荧光定量聚合酶链反应测定乙型肝炎病毒DNA的应用价值
【摘要】 目的 评价荧光定量PCR技术的特点与应用价值。方法 以常规PCR方法和Amplisensor荧光定量技术比较检测了309例不同乙型肝炎病毒标志物类型患者血清中的乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)。血清学指标采用酶联免疫吸附(ELISA)法。结果 在HBsAg、HBeAb、HBcAb阳性组和HBsAg、HBcAb阳性组中，应用Amplisensor法测出的阳性率分别为58.54%和61.04%，分别显著高于同组定性PCR结果(分别为31.71%和36.36%，P<0.01);HBsAg、HBeAg、HBcAb阳性组的Amplisensor结果定量对数值与其他各组比较差异有非常显著性(P<0.01)，此组患者有71.33%血清中HBV-DNA在10 7 ～10 8 cps/ml之间;其他各组阳性患者HBV-DNA量多在10 3 ～10 6 cps/ml之间。结论 Amplisensor法敏感性明显高于定性PCR，且能进行定量，能准确反映病毒的复制状态，为临床诊断、治疗方案的筛选和疗效观察提供依据。
, 百拇医药
关键词乙型肝炎病毒 HBV-DNA 定量测定
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2004)07-0586-03
Evaluation of fluorescence quantitative PCR in
the study of hepatitis B virus
Ji Zhenyu，Zhao Cuilin，Chen Hongtao，et al.
Henan Institute of Medical Sciences，Medical College of Zhengzhou University，Zhengzhou450052.
【Abstract】 Objective To evaluate the characteristics and the significance of fluorescence quantitative PCR test.Methods Hepatitis B virus DNA in309cases with different type of HBV markers were detected comparatively by routine PCR and Amplisensor assay.HBV markers were detected by ELISA.Results In the group of HBsAg，HBeAb，HBcAb positive and HBsAg，HBcAb positive，the Amplisensor positive rates were58.54%and61.04%reˉspectively，significantly higher than routine PCR positive rates in the same group(31.71%and36.36%，P<0.01);The Logcopies in HBsAg，HBeAg，HBcAb positive group were also significantly higher than that in other groups(P<0.01)，with71.33%cases reading between10 7 cps/ml and10 8 cps/ml.HBV DNA copies in other groups were beˉtween10 3 cps/ml and10 6 cps/ml.Conclusion The sensitivity of Amplisensor assay was higher than that of routine PCR.Amplisensor can provide quantitative results，which reflect the state of HBV amplification and support another means for further monitoring of HBV infection.
, 百拇医药
Key words hepatitis B virus HBV DNA quantitative test
乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)是反映乙型肝炎病毒(HBV)复制的最可靠指标。以往检测HBV-DNA方法主要为斑点杂交(Dot-blot)和定性PCR方法，但由于Dot-blot的低敏感性，定性PCR的假阳性及电泳产物染色剂溴乙锭的毒性作用而限制了在临床方面的应用，而且以上两种方法无法给出临床所需要的定量结果。近年来荧光定量技术在临床上有了较普遍的应用，但目前还没有统一的技术标准 [1] 。本文应用常规定性PCR和Amplisensor荧光定量技术检测了309例临床血清标本，并探讨其应用价值，报告如下。
1 材料与方法
1.1 研究对象 309例病人为2001年1月～2003年5月来本室门诊部应诊的患者，应用酶联免疫吸附(ELISA)法排除甲型、丙型和戊型肝炎。对性别年龄无特殊要求。
, 百拇医药
1.2 仪器 使用美国Biotronics公司AG-9600Minilizer。
1.3 ELISA 试剂由潍坊3V公司提供。
1.4 定性PCR 引物序列为:P1(1679F):5′-GGG TGG AGC CCT CAG GCT CAG GGC A-3′，P2(2254R):5′-GAA GAT GAG GCA TAG CAG GAT-3′，由美国Scripps研究所合成。Taq酶购自华美生物工程公司。样品提取及循环扩增方法见文献 [2] 。
1.5 Amplisensor荧光定量分析 不对称扩增引物为P15′-TGC TCG TGT TAC AGG CGG GGT-3′，P25′-GAG GCA TAG CAG CAG GAT GAA GAG-3′，由美国Biotronics公司提供，扩增产物为241bp。荧光信号引物为:5′-TCG CTG GAA GTG TCT GCG GCG T-3′。检测方法为:(1)血清标本HBV-DNA提取:取患者血清100μl，与200μl的STG Buffer混合，80℃温育10min，冷却至室温后，加300μl预冷(4℃)的异戊醇，-30℃放置30min后，15000转/min离心10min，去上清，加100μl KW Buffer洗一次，15000转/min离心5min，彻底去上清后风干，用50μl样品稀释液再溶解备用。(2)制备模板HBV-DNA标准:用稀释液按10倍比例稀释HBV-DNA标准，制备成1×10 8 ，1×10 7 ，1×10 6 ，1×10 5 ，1×10 4 ，1×10 3 拷贝数/ml(cps/ml)的标准系列。(3)不对称扩增:于10μl的不对称扩增反应液中加入5μl提取的样品液，并设一阴性对照孔，一峰值孔，六个标准孔。90℃预变性1min后，按94℃35s，60℃35s，72℃40s，循环20次，测定基础荧光读数。以后每2次循环测定一次荧光值。当最后一个标准出现荧光信号衰减后即可终止反应。所有荧光信号衰减数据均用ASAP软件分析，<1×103 cps/ml者判为阴性。
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1.6 统计学方法 卡方检验。因计量资料为非正态分布，故做对数变换后采用方差分析。阴性结果不参与统计。
2 结果
2.1 不同标志物类型患者定性PCR和Amplisensor分析结 果 见表1。
2.2 不同标志物类型患者HBV-DNA量的分布 人为将HBV-DNA的量分成<10 3 ，10 3 ～104 ，10 5 ～10 6 ，10 7 ～10 8 ，>10 9 组(单位:cps/ml)，并计算各组百分率，以方便观察分布状态。HBsAg、HBeAg、HBcAb阳性组患者HBV-DNA量多在10 7 ～10 8 cps/ml，占71.33%。HBsAg、HBeAb、HBcAb阳性组和HBsAg、HBcAb阳性组患者(HBV-NDA阳性患者)血清中的HBV-DNA量多在10 3 ～10 6 cps/ml之间，分别占50.00%和46.76%。见表2。
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表1 309例患者定性PCR、ELISA和Amplisensor定量分析结果略
表2 不同标志物类型患者HBV-DNA量的分布 (略)
3 讨论
由表1可见，乙型肝炎患者血清内HBV-DNA的负荷量与乙型肝炎病毒标志物模式有关。在HBsAg、HBeAg、HBcAb阳性组，Amplisensor方法的检出率高达98.67%，此组有71.33%的患者血清内HBV-DNA含量在10 7 ～10 8 cps/ml之间，其定量结果对数值为4.94±1.04，显著高于其他两组(P<0.01)。虽然本组定性PCR和Amplisensor两种方法的检出率无统计学意义(P>0.05)，但在HBsAg、HBeAb、HBcAb阳性组和HBsAg、HBcAb阳性组，Amplisensor方法的检出阳性率分别显著高于定性PCR方法(P<0.01)，提示使用Amplisensor方法可提高HBV-DNA检出的敏感性。HBsAg、HBeAb、HBcAb阳性组和HBsAg、HBcAb阳性组患者血清内HBV-DNA含量在10 4～10 8 cps/ml之间不等，其均数标准差很大，不但证实了HBeAg阴性患者可存在高水平的HBV-DNA复制，而且提示病毒的复制程度还与患者个体状态有关。有报道认为高病毒负荷量的HBeAg阴性患者多与HBV-DNA前C区基因变异有关 [3] ，尤其是HBV-DNA前C区1896位点的G●A突变，使编码色氨酸的密码子TGG突变为终止密码子TAG，阻断了HBeAg的合成。位于X读码区的C启动子也可发生突变，致使HBeAg合成分泌减少，但病毒复制仍很活跃 [4] 。应用Amplisensor 定量分析技术可动态检测患者血清中病毒的量的变化，从而为诊断和治疗提供客观依据。
, 百拇医药
Amplisensor定量分析技术的原理已有很多报道阐明 [5，6] ，其关键部分是在反应中使用了不对称引物和荧光信号引物，两条不同浓度的引物可使第一轮的扩增产生过多的一条链。荧光信号引物则是一条稳定的短双链结构，其中一条链可做为引物引导DNA新链的合成。当这条链参与合成反应成为新DNA链的一部分时，原有的稳定结构被破坏，双链打开，两条链间的能量传递途径被破坏，荧光信号就会消失。比较样本孔荧光信号衰减程度和已知浓度的标准孔荧光信号衰减程度，经专用ASAP软件分析可方便得出初始模板DNA的含量。由于使用具有稳定双链结构的荧光信号引物做为内探针，因而提高了Amplisensor方法的特异性，同时因采用闭管检测，不需电泳处理，又能减少交叉污染的可能性。因其主要优点是从病毒数量的变化上反映病毒复制状态，所以在临床诊断、药物筛选治疗及预后判断等方面有越来越高的应用价值。
参考文献
1 王豪，陶其敏，吴娟，等.两种乙型肝炎病毒DNA定量检测方法的比较与评价.中华检验医学杂志，2002，(25)5:318-320.
, 百拇医药
2 汲振余，赵翠林，孙爱民，等.聚合酶链反应结合斑点杂交测定乙型肝炎病毒NDA的评价.中国卫生检验杂志，2000，10(1):13-15.
3 Loriot MA，Marcellin P，Bismuth E，et al.Demonstration of hepatitis B virus DNA by polymerase chain reaction in the serum and the liver after spontaneous or therapeutically induced HBeAg to anti-HBe or HBsAg to anti-HBs seroconversion in patients with chronic hepatitis B.Hepaˉtology，1992，15(1):32-36.
4 Chan HLY，Hussain M，Lok ASF.Different hepatitis B virus genotypesare associated with different mutation in the core promoter and precore regions during hepatitis B e antigen seroconversion.Hepatology，1999，29(3):976-984.
5 韩俊英，曾瑞萍.荧光定量PCR技术及其应用.国外医学遗传学分册，2000，23(3):117-120.
6 张复春，吴婉芬，董惠卿，等.定量聚合酶链反应检测血清中的HBV-DNA及其临床应用.中华传染病杂志，1997，15(1):24-27.
作者单位:450052河南郑州大学医学院省医学科学研究所
(编辑 曲全), 百拇医药
, 百拇医药
关键词乙型肝炎病毒 HBV-DNA 定量测定
【文献标识码】 A 【文章编号】 1606-8106(2004)07-0586-03
Evaluation of fluorescence quantitative PCR in
the study of hepatitis B virus
Ji Zhenyu，Zhao Cuilin，Chen Hongtao，et al.
Henan Institute of Medical Sciences，Medical College of Zhengzhou University，Zhengzhou450052.
【Abstract】 Objective To evaluate the characteristics and the significance of fluorescence quantitative PCR test.Methods Hepatitis B virus DNA in309cases with different type of HBV markers were detected comparatively by routine PCR and Amplisensor assay.HBV markers were detected by ELISA.Results In the group of HBsAg，HBeAb，HBcAb positive and HBsAg，HBcAb positive，the Amplisensor positive rates were58.54%and61.04%reˉspectively，significantly higher than routine PCR positive rates in the same group(31.71%and36.36%，P<0.01);The Logcopies in HBsAg，HBeAg，HBcAb positive group were also significantly higher than that in other groups(P<0.01)，with71.33%cases reading between10 7 cps/ml and10 8 cps/ml.HBV DNA copies in other groups were beˉtween10 3 cps/ml and10 6 cps/ml.Conclusion The sensitivity of Amplisensor assay was higher than that of routine PCR.Amplisensor can provide quantitative results，which reflect the state of HBV amplification and support another means for further monitoring of HBV infection.
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Key words hepatitis B virus HBV DNA quantitative test
乙型肝炎病毒DNA(HBV-DNA)是反映乙型肝炎病毒(HBV)复制的最可靠指标。以往检测HBV-DNA方法主要为斑点杂交(Dot-blot)和定性PCR方法，但由于Dot-blot的低敏感性，定性PCR的假阳性及电泳产物染色剂溴乙锭的毒性作用而限制了在临床方面的应用，而且以上两种方法无法给出临床所需要的定量结果。近年来荧光定量技术在临床上有了较普遍的应用，但目前还没有统一的技术标准 [1] 。本文应用常规定性PCR和Amplisensor荧光定量技术检测了309例临床血清标本，并探讨其应用价值，报告如下。
1 材料与方法
1.1 研究对象 309例病人为2001年1月～2003年5月来本室门诊部应诊的患者，应用酶联免疫吸附(ELISA)法排除甲型、丙型和戊型肝炎。对性别年龄无特殊要求。
, 百拇医药
1.2 仪器 使用美国Biotronics公司AG-9600Minilizer。
1.3 ELISA 试剂由潍坊3V公司提供。
1.4 定性PCR 引物序列为:P1(1679F):5′-GGG TGG AGC CCT CAG GCT CAG GGC A-3′，P2(2254R):5′-GAA GAT GAG GCA TAG CAG GAT-3′，由美国Scripps研究所合成。Taq酶购自华美生物工程公司。样品提取及循环扩增方法见文献 [2] 。
1.5 Amplisensor荧光定量分析 不对称扩增引物为P15′-TGC TCG TGT TAC AGG CGG GGT-3′，P25′-GAG GCA TAG CAG CAG GAT GAA GAG-3′，由美国Biotronics公司提供，扩增产物为241bp。荧光信号引物为:5′-TCG CTG GAA GTG TCT GCG GCG T-3′。检测方法为:(1)血清标本HBV-DNA提取:取患者血清100μl，与200μl的STG Buffer混合，80℃温育10min，冷却至室温后，加300μl预冷(4℃)的异戊醇，-30℃放置30min后，15000转/min离心10min，去上清，加100μl KW Buffer洗一次，15000转/min离心5min，彻底去上清后风干，用50μl样品稀释液再溶解备用。(2)制备模板HBV-DNA标准:用稀释液按10倍比例稀释HBV-DNA标准，制备成1×10 8 ，1×10 7 ，1×10 6 ，1×10 5 ，1×10 4 ，1×10 3 拷贝数/ml(cps/ml)的标准系列。(3)不对称扩增:于10μl的不对称扩增反应液中加入5μl提取的样品液，并设一阴性对照孔，一峰值孔，六个标准孔。90℃预变性1min后，按94℃35s，60℃35s，72℃40s，循环20次，测定基础荧光读数。以后每2次循环测定一次荧光值。当最后一个标准出现荧光信号衰减后即可终止反应。所有荧光信号衰减数据均用ASAP软件分析，<1×103 cps/ml者判为阴性。
, 百拇医药
1.6 统计学方法 卡方检验。因计量资料为非正态分布，故做对数变换后采用方差分析。阴性结果不参与统计。
2 结果
2.1 不同标志物类型患者定性PCR和Amplisensor分析结 果 见表1。
2.2 不同标志物类型患者HBV-DNA量的分布 人为将HBV-DNA的量分成<10 3 ，10 3 ～104 ，10 5 ～10 6 ，10 7 ～10 8 ，>10 9 组(单位:cps/ml)，并计算各组百分率，以方便观察分布状态。HBsAg、HBeAg、HBcAb阳性组患者HBV-DNA量多在10 7 ～10 8 cps/ml，占71.33%。HBsAg、HBeAb、HBcAb阳性组和HBsAg、HBcAb阳性组患者(HBV-NDA阳性患者)血清中的HBV-DNA量多在10 3 ～10 6 cps/ml之间，分别占50.00%和46.76%。见表2。
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表1 309例患者定性PCR、ELISA和Amplisensor定量分析结果略
表2 不同标志物类型患者HBV-DNA量的分布 (略)
3 讨论
由表1可见，乙型肝炎患者血清内HBV-DNA的负荷量与乙型肝炎病毒标志物模式有关。在HBsAg、HBeAg、HBcAb阳性组，Amplisensor方法的检出率高达98.67%，此组有71.33%的患者血清内HBV-DNA含量在10 7 ～10 8 cps/ml之间，其定量结果对数值为4.94±1.04，显著高于其他两组(P<0.01)。虽然本组定性PCR和Amplisensor两种方法的检出率无统计学意义(P>0.05)，但在HBsAg、HBeAb、HBcAb阳性组和HBsAg、HBcAb阳性组，Amplisensor方法的检出阳性率分别显著高于定性PCR方法(P<0.01)，提示使用Amplisensor方法可提高HBV-DNA检出的敏感性。HBsAg、HBeAb、HBcAb阳性组和HBsAg、HBcAb阳性组患者血清内HBV-DNA含量在10 4～10 8 cps/ml之间不等，其均数标准差很大，不但证实了HBeAg阴性患者可存在高水平的HBV-DNA复制，而且提示病毒的复制程度还与患者个体状态有关。有报道认为高病毒负荷量的HBeAg阴性患者多与HBV-DNA前C区基因变异有关 [3] ，尤其是HBV-DNA前C区1896位点的G●A突变，使编码色氨酸的密码子TGG突变为终止密码子TAG，阻断了HBeAg的合成。位于X读码区的C启动子也可发生突变，致使HBeAg合成分泌减少，但病毒复制仍很活跃 [4] 。应用Amplisensor 定量分析技术可动态检测患者血清中病毒的量的变化，从而为诊断和治疗提供客观依据。
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Amplisensor定量分析技术的原理已有很多报道阐明 [5，6] ，其关键部分是在反应中使用了不对称引物和荧光信号引物，两条不同浓度的引物可使第一轮的扩增产生过多的一条链。荧光信号引物则是一条稳定的短双链结构，其中一条链可做为引物引导DNA新链的合成。当这条链参与合成反应成为新DNA链的一部分时，原有的稳定结构被破坏，双链打开，两条链间的能量传递途径被破坏，荧光信号就会消失。比较样本孔荧光信号衰减程度和已知浓度的标准孔荧光信号衰减程度，经专用ASAP软件分析可方便得出初始模板DNA的含量。由于使用具有稳定双链结构的荧光信号引物做为内探针，因而提高了Amplisensor方法的特异性，同时因采用闭管检测，不需电泳处理，又能减少交叉污染的可能性。因其主要优点是从病毒数量的变化上反映病毒复制状态，所以在临床诊断、药物筛选治疗及预后判断等方面有越来越高的应用价值。
参考文献
1 王豪，陶其敏，吴娟，等.两种乙型肝炎病毒DNA定量检测方法的比较与评价.中华检验医学杂志，2002，(25)5:318-320.
, 百拇医药
2 汲振余，赵翠林，孙爱民，等.聚合酶链反应结合斑点杂交测定乙型肝炎病毒NDA的评价.中国卫生检验杂志，2000，10(1):13-15.
3 Loriot MA，Marcellin P，Bismuth E，et al.Demonstration of hepatitis B virus DNA by polymerase chain reaction in the serum and the liver after spontaneous or therapeutically induced HBeAg to anti-HBe or HBsAg to anti-HBs seroconversion in patients with chronic hepatitis B.Hepaˉtology，1992，15(1):32-36.
4 Chan HLY，Hussain M，Lok ASF.Different hepatitis B virus genotypesare associated with different mutation in the core promoter and precore regions during hepatitis B e antigen seroconversion.Hepatology，1999，29(3):976-984.
5 韩俊英，曾瑞萍.荧光定量PCR技术及其应用.国外医学遗传学分册，2000，23(3):117-120.
6 张复春，吴婉芬，董惠卿，等.定量聚合酶链反应检测血清中的HBV-DNA及其临床应用.中华传染病杂志，1997，15(1):24-27.
作者单位:450052河南郑州大学医学院省医学科学研究所
(编辑 曲全), 百拇医药