甘桔汤总皂苷抗炎作用研究
【摘要】 目的 探讨甘桔汤总皂苷在抗炎方面具有的作用及其作用特点。方法 采用多种非特异性炎症模型对甘桔汤总皂苷抗炎作用进行评价。结果 甘桔汤总皂苷对多种急性炎症作用明显，但对慢性炎症作用却并不突出。结论 甘桔汤总皂苷是甘桔汤宣肺利咽的主要物质基础，其抗炎作用是肯定的。
关键词 甘桔汤总皂苷 炎症 急性炎症模型 慢性炎症模型
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2004)06-0775-04
Study on anti-inflammatory effect of ganjietang total saponins
Qi Yun，Shen Yingjun，Wang Wenkui，et al.
Department of Pharmacology，Institute of Medical Plant Development，CAMS andPUMC，Beijing100094.
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To study the effect and characteristic of Ganjietang total saponins(simply called as GJTTS)on the anti-inflammation.Methods Using several types non-specific inflammation models，we focused on the anti-inflammation effect of GJTTS.Results The experiment results indicate that the GJTTS could obviously inˉhibit oedema and infiltration of acute inflammation models.But it hasn’t obvious anti-inflammation effect on chronic inflammation models.Conclusion GJTTS is main substances in Ganjietang that have effect on Xuanfeiliyan，its anti-inflammation effect is obvious.
, http://www.100md.com
Key words ganjietang total saponins(GJTTS) inflammation acute inflammationmodel chronic inflammaˉtion model
甘桔汤原名桔梗汤，出于汉代张仲景《伤寒论》，主要用于治疗少阴咽痛。该方后世多称甘桔汤，为中医临床治疗咽喉肿痛的祖剂，后代以此为基础方加味化裁的方剂不胜枚举。而从现代医学的角度审视，咽喉肿痛多与咽喉部急慢性炎症有直接关系，作为中医治疗咽喉肿痛的祖剂，该方是否具有抗炎的药理作用，是中医临床关心的问题之一。尽管作为单味药的甘草和桔梗，其药理研究的报道不少，且发现甘草桔梗均有较明显的抗炎作用，但对甘桔汤的药理药化研究却不多，涉及全方有关抗炎作用的研究尚未见报道，为阐明甘桔汤宣肺利咽的现代药理作用及其发挥作用的主要物质基础，我们对该方的总皂苷进行了较为全面的抗炎作用进行了观察。
1 材料
, http://www.100md.com
1.1 实验药物 甘草(Glycyrrhiza inflata Bat.)及桔梗(Playˉcldon grandiflorum(Jacq)A.DC.)均购自成都市荷花池中药材市场，按甘草桔梗1:2比例混合，温水浸泡30min，水煎煮3次，每次2h，合并水提液，纱布初滤后，离心(2000rpm，5min)，上清液加入已预处理的D 101 大孔吸附树脂，以蒸馏水洗至流出液近无色，再以80%乙醇洗脱至无皂苷反应，收集乙醇洗脱液，减压回收，水浴挥干，置60℃～80℃烘箱干燥至恒重，得甘桔汤总皂苷(GJTTS)(其中，桔梗皂苷按1995版《药典》薄层色谱法作定性检测，甘草酸含量用HPLC法作定量检测，结果总皂苷中甘草酸含量为33.98%)。临用时用生理盐水配制成所需浓度。
1.2 动物 昆明种雄性小鼠，体重18～22g或23～25g，SD雄性大鼠，体重160～200g，国家医药管理局四川抗生素工业研究所提供，动物合格号为川实动物管第83号。
, 百拇医药 1.3 试剂 角叉菜胶为Sigma公司产品，磷酸组织胺，中国科学院上海生物化学研究所，依文思蓝，Fluka进口分装。总蛋白测定药盒，元生生物科技股份有限公司。其他试剂为国产分析纯。
2 方法与结果
2.1 对角叉菜胶致小鼠足肿胀的影响 [1] 雄性小鼠按体重随机分为5组(分组见表1)，每组动物连续灌胃给药5天，正常对照组给予相同体积的生理盐水。末次给药后30min，在每小鼠在后足跖皮下注射1%角叉菜胶(1%角叉菜胶、99.0%生理盐水)0.03ml，4h后沿踝关节上的观察致炎前后标记线剪下左右后足，以左右足重量差为足肿胀度，结果见表1。
表1 甘桔汤总皂苷对角叉菜胶致小鼠足肿胀的影响
注:与对照组比较， ˇ P<0.05， ˇˇ P<0.01，以下同
, 百拇医药
2.2 对组织胺所致小鼠足肿胀的影响(容积法) [2] 雄性小鼠按体重随机分为5组(分组见表2)，每组动物连续灌胃给药5天，正常对照组给予相同体积的生理盐水。试验前在各鼠左后足处作标记，用小鼠容积测定仪测定各鼠足容积两次，取平均值作为各鼠给药前正常足容积。末次给药后30min在每小鼠左后足跖皮下注射0.2%磷酸组织胺0.03ml，于致炎后30、60、90、120min测定各鼠左后肢足跖容积，观察致炎前后小鼠足容积变化值，以足肿胀度(致炎前后肿足体积差值)表示药物的抗炎效果。结果见表2。
2.3 对蛋清致大鼠足肿胀的影响(容积法) [2] 雄性Wistar大鼠按体重随机分为5组(分组见表3)，每组动物连续灌 胃给药2次，正常对照组给予相同体积的蒸馏水。未次给药(试验第二天)前在各鼠左后足处作标记，用大鼠容积测定仪测定各鼠足容积两次，取平均值作为各鼠给药前正常足容积。每组大鼠灌胃给药，各组给药后30min于动物左后足跖皮下注射10%新鲜鸡蛋清溶液(10%蛋清、90%生理盐水)0.1ml，分别于致炎后30、60、120、180、240和300min测定各鼠左后肢足容积，观察致炎前后大鼠足容积变化值，以足肿胀度(致炎前后肿足体积差值)表示药物的抗炎效果。结果见表3。
, 百拇医药
表2 甘桔汤总皂苷对组织胺致小鼠足肿胀的影响
表3 甘桔汤总皂苷对蛋清致大鼠足肿胀的影响
2.4 对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响 [2] 雄性小鼠按体重随机分为5组(分组见表4)，除地塞米松腹腔注射给药外，其余各组动物连续灌胃给药3天，正常对照组给予相同体积的生理盐水。末次给药后60min将30μl二甲苯涂于小鼠左耳廓两面致炎，右耳不涂为对照，致炎后45min处死小鼠，用直径8mm的打孔器在两耳对称位置取下左右耳片称重，以左右耳片重量差作为耳肿胀度，计算肿胀抑制百分率。结果见表4。
表4 甘桔汤总皂苷对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响
2.5 对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响 [3] 雄性小鼠按体重随机分为5组(分组见表5)，每组动物连续灌胃给药3天，正常对照组给予相同体积的生理盐水。末次给药后1h，各鼠尾静脉注射2%依文思蓝溶液(NS配制)0.1ml/10g体重，同时腹腔注射0.6%醋酸溶液0.2ml/只，20min后处死小鼠，用6ml生理盐水注入腹腔，收集冲洗液，3000rpm15min，取上清液于723分光光度计590nm处比色，以吸光度(OD)值判断小鼠腹腔毛细血管的通透性。结果见表5。
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表5 甘桔汤总皂苷对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响
2.6 对小鼠皮肤毛细血管通透性的影响 [3] 雄性小鼠按体重随机分为5组(分组见表6)，每组动物连续灌胃给药3天，正常对照组给予相同体积的生理盐水。末次给药后1h，各鼠尾静脉注射1%依文思蓝溶液(NS配制)0.1ml/10g体重，随即于小鼠腹部正中部位脱毛区滴二甲苯40μl，20min后小鼠脱颈椎致死，剥下腹部蓝染皮肤，用直径1.2cm打孔器取下等面积蓝染皮肤，剪碎放入盛有4ml丙酮-硫酸钠提取液的具塞玻璃试管内，置暗处放置，每日轻摇2～3次，3日后3000rpm15min，取上清液于723分光光度计590nm处比色，以吸光度(OD)值判断小鼠腹腔毛细血管的通透性。结果见表6。
表6 甘桔汤总皂苷对小鼠皮肤毛细血管通透性的影响
2.7 对角叉菜胶致大鼠急性胸膜炎模型 [4] 胸腔渗出液量、 蛋白渗出量、WBC数和分类及胸膜组织形态的影响 取健康雄性大鼠38只，按体重随机分为5组分(分组见表7)，每组动物连续给药7天，正常组及模型组给予等体积生理盐水，于未次给药30min后，模型组及各给药组动物分别用乙醚轻度麻醉后，向右胸膜腔内注入1%角叉菜胶0.2ml/100g体重，正常对照组注入等体积生理盐水，致炎后4h各组动物灌胃给予相应药物或生理盐水。8h后断头处死，用吸管将胸膜腔内全部渗出液吸出，再以无钙镁Hank液2ml冲洗胸腔，冲洗液与渗出液合并，作白细胞计数及分类，然后将渗出液离心，取0.5ml上清液按总蛋白药盒说明书方法对蛋白进行定量测定，结果见表7，8。
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表7 甘桔汤总皂苷对角叉菜胶致大鼠胸膜炎模型胸腔渗出液量、蛋白渗出量的影响
表8 甘桔汤总皂苷对角叉菜胶致大鼠胸膜炎模型胸腔渗出液中WBC计数及分类的影响
2.8 对慢性炎症(棉球肉芽肿法)的影响 [2] 取健康雄性昆明种小鼠50只，按体重随机分为5组分(分组见表9)，分组给药前无菌条件下手术植高压灭菌棉球经庆大霉素液浸润)(10±1)mg，于小鼠右侧腋下皮下，每组动物连续给药7天，正常组给予等体积生理盐水，第8天处死小鼠，将锦球连同周围结缔组织一起取出，剔除脂肪组织，放入烘箱中60℃烘干，称重，将称得重量减去棉球原重即得肉芽肿重量。
表9 甘桔汤总皂苷对小鼠慢性炎症模型(棉球肉芽肿法)的影响
3 讨论
甘桔汤有着悠久的应用历史，自张仲景《伤寒论》以之治疗“少阴咽痛”以来，该方成为治疗咽喉肿痛的祖剂，后世以此方为基础进行加味化裁的处方不胜枚举。但该方为何能成为治疗咽喉肿痛的祖剂，其物质基础何在?笔者在预实验的基础上，对该复方有效部位(总皂苷)抗炎作用进行了较为全面的研究，结果表明甘桔汤总皂苷对多种急性非特异性炎症有明显抗炎作用，这应当说是甘桔汤治疗咽喉肿痛的药理学基础之一。本实验的剂量确定有两方面的依据:一是根据预实验的结果，另一方面，主要是根据《丹溪心法》(卷4)甘桔汤(桔梗二两，甘草一两)为标准用量，实验中大剂量相当于人用量的10倍，按0.6等比递减来进行的剂量设计。我们认为，对祖剂的研究，其用量应高于在其化裁方中的用量(按化裁方中甘桔常用量桔梗9g，甘草3g进行实验，其抗炎作用并不明显)。但从另一方看，也说明祖剂之所以成为祖剂，既有其肯定的临床疗效，但同时又有成为加味方的必然性:从实验研究结果进行分析，我们认为以下两方面原因是很可能的:(1)通过加入其它药物来增强疗效，减少单味药用量，从而使方剂更安全有效;(2)虽然甘桔汤总皂苷虽然对多种急性炎症作用明显，但对慢性炎症作用并不突出(经重复实验，作用确不明显)，而通过配伍，可使方剂作用更为全面。当然，这还有待实验的验证。此外，甘桔汤总皂苷抗炎作用是通过哪些环节发挥的作用，其机制何在，这将是下一步研究的着眼点。
, 百拇医药
参考文献
1 周重楚，孔晓波.α-菠菜甾醇的抗炎作用.药学学报，1985，20 (4):275.
2 徐淑云，卞如廉，陈修.药理实验方法学.北京:人民卫生出版社，1994，714-719.
3 陈奇.中药药理研究方法学.北京:人民卫生出版社，1993，303-305.
4 何华美，李新芳.粉防己碱对炎症白细胞磷脂酶A2的作用其机理探讨.中国药理学通报，1995，11(1):53.
作者单位:100094北京中国医学科学院，中国协和医科大学药用植物研究所药理室
成都中医药大学
山西农业大学
(收稿日期:2004-03-08)
(编辑秋 实), http://www.100md.com
关键词 甘桔汤总皂苷 炎症 急性炎症模型 慢性炎症模型
【文献标识码】 A 【文章编号】 1726-7587(2004)06-0775-04
Study on anti-inflammatory effect of ganjietang total saponins
Qi Yun，Shen Yingjun，Wang Wenkui，et al.
Department of Pharmacology，Institute of Medical Plant Development，CAMS andPUMC，Beijing100094.
, 百拇医药
【Abstract】 Objective To study the effect and characteristic of Ganjietang total saponins(simply called as GJTTS)on the anti-inflammation.Methods Using several types non-specific inflammation models，we focused on the anti-inflammation effect of GJTTS.Results The experiment results indicate that the GJTTS could obviously inˉhibit oedema and infiltration of acute inflammation models.But it hasn’t obvious anti-inflammation effect on chronic inflammation models.Conclusion GJTTS is main substances in Ganjietang that have effect on Xuanfeiliyan，its anti-inflammation effect is obvious.
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Key words ganjietang total saponins(GJTTS) inflammation acute inflammationmodel chronic inflammaˉtion model
甘桔汤原名桔梗汤，出于汉代张仲景《伤寒论》，主要用于治疗少阴咽痛。该方后世多称甘桔汤，为中医临床治疗咽喉肿痛的祖剂，后代以此为基础方加味化裁的方剂不胜枚举。而从现代医学的角度审视，咽喉肿痛多与咽喉部急慢性炎症有直接关系，作为中医治疗咽喉肿痛的祖剂，该方是否具有抗炎的药理作用，是中医临床关心的问题之一。尽管作为单味药的甘草和桔梗，其药理研究的报道不少，且发现甘草桔梗均有较明显的抗炎作用，但对甘桔汤的药理药化研究却不多，涉及全方有关抗炎作用的研究尚未见报道，为阐明甘桔汤宣肺利咽的现代药理作用及其发挥作用的主要物质基础，我们对该方的总皂苷进行了较为全面的抗炎作用进行了观察。
1 材料
, http://www.100md.com
1.1 实验药物 甘草(Glycyrrhiza inflata Bat.)及桔梗(Playˉcldon grandiflorum(Jacq)A.DC.)均购自成都市荷花池中药材市场，按甘草桔梗1:2比例混合，温水浸泡30min，水煎煮3次，每次2h，合并水提液，纱布初滤后，离心(2000rpm，5min)，上清液加入已预处理的D 101 大孔吸附树脂，以蒸馏水洗至流出液近无色，再以80%乙醇洗脱至无皂苷反应，收集乙醇洗脱液，减压回收，水浴挥干，置60℃～80℃烘箱干燥至恒重，得甘桔汤总皂苷(GJTTS)(其中，桔梗皂苷按1995版《药典》薄层色谱法作定性检测，甘草酸含量用HPLC法作定量检测，结果总皂苷中甘草酸含量为33.98%)。临用时用生理盐水配制成所需浓度。
1.2 动物 昆明种雄性小鼠，体重18～22g或23～25g，SD雄性大鼠，体重160～200g，国家医药管理局四川抗生素工业研究所提供，动物合格号为川实动物管第83号。
, 百拇医药 1.3 试剂 角叉菜胶为Sigma公司产品，磷酸组织胺，中国科学院上海生物化学研究所，依文思蓝，Fluka进口分装。总蛋白测定药盒，元生生物科技股份有限公司。其他试剂为国产分析纯。
2 方法与结果
2.1 对角叉菜胶致小鼠足肿胀的影响 [1] 雄性小鼠按体重随机分为5组(分组见表1)，每组动物连续灌胃给药5天，正常对照组给予相同体积的生理盐水。末次给药后30min，在每小鼠在后足跖皮下注射1%角叉菜胶(1%角叉菜胶、99.0%生理盐水)0.03ml，4h后沿踝关节上的观察致炎前后标记线剪下左右后足，以左右足重量差为足肿胀度，结果见表1。
表1 甘桔汤总皂苷对角叉菜胶致小鼠足肿胀的影响
注:与对照组比较， ˇ P<0.05， ˇˇ P<0.01，以下同
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2.2 对组织胺所致小鼠足肿胀的影响(容积法) [2] 雄性小鼠按体重随机分为5组(分组见表2)，每组动物连续灌胃给药5天，正常对照组给予相同体积的生理盐水。试验前在各鼠左后足处作标记，用小鼠容积测定仪测定各鼠足容积两次，取平均值作为各鼠给药前正常足容积。末次给药后30min在每小鼠左后足跖皮下注射0.2%磷酸组织胺0.03ml，于致炎后30、60、90、120min测定各鼠左后肢足跖容积，观察致炎前后小鼠足容积变化值，以足肿胀度(致炎前后肿足体积差值)表示药物的抗炎效果。结果见表2。
2.3 对蛋清致大鼠足肿胀的影响(容积法) [2] 雄性Wistar大鼠按体重随机分为5组(分组见表3)，每组动物连续灌 胃给药2次，正常对照组给予相同体积的蒸馏水。未次给药(试验第二天)前在各鼠左后足处作标记，用大鼠容积测定仪测定各鼠足容积两次，取平均值作为各鼠给药前正常足容积。每组大鼠灌胃给药，各组给药后30min于动物左后足跖皮下注射10%新鲜鸡蛋清溶液(10%蛋清、90%生理盐水)0.1ml，分别于致炎后30、60、120、180、240和300min测定各鼠左后肢足容积，观察致炎前后大鼠足容积变化值，以足肿胀度(致炎前后肿足体积差值)表示药物的抗炎效果。结果见表3。
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表2 甘桔汤总皂苷对组织胺致小鼠足肿胀的影响
表3 甘桔汤总皂苷对蛋清致大鼠足肿胀的影响
2.4 对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响 [2] 雄性小鼠按体重随机分为5组(分组见表4)，除地塞米松腹腔注射给药外，其余各组动物连续灌胃给药3天，正常对照组给予相同体积的生理盐水。末次给药后60min将30μl二甲苯涂于小鼠左耳廓两面致炎，右耳不涂为对照，致炎后45min处死小鼠，用直径8mm的打孔器在两耳对称位置取下左右耳片称重，以左右耳片重量差作为耳肿胀度，计算肿胀抑制百分率。结果见表4。
表4 甘桔汤总皂苷对二甲苯致小鼠耳廓肿胀的影响
2.5 对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响 [3] 雄性小鼠按体重随机分为5组(分组见表5)，每组动物连续灌胃给药3天，正常对照组给予相同体积的生理盐水。末次给药后1h，各鼠尾静脉注射2%依文思蓝溶液(NS配制)0.1ml/10g体重，同时腹腔注射0.6%醋酸溶液0.2ml/只，20min后处死小鼠，用6ml生理盐水注入腹腔，收集冲洗液，3000rpm15min，取上清液于723分光光度计590nm处比色，以吸光度(OD)值判断小鼠腹腔毛细血管的通透性。结果见表5。
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表5 甘桔汤总皂苷对小鼠腹腔毛细血管通透性的影响
2.6 对小鼠皮肤毛细血管通透性的影响 [3] 雄性小鼠按体重随机分为5组(分组见表6)，每组动物连续灌胃给药3天，正常对照组给予相同体积的生理盐水。末次给药后1h，各鼠尾静脉注射1%依文思蓝溶液(NS配制)0.1ml/10g体重，随即于小鼠腹部正中部位脱毛区滴二甲苯40μl，20min后小鼠脱颈椎致死，剥下腹部蓝染皮肤，用直径1.2cm打孔器取下等面积蓝染皮肤，剪碎放入盛有4ml丙酮-硫酸钠提取液的具塞玻璃试管内，置暗处放置，每日轻摇2～3次，3日后3000rpm15min，取上清液于723分光光度计590nm处比色，以吸光度(OD)值判断小鼠腹腔毛细血管的通透性。结果见表6。
表6 甘桔汤总皂苷对小鼠皮肤毛细血管通透性的影响
2.7 对角叉菜胶致大鼠急性胸膜炎模型 [4] 胸腔渗出液量、 蛋白渗出量、WBC数和分类及胸膜组织形态的影响 取健康雄性大鼠38只，按体重随机分为5组分(分组见表7)，每组动物连续给药7天，正常组及模型组给予等体积生理盐水，于未次给药30min后，模型组及各给药组动物分别用乙醚轻度麻醉后，向右胸膜腔内注入1%角叉菜胶0.2ml/100g体重，正常对照组注入等体积生理盐水，致炎后4h各组动物灌胃给予相应药物或生理盐水。8h后断头处死，用吸管将胸膜腔内全部渗出液吸出，再以无钙镁Hank液2ml冲洗胸腔，冲洗液与渗出液合并，作白细胞计数及分类，然后将渗出液离心，取0.5ml上清液按总蛋白药盒说明书方法对蛋白进行定量测定，结果见表7，8。
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表7 甘桔汤总皂苷对角叉菜胶致大鼠胸膜炎模型胸腔渗出液量、蛋白渗出量的影响
表8 甘桔汤总皂苷对角叉菜胶致大鼠胸膜炎模型胸腔渗出液中WBC计数及分类的影响
2.8 对慢性炎症(棉球肉芽肿法)的影响 [2] 取健康雄性昆明种小鼠50只，按体重随机分为5组分(分组见表9)，分组给药前无菌条件下手术植高压灭菌棉球经庆大霉素液浸润)(10±1)mg，于小鼠右侧腋下皮下，每组动物连续给药7天，正常组给予等体积生理盐水，第8天处死小鼠，将锦球连同周围结缔组织一起取出，剔除脂肪组织，放入烘箱中60℃烘干，称重，将称得重量减去棉球原重即得肉芽肿重量。
表9 甘桔汤总皂苷对小鼠慢性炎症模型(棉球肉芽肿法)的影响
3 讨论
甘桔汤有着悠久的应用历史，自张仲景《伤寒论》以之治疗“少阴咽痛”以来，该方成为治疗咽喉肿痛的祖剂，后世以此方为基础进行加味化裁的处方不胜枚举。但该方为何能成为治疗咽喉肿痛的祖剂，其物质基础何在?笔者在预实验的基础上，对该复方有效部位(总皂苷)抗炎作用进行了较为全面的研究，结果表明甘桔汤总皂苷对多种急性非特异性炎症有明显抗炎作用，这应当说是甘桔汤治疗咽喉肿痛的药理学基础之一。本实验的剂量确定有两方面的依据:一是根据预实验的结果，另一方面，主要是根据《丹溪心法》(卷4)甘桔汤(桔梗二两，甘草一两)为标准用量，实验中大剂量相当于人用量的10倍，按0.6等比递减来进行的剂量设计。我们认为，对祖剂的研究，其用量应高于在其化裁方中的用量(按化裁方中甘桔常用量桔梗9g，甘草3g进行实验，其抗炎作用并不明显)。但从另一方看，也说明祖剂之所以成为祖剂，既有其肯定的临床疗效，但同时又有成为加味方的必然性:从实验研究结果进行分析，我们认为以下两方面原因是很可能的:(1)通过加入其它药物来增强疗效，减少单味药用量，从而使方剂更安全有效;(2)虽然甘桔汤总皂苷虽然对多种急性炎症作用明显，但对慢性炎症作用并不突出(经重复实验，作用确不明显)，而通过配伍，可使方剂作用更为全面。当然，这还有待实验的验证。此外，甘桔汤总皂苷抗炎作用是通过哪些环节发挥的作用，其机制何在，这将是下一步研究的着眼点。
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参考文献
1 周重楚，孔晓波.α-菠菜甾醇的抗炎作用.药学学报，1985，20 (4):275.
2 徐淑云，卞如廉，陈修.药理实验方法学.北京:人民卫生出版社，1994，714-719.
3 陈奇.中药药理研究方法学.北京:人民卫生出版社，1993，303-305.
4 何华美，李新芳.粉防己碱对炎症白细胞磷脂酶A2的作用其机理探讨.中国药理学通报，1995，11(1):53.
作者单位:100094北京中国医学科学院，中国协和医科大学药用植物研究所药理室
成都中医药大学
山西农业大学
(收稿日期:2004-03-08)
(编辑秋 实), http://www.100md.com