5个微卫星位点

    1.4 微卫星不稳定分析 0.5μl PCR产物和0.1μl基因扫描标准分子量Genescan500及0/9μl加样缓冲液混合后96℃变性5min,其产物在ABI Prism377自动荧光测序仪(P-E Applied Biosystem,USA)上用5%丙烯酰胺凝胶电泳3h,以GeneScan3.1软件(P-E Applied Biosystem,USA)进行基因分型,Genotyper2.1软件(P-E Applied Biosystem,USA)对于所有可检测到的荧光峰型均标示其分子量、峰高、峰面积。 若肿瘤组织DNA出现正常对照中未见的异常峰型,则该病例被视为微卫星不稳定(MSI) [5] 。在分析的5个位点中,2个以上位点发生微卫星不稳定视为高频微卫星不稳定型,1个位点发生微卫星不稳定视为低频微卫星不稳定型。

    1.5 统计学方法 MSI与临床病理参数之间的关系比较采用样本率差别统计检验,P<0.05为差异有显著性。
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    2 结果

    2.1 MSI的发生率 83例结直肠癌标本,共4例标本表现为低频微卫星不稳定型,1例表现为高频微卫星不稳定型,微卫星不稳定病例占6%,在表现微卫星不稳定的微卫星DNA标记位点上均未发生杂合缺失。

    2.2 MSI与临床病理特征之间的关系 5例微卫星不稳定病例,均位于近端结肠。远端结肠、直肠癌中没有发现微卫星不稳定现象,其微卫星不稳定发生率低于近端结肠癌,差异有显著性意义(P<0.05)。微卫星不稳定现象在体积较大肿瘤(直径≥5cm)高于体积较小肿瘤,其发生率差异有显著性意义(P<0.05),属于Dukes B,C期,3例为中分化腺癌、1例低分化腺癌、1例粘液腺腺癌,均与年龄、性别无关,见表2。

    表2 5例微卫星不稳定发生位点和临床病理特征

    3 讨论
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    微卫星DNA标记是一类短重复DNA序列,这一类DNA序列没有编码功能,由10~50个小序列重复组成,重复序列可为1~6个碱基,常见为双核苷酸重复。微卫星DNA标记广泛、随机分布于人类基因组中。而在与同一个体的正常组织比较下,肿瘤组织内微卫星重复单位可以发生增多或减少而造成长度改变,从而在同一位点上出现不同于正常组织的等位片断即称为微卫星不稳定,它是由DNA错配修复系统在DNA复制过程中不能修复复制错误所致。目前认为微卫星不稳定和抑癌基因的杂合缺失呈负相关。微卫星不稳定型结直肠癌主要是近端结肠癌,分化较差,肿瘤较大 [6,7] ,和年龄、性别无关 [8] 。我们的结果与之相符。5例微卫星不稳定型病人均在近端结肠,体积较大(直径≥5cm),3例为中分化腺癌,1例低分化腺癌,1例粘液腺腺癌,与性别、年龄无关,发生在Dukes B、C期。在发生不稳定的微卫星DNA标记位点上均未发现杂合缺失现象 [4] 。有研究表明微卫星不稳定是结直肠癌发生过程中的早期现象 [9] ,而有些研究则认为其发生在结直肠癌发展过程的中晚期 [10] ,本研究提示微卫星不稳定主要存在于Dukes B、C期,支持后一种观点。
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    本研究的微卫星不稳定型病例仅为6%,与其它研究报道的12%~15%发生率不同,原因可能是:(1)由于微卫 星不稳定和杂合缺失是结直肠癌发生的不同机制,在以往我们的报道中22号染色体长臂表现为明显的杂合缺失现象 [4],所以在22号染色体上的基因不稳定主要表现为杂合缺失而不是微卫星不稳定。(2)12%~15%这一发生率主要由西方学者报道,可能东西方人群种族及地理环境不同所致。(3)所选择微卫星的数目和位点不同。

    本研究提示基因不稳定在散发性结直肠癌发生过程中的作用涉及两种途径,一为发生在染色体水平,即杂合缺失(Loss Of Heterozygosity,LOH),二为发生于核苷酸水平,即微卫星不稳定(MSI)。散发性结直肠癌病例在22号染色体上,基因不稳定主要表现为杂合缺失,但微卫星不稳定在结直肠癌发生过程中也起着一定作用。

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    基金项目:国家自然科学基金资助项目(编号:30080016)

    作者单位:200080上海第一人民医院普通外科

    (收稿日期:2002-11-28)

    (编辑张 璇), 百拇医药(裘国强)